本發(fā)明涉及器官保存液，更詳細(xì)而言，涉及配合有l(wèi)-抗壞血酸和l-抗壞血酸磷酸酯而成的器官保存液。

背景技術(shù)：

器官保存液作為器官移植時(shí)用于對(duì)已切除的器官進(jìn)行灌注并浸漬的液體是已知的。若長(zhǎng)時(shí)間中斷血流，則生物體內(nèi)的器官陷入壞死，因此，盡管已開發(fā)出了用于長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)送為移植而摘取的器官的各種方法，但其中臨床上應(yīng)用最多的是單純冷卻法。該單純冷卻法中主要使用的是器官保存液。對(duì)于已摘取的器官而言，通過利用器官保存液進(jìn)行灌注，并在摘取后利用相同的已冷卻的器官保存液進(jìn)行浸漬，從而預(yù)防壞死。

目前在器官移植的臨床實(shí)踐中通常使用的器官保存液是威斯康星大學(xué)液(universityofwisconsin：uw液/腎臟·肝臟·胰臟等)、euro-collins液(euro-collins：ec液/腎臟)、celsior(注冊(cè)商標(biāo)/心臟)、lactateringer液(肺)、組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液(histidine-tryptophan-ketoglutarate：htk液/肝臟·心臟·胰臟·腎臟·小腸)、et-kyoto液等。除了作為緩沖液發(fā)揮作用以外，還設(shè)法為了防止因冰凍而導(dǎo)致的細(xì)胞膨脹而添加糖、或者添加抗氧化劑，由此防止缺血再灌注損傷的發(fā)生等。

此處所謂缺血再灌注損傷，是指對(duì)處于缺血狀態(tài)的器官、組織進(jìn)行血液再灌注時(shí)，在該器官·組織內(nèi)的微小循環(huán)中導(dǎo)致各種毒性物質(zhì)產(chǎn)生從而引起的損傷，多見于器官移植后。作為引起損傷的機(jī)制，認(rèn)為是下述機(jī)制：由超氧化物(o2^-)、羥基自由基(ho·)等活性氧、一氧化氮(no)等自由基的產(chǎn)生而導(dǎo)致的損傷；由各種細(xì)胞因子、內(nèi)皮素、花生四烯酸等各種化學(xué)介質(zhì)的產(chǎn)生而導(dǎo)致的損傷；基于活化中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用的損傷等。

抗壞血酸是強(qiáng)抗氧化劑，因此，認(rèn)為其在用于除去活性氧中是有用的，該活性氧產(chǎn)生于缺血再灌注損傷時(shí)，是損傷移植器官的原因之一。但是，由于抗壞血酸因自動(dòng)氧化而迅速消失(例如，參見非專利文獻(xiàn)1)，因而無(wú)法作為器官保存液的組成成分使用，已有在體外(invitro)添加被稱為抗壞血酸2-葡糖苷的穩(wěn)定型抗壞血酸(其中通過與葡萄糖的鍵合而將與氧化還原反應(yīng)相關(guān)的部位掩蔽)的研究(例如，參見非專利文獻(xiàn)2)。需要說明的是，抗壞血酸2-葡糖苷在沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)是不具有效果的前體藥物，實(shí)際用于保存摘取器官時(shí)，未必能夠獲得保存器官的效果。

另一方面，雖然報(bào)道了通過向培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中以特定的濃度比添加抗壞血酸和抗壞血酸磷酸酯，能夠使抗壞血酸穩(wěn)定地存在(例如，參見非專利文獻(xiàn)3)，但該結(jié)果只不過是顯示出在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)抗壞血酸穩(wěn)定地存在，其并未體現(xiàn)摘取出的器官能否長(zhǎng)期保持其功能。

另外，含有半胱氨酸(例如，參見非專利文獻(xiàn)4及5)的器官保存液、含有甘氨酸(例如，參見非專利文獻(xiàn)6及7)的器官保存液、在日本較頻繁使用的含有海藻糖的器官保存液et-kyoto(例如，非專利文獻(xiàn)8)中進(jìn)一步含有蛋白酶抑制劑的m-kyoto是已知的。

作為其他器官保存液，已知有含有特定的類黃酮糖苷的器官保存液(專利文獻(xiàn)1)，含有肝細(xì)胞增殖因子(hgf)的器官保存用溶液(專利文獻(xiàn)2)，含有卵磷脂化超氧化物歧化酶的器官保存液(專利文獻(xiàn)3)，以高含量含有硫酸鹽、以低含量含有氯的器官保存用溶液(專利文獻(xiàn)4)，含有平均分子量為50萬(wàn)～65萬(wàn)的羥乙基淀粉、且鉀離子與鈉離子的摩爾比為0.4～0.8、ph值為7.1～7.5、滲透壓為280～330mosm/l、粘度為1.8～2.5cp的器官保存液(專利文獻(xiàn)5)、含有d-阿洛糖等稀有糖的保存液(專利文獻(xiàn)6)等。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開2009-221128

專利文獻(xiàn)2：日本特開2005-306749

專利文獻(xiàn)3：日本特開2002-60301

專利文獻(xiàn)4：日本特開平10-245301

專利文獻(xiàn)5：日本特開平9-328401

專利文獻(xiàn)6：wo2005/115141

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：freeradicrescommun.1986；1(6):349-53.

非專利文獻(xiàn)2：celltransplant.2003；12(6):599-606.i

非專利文獻(xiàn)3：invitrocell.dev.biol.--animal37:26-30,january2001

非專利文獻(xiàn)4：transplantproc.2011oct；43(8):2897-9

非專利文獻(xiàn)5：jheartlungtransplant.2005sep；24(9):1369-77.

非專利文獻(xiàn)6：transplantation.2003mar15；75(5):591-8.

非專利文獻(xiàn)7：transplint.1994may；7(3):195-200

非專利文獻(xiàn)8：yonseimedj.2004dec31；45(6):1107-14.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

本發(fā)明的課題在于提供能夠有效地防止由總?cè)毖獣r(shí)間的延長(zhǎng)而導(dǎo)致的缺血再灌注損傷的發(fā)生的器官保存液。

用于解決課題的手段

本申請(qǐng)的發(fā)明人針對(duì)上文所述的以往提案的器官保存液中添加的各成分對(duì)其組合等進(jìn)行了反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)除了l-抗壞血酸及l(fā)-抗壞血酸磷酸酯以外還配合有磷酸氫二鈉及磷酸二氫鈉、以及氯化鉀和d-葡萄糖、進(jìn)一步還配合有甘氨酸、l-半胱氨酸、鐵化合物而得到的器官保存液在防止發(fā)生缺血再灌注損傷方面比目前使用的器官保存液優(yōu)異，從而完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明涉及下述各項(xiàng)限定的技術(shù)方案。

(1)一種器官保存液，其含有氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯、及d-葡萄糖的配合物。

(2)如上述(1)所述的器官保存液，其特征在于，配合物還含有甘氨酸。

(3)如上述(2)所述的器官保存液，其特征在于，配合物還含有l(wèi)-半胱氨酸。

(4)如上述(3)所述的器官保存液，其特征在于，配合物還含有鐵化合物。

(5)如上述(1)～(4)中任一項(xiàng)所述的器官保存液，其特征在于，配合物中的l-抗壞血酸濃度為0.2～0.3mm，l-抗壞血酸磷酸酯濃度為0.4～0.5mm。

(6)如上述(1)～(5)中任一項(xiàng)所述的器官保存液，其特征在于，配合物中的磷酸氫二鈉濃度為35～50mm，磷酸二氫鈉濃度為12～18mm。

(7)如上述(1)～(6)中任一項(xiàng)所述的器官保存液，其特征在于，其中配合有d-葡萄糖，至滲透壓為326～363mosm/kg。

(8)如上述(2)～(7)中任一項(xiàng)所述的器官保存液，其特征在于，配合物中的甘氨酸濃度為5～15mm。

(9)如上述(3)～(8)中任一項(xiàng)所述的器官保存液，其特征在于，配合物中的l-半胱氨酸濃度為0.5～0.7mm。

(10)如上述(4)～(9)中任一項(xiàng)所述的器官保存液，其特征在于，鐵化合物為硫酸亞鐵。

(11)一種保存器官的方法，其中，使用上述(1)～(10)中任一項(xiàng)所述的器官保存液。

發(fā)明的效果

通過將移植用器官浸漬于本發(fā)明的器官保存液中，能夠有效地防止由總?cè)毖獣r(shí)間的延長(zhǎng)而導(dǎo)致的缺血再灌注損傷的發(fā)生。

附圖說明

[圖1]是針對(duì)將在htk液、ec液、uw液及保存液(a)～(c)的各保存液的任一者中浸漬了24小時(shí)的心臟進(jìn)行異位心臟移植后的各小鼠個(gè)體示出直到移植心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)時(shí)間的測(cè)定結(jié)果的圖。

[圖2]是針對(duì)將在htk液、ec液及保存液(a)～(c)的各保存液的任一者中浸漬了48小時(shí)的心臟進(jìn)行異位心臟移植后的各小鼠個(gè)體示出直到移植心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)時(shí)間的測(cè)定結(jié)果的圖。

[圖3]是針對(duì)將在uw液、保存液(d)3及保存液(d)6的各保存液的任一者中浸漬了24小時(shí)的心臟進(jìn)行異位心臟移植后的各小鼠個(gè)體示出對(duì)直到移植心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)時(shí)間的測(cè)定結(jié)果的圖。

[圖4]是針對(duì)將在uw液、保存液(d)3及保存液(d)6的各保存液的任一者中浸漬了24小時(shí)的心臟進(jìn)行異位心臟移植后的各小鼠個(gè)體示出移植后的經(jīng)過天數(shù)與心臟成活率的關(guān)系的圖。

[圖5]是針對(duì)將在uw液、保存液(d)3、保存液(d)6、及保存液(d)7的各保存液的任一者中浸漬了48小時(shí)的心臟進(jìn)行異位心臟移植后的各小鼠個(gè)體示出直到移植心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)時(shí)間的測(cè)定結(jié)果的圖。

[圖6]是針對(duì)將在uw液、保存液(d)3、保存液(d)6、及保存液(d)7的各保存液的任一者中浸漬了48小時(shí)的心臟進(jìn)行異位心臟移植后的各小鼠個(gè)體示出移植后的經(jīng)過天數(shù)與心臟成活率的關(guān)系的圖。

[圖7]是針對(duì)進(jìn)行了異位心臟移植的各小鼠個(gè)體示出直到經(jīng)移植的心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)時(shí)間的圖。

[圖8]是示出進(jìn)行了異位心臟移植的各小鼠血清中的ldh及cpk的產(chǎn)生量的圖。

[圖9]是示出經(jīng)移植的心臟的成活率的圖。

[圖10]是示出已摘取及/或經(jīng)移植的心臟的atp量的圖。

[圖11]示出了經(jīng)ttc染色的移植心臟切片。

[圖12](上部的圖)示出了血管周圍水腫區(qū)域相對(duì)于血管周圍區(qū)域的比例。(下部的照片)示出了經(jīng)h/e(蘇木精/曙紅)染色的移植心臟切片。

[圖13]示出了使用抗cd68抗體(克隆：fa-11,biolegend公司制)、利用酶標(biāo)記抗體法而染成藍(lán)紫色的移植心臟切片。

[圖14]示出了經(jīng)tunel染色的移植心臟切片。

[圖15]是示出移植心臟切片中發(fā)生了細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的比例的圖。

[圖16]示出了利用抗8-ohdg抗體以酶標(biāo)記抗體法染色、同時(shí)還利用將核染成藍(lán)色的蘇木精進(jìn)行了染色的移植心臟切片。

[圖17]是示出經(jīng)移植的心臟的全部細(xì)胞中的8-ohdg陽(yáng)性細(xì)胞的比例的圖。

[圖18]是示出進(jìn)行了異位心臟移植的各小鼠血清中的8-ohdg量的圖。

[圖19]是示出將小鼠的移植心臟的組織破碎并進(jìn)行定量rt-pcr時(shí)的各種炎癥·氧化應(yīng)激標(biāo)記物相關(guān)基因的mrna的表達(dá)量的圖。各圖的柱從左開始表示naive、fresh、htk-48hr-poh24、c-48hr-poh24。

具體實(shí)施方式

作為本發(fā)明的器官保存液，只要是含有氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯、及d-葡萄糖的各成分的配合物的器官保存液(a)、含有氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯、甘氨酸、及d-葡萄糖的各成分的配合物的器官保存液(b)、含有氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯、l-半胱氨酸、甘氨酸、及d-葡萄糖的各成分的配合物的器官保存液(c)、含有氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯、l-半胱氨酸、甘氨酸、鐵化合物、及d-葡萄糖的各成分的配合物的器官保存液(d)即可，沒有特別限制，本發(fā)明的器官保存液可以以向蒸餾水等中添加并溶解上述各成分而得到的配合物的形式進(jìn)行制備。另外，各成分的配合濃度只要在作為移植用器官的保存液能夠達(dá)成本發(fā)明的課題的范圍內(nèi)即可，沒有特別限定。

在上述成分中，無(wú)機(jī)鹽以電離狀態(tài)存在于溶液中，因此，本發(fā)明的器官保存液(a)含有氯化物離子、鉀離子、鈉離子、hpo4^2-、h2po4^-、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯、及d-葡萄糖，器官保存液(b)含有氯化物離子、鉀離子、鈉離子、hpo4^2-、h2po4^-、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯、甘氨酸、及d-葡萄糖，器官保存液(c)含有氯化物離子、鉀離子、鈉離子、hpo4^2-、h2po4^-、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯、l-半胱氨酸、甘氨酸、及d-葡萄糖，器官保存液(d)含有氯化物離子、鉀離子、鈉離子、hpo4^2-、h2po4^-、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯、l-半胱氨酸、甘氨酸、鐵離子、及d-葡萄糖而成。

例如，作為配合物中的氯化鉀的濃度，可合適地例舉5～25mm、優(yōu)選10～20mm、更優(yōu)選13～17mm。即，作為配合物中的氯化物離子、鉀離子的濃度，可合適地例舉5～25mm、優(yōu)選10～20mm、更優(yōu)選13～17mm。

作為配合物中的磷酸氫二鈉的濃度，可合適地例舉25～60mm，優(yōu)選35～50mm、更優(yōu)選40～45mm。即，作為配合物中的hpo4^2-的濃度，可合適地例舉25～60mm、優(yōu)選35～50mm、更優(yōu)選40～45mm。另外，作為配合物中的磷酸二氫鈉的濃度，可合適地例舉10～20mm、優(yōu)選12～18mm、更優(yōu)選14～16mm。即，作為h2po4^-的濃度，可合適地例舉10～20mm、優(yōu)選12～18mm、更優(yōu)選14～16mm。并且，作為配合物中的鈉離子的濃度，可合適地例舉35～80mm、優(yōu)選47～68mm、更優(yōu)選54～61mm。

磷酸氫二鈉與氯化鉀的濃度比優(yōu)選為4:1～2:1。另外，磷酸二氫鈉與氯化鉀的濃度比優(yōu)選為1:2～2:1。并且，磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉的濃度比優(yōu)選為4:1～2:1。

作為配合物中的l-抗壞血酸的濃度，可合適地例舉0.1～0.5mm、優(yōu)選0.2～0.4mm、更優(yōu)選0.2～0.3mm。另外，l-抗壞血酸與氯化鉀的濃度比優(yōu)選為1:50～1:70。

作為配合物中的l-抗壞血酸磷酸酯的濃度，可合適地例舉0.3～0.6mm、優(yōu)選0.4～0.5mm、更優(yōu)選0.43～0.47mm。另外，l-抗壞血酸磷酸酯與氯化鉀的濃度比優(yōu)選為1:25～1:40。并且，l-抗壞血酸與l-抗壞血酸磷酸酯的濃度比優(yōu)選為1:1～1:3。

作為配合物中的甘氨酸的濃度，可合適地例舉3～20mm、優(yōu)選5～15mm、更優(yōu)選8～12mm。另外，甘氨酸與氯化鉀的濃度比優(yōu)選為1:1～1:2。

作為配合物中的l-半胱氨酸的濃度，可合適地例舉0.3～0.9mm、優(yōu)選0.5～0.7mm、更優(yōu)選0.60～0.65mm。另外，l-半胱氨酸與氯化鉀的濃度比優(yōu)選為1:20～1:25。

作為配合物中的d-葡萄糖的配合濃度，器官保存液的滲透壓可合適地例舉270～450mosm/kg、優(yōu)選300～390mosm/kg、更優(yōu)選326～363mosm/kg。

作為配合物中的鐵化合物，可以為有機(jī)鹽也可為無(wú)機(jī)鹽，作為無(wú)機(jī)鹽，可舉出氯化鐵、三氧化二鐵、硫酸亞鐵、焦磷酸亞鐵，作為有機(jī)鹽，可舉出羧酸鹽，例如作為羥基羧酸鹽的檸檬酸亞鐵、檸檬酸鐵鈉、檸檬酸亞鐵鈉、檸檬酸鐵銨等檸檬酸鹽、焦磷酸鐵、乳酸鐵、葡糖酸亞鐵、二亞乙基三胺五乙酸鐵鈉、二亞乙基三胺五乙酸鐵銨、亞乙基二胺四乙酸鐵鈉、亞乙基二胺四乙酸鐵銨、二羧基甲基谷氨酸鐵鈉、二羧基甲基谷氨酸鐵銨、富馬酸亞鐵、乙酸鐵、草酸鐵、琥珀酸亞鐵、琥珀酸檸檬酸鐵鈉等有機(jī)酸鹽、血紅素鐵、右旋糖酐鐵、三亞乙基四胺鐵、乳鐵蛋白鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵、葉綠酸鐵鈉、鐵蛋白鐵、含糖氧化鐵、硫酸甘氨酸鐵，其中優(yōu)選為硫酸亞鐵。作為鐵化合物的濃度即鐵離子濃度，可舉出0.1μm～10mm，優(yōu)選為0.5μm～5mm。

在本發(fā)明的器官保存液中，除上述各成分外，可適當(dāng)配合水、生理食鹽水、各種緩沖劑、維生素類、5-氨基乙酰丙酸、糖類、蛋白酶抑制劑、類黃酮糖苷、肝細(xì)胞增殖因子(hgf)、卵磷脂化超氧化物歧化酶、羥乙基淀粉、抗氧化劑、抗炎癥性細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)性t細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。

作為本發(fā)明的器官保存液的ph，ph為6～8，優(yōu)選ph為6.5～7.5，更優(yōu)選ph為7左右。另外，本發(fā)明的器官保存液通常在0℃左右使用。將器官浸漬在本發(fā)明的器官保存液中的時(shí)間(即冷缺血(冷缺血時(shí)間))為48小時(shí)以內(nèi)，優(yōu)選24小時(shí)以內(nèi)，更優(yōu)選12小時(shí)以內(nèi)，但即使浸漬時(shí)間為24～48小時(shí)，缺血再灌注損傷的發(fā)生也能被有效地防止。

作為成為本發(fā)明的器官保存液的適用對(duì)象的器官，只要是能夠進(jìn)行移植的器官即可，沒有特別限制，不僅可以是從供體摘取的器官，還可以是在體外(invitro)制作的移植物、細(xì)胞、利用再生醫(yī)療技術(shù)人工構(gòu)筑的組織·器官、以及由萬(wàn)能細(xì)胞制作的器官等。另外，作為器官的種類，可例舉腎臟、肝臟、心臟、胰臟、肺、小腸、眼球、角膜、毛發(fā)、皮膚等，其中，可合適地例舉腎臟、肝臟、心臟、胰臟、肺、小腸。

使用本發(fā)明的器官保存液的器官移植可利用常規(guī)方法進(jìn)行，其可以是將由供體等提供的器官浸漬于本發(fā)明的器官保存液中、然后除去受體的相應(yīng)器官并將由供體等提供的器官移植到受體中的相同部位的原位器官移植，也可以是在保持殘留有受體的器官的狀態(tài)下將由供體等提供的器官移植到受體的其他部位的異位器官移植。

作為使用本發(fā)明的器官保存液的器官移植中的供體及/或受體，可舉出人、狒狒、牛、豬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠等哺乳動(dòng)物，作為所述器官移植的方式，只要是能夠?qū)⑵鞴購(gòu)墓w移植到受體的方式即可，沒有特別限制，可舉出從小鼠到小鼠、從大鼠到大鼠、從兔到兔、從狗到狗、從貓到貓、從豬到豬、從猴到猴、從狒狒到狒狒、從人到人等同種器官移植；從豬到人、從牛到人、從猴到人、從狒狒到人等異種器官移植。

以下，通過實(shí)施例來(lái)更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不限定于這些示例。

實(shí)施例1

(保存液的制備)

將新制備的3種器官保存液(保存液(a)～保存液(c))作為研究對(duì)象。將添加并溶解于蒸餾水中的成分的詳情示于以下的表1中。在將移植用器官以超出針對(duì)以往的保存液制品規(guī)定的最大缺血容許時(shí)間的方式浸漬于上述保存液中的情況下，對(duì)移植后能否維持器官的功能進(jìn)行研究。具體而言，在將浸漬于上述3種保存液中的供體小鼠的心臟移植到同株系小鼠的情況下，將移植后直到開始再跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間作為指標(biāo)。為了進(jìn)行比較研究，使用3種作為公知的現(xiàn)有產(chǎn)品的保存液，即euro-collins液(ec液)、組氨酸-色氨酸-酮戊二酸鹽液(htk液)、威斯康星大學(xué)液(universityofwisconsin：uw液)。將上述3種現(xiàn)有產(chǎn)品的成分的詳情示于以下的表2中。

[表1]

[表2]

(小鼠異位心臟移植1)

作為提供將要移植的心臟的供體小鼠、及將要移植從供體小鼠摘取的心臟的受體小鼠，使用c57bl/6ncrslc(h²-k^b)株系小鼠(雄性、6～10周齡)。小鼠異位心臟移植手術(shù)步驟以wu等(europeanheartjournal(2011)32,509-516)的記載為參考，以下示出概要。

將供體小鼠麻醉后開胸，將心臟的上腔靜脈結(jié)扎，并切斷頭臂動(dòng)脈干(brachiocephalictrunk)。使用1ml肝素生理食鹽水(100iu/ml)進(jìn)行灌注后，將1ml上述表1中記載的各保存液(a)～(c)或上述表2中記載的作為比較研究用的3種現(xiàn)有產(chǎn)品的保存液分別自各供體小鼠的下腔靜脈進(jìn)行灌注，并從頭臂動(dòng)脈干排出。將各供體小鼠的下腔靜脈結(jié)扎后，切斷升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈，并將其他全部血管結(jié)扎。接下來(lái)，將供體小鼠的摘取心臟于0℃在15ml上述保存液(a)～(c)及表2中記載的3種現(xiàn)有產(chǎn)品的各保存液的任一者中浸漬24小時(shí)。

將浸漬于上述各保存液中的供體小鼠的摘取心臟移植到受體小鼠。在全身麻醉下對(duì)受體小鼠開腹后，使供體小鼠的摘取心臟的升主動(dòng)脈吻合于受體小鼠的腹部大動(dòng)脈，使供體小鼠的下腔靜脈與受體小鼠的下腔靜脈吻合，完成手術(shù)。器官移植時(shí)的溫缺血時(shí)間統(tǒng)一為40分鐘。

(經(jīng)異位心臟移植的心臟的再跳動(dòng)時(shí)間1)

針對(duì)將在上述各保存液中浸漬了24小時(shí)后的摘取心臟進(jìn)行了異位心臟移植的各小鼠個(gè)體，對(duì)直到經(jīng)移植的心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。之后，通過觸診來(lái)判斷是否開始跳動(dòng)。結(jié)果示于圖1中。

(結(jié)果1)

由圖1可見，uw液的再跳動(dòng)開始時(shí)間為240秒左右，是3種現(xiàn)有產(chǎn)品中再跳動(dòng)開始時(shí)間最短的，另一方面，保存液(c)的再跳動(dòng)開始時(shí)間為100秒左右，時(shí)間縮短為uw液的一半以下。另外，對(duì)于從含有氯化鉀、磷酸氫二鈉·12水合物、磷酸二氫鈉·2水合物、l-抗壞血酸、l-抗壞血酸磷酸酯鎂鹽n水合物、l-半胱氨酸鹽酸鹽1水合物、甘氨酸、d(+)-葡萄糖的保存液(c)中除去了l-半胱氨酸鹽酸鹽1水合物的保存液(b)而言，為與uw液同等程度的再跳動(dòng)開始時(shí)間。從保存液(c)中除去了l-半胱氨酸鹽酸鹽1水合物及甘氨酸的保存液(a)與ec液相比，再跳動(dòng)開始時(shí)間也縮短。因此，確認(rèn)了在將移植器官浸漬于保存液(a)～(c)中的任一保存液的情況下，與使用3種作為現(xiàn)有產(chǎn)品的htk液、ec液、uw液的情況相比，再跳動(dòng)開始時(shí)間縮短，這表明與使用現(xiàn)有產(chǎn)品進(jìn)行保存的情況相比，器官的最大缺血容許時(shí)間(從器官的血流停止到移植器官后血流能夠恢復(fù)為止的時(shí)間)變長(zhǎng)。

實(shí)施例2

(小鼠異位心臟移植2)

將在各保存液中的浸漬時(shí)間設(shè)為48小時(shí)，為了進(jìn)行比較研究使用了現(xiàn)有產(chǎn)品htk液、ec液，除此之外，按照上述實(shí)施例1(小鼠異位心臟移植1)的步驟進(jìn)行小鼠異位心臟移植。針對(duì)進(jìn)行了異位心臟移植的各小鼠個(gè)體，對(duì)直到經(jīng)移植的心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果示于圖2中。

(結(jié)果2)

由圖2可見，htk液、ec液的再跳動(dòng)開始時(shí)間均為1500秒以上，另一方面，保存液(a)的再跳動(dòng)開始時(shí)間為500秒左右，保存液(b)的再跳動(dòng)開始時(shí)間為1250秒左右，保存液(c)的再跳動(dòng)開始時(shí)間為600秒左右。因此，與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，保存液(a)～(c)均顯示出良好的縮短再跳動(dòng)開始時(shí)間的效果。然而，在浸漬時(shí)間為48小時(shí)的情況下，受體小鼠的死亡率變高。

實(shí)施例3

(小鼠異位心臟移植3)

作為鐵添加系列保存液，進(jìn)一步制備了在上述保存液(c)中添加有硫酸亞鐵的保存液(d)，繼續(xù)進(jìn)行研究。將各保存液的成分的詳情示于下表3中。

[表3]

作為鐵添加系列保存液，使用了保存液(d)3及保存液(d)6，為了進(jìn)行比較研究使用了現(xiàn)有產(chǎn)品uw液，除此之外，按照上述實(shí)施例1(小鼠異位心臟移植1)的步驟進(jìn)行小鼠異位心臟移植。在保存液中浸漬24小時(shí)后，針對(duì)進(jìn)行了異位心臟移植的各小鼠個(gè)體，對(duì)直到移植心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果示于圖3中。

進(jìn)而，對(duì)于進(jìn)行了上述異位心臟移植的小鼠個(gè)體而言，在心臟移植后，針對(duì)進(jìn)行了異位心臟移植的各小鼠個(gè)體，對(duì)直到移植心臟停止跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間進(jìn)行計(jì)量。結(jié)果示于圖4中。

(結(jié)果3-1)

由圖3也可見，現(xiàn)有產(chǎn)品uw液的再跳動(dòng)開始時(shí)間為230秒左右，另一方面，保存液(d)3的再跳動(dòng)開始時(shí)間為12秒，保存液(d)6的再跳動(dòng)開始時(shí)間約為144秒，與現(xiàn)有產(chǎn)品uw液相比，保存液(d)3和保存液(d)6顯示出明顯的縮短再跳動(dòng)開始時(shí)間的效果。特別是保存液(d)3顯示出比上述實(shí)施例1中的保存液(c)更好的縮短再跳動(dòng)開始時(shí)間的效果。

(結(jié)果3-2)

如上所述，在冷保存液中浸漬24小時(shí)后進(jìn)行心臟移植，之后通過對(duì)心臟是否跳動(dòng)進(jìn)行觸診來(lái)判斷心臟是否成活，將確認(rèn)了停止跳動(dòng)的日期作為心臟脫落日。即，針對(duì)進(jìn)行了上述異位心臟移植的小鼠個(gè)體，對(duì)直到移植心臟停止跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間進(jìn)行計(jì)量。由圖4可知，保存液(d)3及保存液(d)6能夠與uw液同樣地確認(rèn)心臟的成活。

實(shí)施例4

(小鼠異位心臟移植4)

作為鐵添加系列保存液，使用了保存液(d)3、保存液(d)6、保存液(d)7，為了進(jìn)行比較研究，使用了現(xiàn)有產(chǎn)品uw液，將在各保存液中的浸漬時(shí)間設(shè)為48小時(shí)，除此之外，按照上述小鼠異位心臟移植1的步驟進(jìn)行小鼠異位心臟移植。針對(duì)進(jìn)行了異位心臟移植的各小鼠個(gè)體，對(duì)直到移植心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果示于圖5中。

進(jìn)而，針對(duì)進(jìn)行了上述異位心臟移植的小鼠個(gè)體，與實(shí)施例3同樣地對(duì)直到移植心臟停止跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間進(jìn)行計(jì)量。結(jié)果示于圖6中。

(結(jié)果4-1)

在uw液的情況下，沒有移植心臟開始再跳動(dòng)的個(gè)體。關(guān)于各保存液的再跳動(dòng)開始時(shí)間，保存液(d)3為260秒左右，保存液(d)6為90秒左右，保存液(d)7為820秒左右，均發(fā)生了移植心臟的再跳動(dòng)。

(結(jié)果4-2)

對(duì)于移植了浸漬于uw液中的摘取心臟的小鼠而言，沒有出現(xiàn)再跳動(dòng)；

在移植了浸漬于保存液(d)3中的摘取心臟的小鼠(n＝5)中，存在長(zhǎng)時(shí)間跳動(dòng)的小鼠。更詳細(xì)而言，雖然當(dāng)日(第0日)有2只、第1天有1只、第2天有1只小鼠的移植心臟停止跳動(dòng)，但存在1只在經(jīng)過60天的時(shí)間點(diǎn)移植心臟仍持續(xù)跳動(dòng)的個(gè)體；

在移植了浸漬于保存液(d)6中的摘取心臟的小鼠(n＝1)中，存在長(zhǎng)時(shí)間跳動(dòng)的小鼠。更詳細(xì)而言，存在1只在經(jīng)過60天的時(shí)間點(diǎn)移植心臟仍持續(xù)跳動(dòng)的個(gè)體；

在移植了浸漬于保存液(d)7中的摘取心臟的小鼠(n＝6)中，存在移植心臟長(zhǎng)時(shí)間跳動(dòng)的小鼠。更詳細(xì)而言，雖然在第7天有1只小鼠的移植心臟停止跳動(dòng)，但存在5只在經(jīng)過30天的時(shí)間點(diǎn)移植心臟仍持續(xù)跳動(dòng)的個(gè)體；

之后，將htk作為對(duì)照，對(duì)上述保存液(c)進(jìn)一步進(jìn)行研究。

實(shí)施例5

(小鼠異位心臟移植5)

作為保存液，使用保存液(c)或htk液，將來(lái)自供體小鼠的摘取心臟在保存液中浸漬24小時(shí)或48小時(shí)，除此之外，按照上述實(shí)施例1(小鼠異位心臟移植1)的步驟完成小鼠異位心臟移植的手術(shù)，制備進(jìn)行了異位心臟移植的小鼠。

(進(jìn)行了異位心臟移植的心臟的再跳動(dòng)時(shí)間2)

針對(duì)進(jìn)行了異位心臟移植的各小鼠個(gè)體，對(duì)直到移植的心臟開始跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。需要說明的是，所有的再跳動(dòng)都是在30分鐘以內(nèi)進(jìn)行計(jì)量的。在再灌注后經(jīng)30分鐘還未開始跳動(dòng)的情況下，算作1800秒。結(jié)果示于圖7(a)(b)中。

(結(jié)果5)

由圖7可見，在摘取心臟在保存液中的浸漬時(shí)間為24小時(shí)(參照?qǐng)D7(a))及48小時(shí)(參照?qǐng)D7(b))中的任一者的情況下，與將摘取心臟浸漬于htk液中相比，將摘取心臟浸漬于保存液(c)中時(shí)，直到移植到受體小鼠的心臟開始再跳動(dòng)所經(jīng)過的時(shí)間縮短。在浸漬時(shí)間為24小時(shí)情況下，浸漬于保存液(c)中的移植心臟的再跳動(dòng)開始時(shí)間(約100秒)是浸漬于htk液中的移植心臟的再跳動(dòng)開始時(shí)間(約300秒)的約三分之一，在浸漬時(shí)間為48小時(shí)情況下，浸漬于保存液(c)中的移植心臟的再跳動(dòng)開始時(shí)間(約600秒)是浸漬于htk液中的移植心臟的再跳動(dòng)開始時(shí)間(約1500秒)的約五分之二。

實(shí)施例6

(小鼠異位心臟移植6)

按照與上述實(shí)施例5(小鼠異位心臟移植5)同樣的步驟完成手術(shù)，制備進(jìn)行了異位心臟移植的小鼠。

(對(duì)剛剛移植后的抑制急性炎癥的效果的研究)

對(duì)以下的各小鼠進(jìn)行研究。

(1)移植了在保存液(c)中浸漬了24小時(shí)的摘取心臟、并從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(c-24hr-poh24)；

(2)移植了在保存液(c)中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟、并從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(c-48hr-poh24)；

(3)移植了在htk液中浸漬了24小時(shí)的摘取心臟、并從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(htk-24hr-poh24)；

(4)移植了在htk液中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟、并從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(htk-48hr-poh24)；

(以下，有時(shí)將上述4種小鼠統(tǒng)稱為“(1)～(4)的小鼠”。)

進(jìn)而，制備以下小鼠作為對(duì)照。

(5)未將摘取心臟浸漬在保存液中而直接進(jìn)行移植、并從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(fresh)；

(6)未進(jìn)行移植手術(shù)的小鼠(naive)；

針對(duì)上述各小鼠，從各小鼠進(jìn)行采血并提取血清。針對(duì)得到的各血清，對(duì)用作對(duì)細(xì)胞的傷害的指標(biāo)的cpk(肌酸磷酸激酶)和ldh(乳酸脫氫酶)的量進(jìn)行測(cè)定。cpk使用fujidri-chemslidecpk-piii(fujifilm公司制)、ldh使用fujidri-chemslideldh-piii(fujifilm公司制)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果示于圖8中。

(結(jié)果6)

由圖8也可見，對(duì)于血清中的ldh的產(chǎn)生量而言，c-48hr-poh24比htk-48hr-poh24明顯減少(參照?qǐng)D8(a))。另外，對(duì)于血清中的cpk的產(chǎn)生量而言，c-48hr-poh24也比htk-48hr-poh24少(參照?qǐng)D8(b))。對(duì)于c-24hr-poh24和htk-24hr-poh24而言，在血清中的ldh的產(chǎn)生量、cpk的產(chǎn)生量方面沒有產(chǎn)生差異。由以上結(jié)果可確認(rèn)，在浸漬于保存液中48小時(shí)的情況下，較之用浸漬于htk液中的心臟進(jìn)行異位移植的小鼠而言，在用浸漬于保存液(c)中的心臟進(jìn)行異位移植的小鼠中，血清中l(wèi)dh的產(chǎn)生被顯著抑制，另外，血清中cpk的產(chǎn)生也被抑制。

實(shí)施例7

(對(duì)經(jīng)移植的心臟的長(zhǎng)期成活率效果的研究)

針對(duì)上述(1)～(4)的小鼠、及未將摘取心臟浸漬在保存液中而直接進(jìn)行移植并且從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(fresh)的各小鼠，確認(rèn)已移植的心臟成活至何時(shí)。通過對(duì)移植心臟的跳動(dòng)進(jìn)行觸診來(lái)確認(rèn)，若跳動(dòng)停止，則視為因功能停止而導(dǎo)致器官脫落(未成活)。最初的2周中，每天進(jìn)行觸診確認(rèn)，之后2.5個(gè)月中，每周進(jìn)行2次觸診確認(rèn)。結(jié)果示于圖9中。

(結(jié)果7)

由圖9可見，移植了在保存液(c)中浸漬了24小時(shí)的摘取心臟、并且從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(c-24hr(n＝4))在術(shù)后第60天100％成活，與此相對(duì)，移植了在htk中浸漬了24小時(shí)的摘取心臟、并且從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(htk-24hr(n＝7))的成活率僅為50％多一點(diǎn)。另外，移植了在保存液(c)中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟、并且從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(c-48hr(n＝4))即使在60日后也有50％成活，與此相對(duì)，移植了在htk液中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟、并且從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(htk-48hr(n＝0))的移植心臟在當(dāng)日(第0日)全部脫落。由以上結(jié)果可確認(rèn)，在浸漬時(shí)間為24小時(shí)及48小時(shí)中的任一者的情況下，與浸漬于htk液的心臟相比，浸漬于保存液(c)的心臟的長(zhǎng)期成活率高。

實(shí)施例8

(對(duì)提高移植心臟的atp量的效果的研究)

針對(duì)按照上述實(shí)施例1(小鼠異位心臟移植1)的步驟制備的摘取心臟，對(duì)提高atp量的效果進(jìn)行研究。

1)在保存液(c)中浸漬了24小時(shí)的摘取心臟(未移植)

(c-24hr-w/oope)；

2)在保存液(c)中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟(未移植)

(c-48hr-w/oope)；

3)在htk液中浸漬了24小時(shí)的摘取心臟(未移植)

(htk-24hr-w/oope)；

4)在htk液中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟(未移植)

(htk-48hr-w/oope)；

5)將在保存液(c)中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟移植到小鼠、并且從移植手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的移植心臟(c-48hr-poh24)；

6)將在htk液中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟移植到小鼠、并且從移植手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的移植心臟(htk-48hr-poh24)；

7)未將摘取心臟浸漬于保存液中而直接進(jìn)行移植、并且從移植手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的移植心臟(fresh)；

8)剛切除的心臟，且為未進(jìn)行移植的小鼠心臟(naive)；

利用americ-atpkit(cat.632-23881和光純藥公司制)從上述各心臟中提取atp，比較各組的atp量。結(jié)果示于圖10中。

(結(jié)果8)

由圖10可見，從c-24hr-w/oope提取的atp量比從htk-24hr-w/oope提取的atp量少。另一方面，從c-48hr-w/oope提取的atp量和從htk-48hr-w/oope提取的atp量?jī)烧邲]有顯著差異。從c-48hr-poh24提取的atp量比從htk-48hr-poh24提取的atp量多。因此，就摘取后在保存液中浸漬48小時(shí)然后進(jìn)行移植的心臟而言，從浸漬于保存液(c)中的心臟提取的atp量比從浸漬于htk中的心臟提取的atp量多。

實(shí)施例9

(基于組織染色的對(duì)抑制壞死部分的效果的研究)

按照與上述實(shí)施例5(小鼠異位心臟移植5)同樣的步驟完成手術(shù)，制備進(jìn)行了異位心臟移植的小鼠。針對(duì)在保存液(a)中浸漬了24小時(shí)后移植到受體小鼠并經(jīng)過了1小時(shí)的小鼠(c-24hr-poh1、n＝2)的心臟和在htk液中浸漬了24小時(shí)后移植到受體小鼠并經(jīng)過了1小時(shí)的小鼠(htk-24hr-poh1、n＝2)的心臟，對(duì)抑制壞死部分的效果進(jìn)行研究。進(jìn)行ttc(2,3,5-三苯基氯化四氮唑(cat：0765；amresco公司制))染色(僅將組織的健康部分染成紅色)，與未被染色仍保持呈白色狀態(tài)的壞死部分的表面積進(jìn)行比較。作為對(duì)照，使用剛切除的且未進(jìn)行移植的心臟(naive、n＝2)。對(duì)分成3份的心臟內(nèi)部進(jìn)行拍攝(eos，canon股份公司制)，將得到的照片示于圖11(a)～(c)。

(結(jié)果9)

由圖11可見，與htk-24hr-poh1的心臟(圖11(b))相比，c-24hr-poh1的心臟(圖11(c))的白色部分(表示壞死)少，確認(rèn)了與將摘取心臟浸漬于htk液中相比，將摘取心臟浸漬于保存液(c)中可防止移植心臟的壞死。

實(shí)施例10

(基于組織染色的研究)

針對(duì)按照上述實(shí)施例5(小鼠異位心臟移植5)的步驟制備的摘取心臟，利用組織染色進(jìn)行觀察。針對(duì)未將摘取心臟浸漬于保存液中而直接進(jìn)行移植并且從移植手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的移植心臟(fresh)、在htk液中浸漬了24小時(shí)或48小時(shí)后移植到受體小鼠并且經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(htk-24hr-poh24或htk-48hr-poh24)的心臟、和在保存液(c)中浸漬了24小時(shí)或48小時(shí)后移植到受體小鼠并經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(c-24hr-poh24或c-48hr-poh24)的心臟，制作固定切片，進(jìn)行h/e(蘇木精/曙紅)染色(其是將核染成藍(lán)色、將細(xì)胞質(zhì)染成紅紫色的方法)，通過用顯微鏡以200倍的倍率觀察心肌的形態(tài)從而進(jìn)行比較。將對(duì)肌細(xì)胞損傷進(jìn)行染色而得到的結(jié)果示于圖12(下部的照片)左側(cè)(肌細(xì)胞損傷；a-e)，將對(duì)血管周圍水腫進(jìn)行染色而得到的結(jié)果示于圖12(下部的照片)右側(cè)(血管周圍水腫；a'-e')。另外，圖12(上部的圖)示出了血管周圍水腫區(qū)域相對(duì)于血管周圍區(qū)域的比例。

(結(jié)果10)

由圖12(下部的照片)可確認(rèn)，與htk-24hr-poh24或htk-48hr-poh24的心臟相比，c-24hr-poh24、c-48hr-poh24的心臟在心肌纖維間的水腫、心肌纖維的斷裂、壞死心肌細(xì)胞核的消失、中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)等方面，心肌的損傷、血管周圍水腫均減輕。另外，由圖12(上部的圖)可知，與htk-24hr-poh24或htk-48hr-poh24的心臟相比，c-24hr-poh24、c-48hr-poh24的心臟的血管周圍水腫區(qū)域相對(duì)于血管周圍區(qū)域的比例大幅降低。

實(shí)施例11

(對(duì)抑制巨噬細(xì)胞積聚的效果的研究)

針對(duì)上述(1)～(4)的小鼠的經(jīng)移植的心臟，制作各心臟的固定切片，使用抗cd68抗體(克?。篺a-11,biolegend公司制)并利用酶標(biāo)記抗體法將其染成藍(lán)紫色，利用顯微鏡以200倍的倍率對(duì)cd68為陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞的分布進(jìn)行觀察，對(duì)在組織中積聚的巨噬細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行比較。巨噬細(xì)胞在組織中積聚暗示該組織產(chǎn)生炎癥。作為對(duì)照，使用剛切除且未進(jìn)行移植的心臟(naive)、和未將摘取心臟浸漬在保存液中而直接進(jìn)行移植并且經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠的心臟(fresh)。結(jié)果示于圖13中。

(結(jié)果11)

由圖13明顯可見，c-24hr-poh24的心臟與htk-24hr-poh24的心臟相比，以及，c-48hr-poh24的心臟與htk-48hr-poh24的心臟相比，cd68為陽(yáng)性的巨噬細(xì)胞的染成藍(lán)紫色的部分的密度小，巨噬細(xì)胞向心臟的積聚少。由此，確認(rèn)了在浸漬摘取心臟的時(shí)間為24小時(shí)及48小時(shí)中的任一者的情況下，與使用htk液作為浸漬摘取心臟的保存液相比，使用保存液(c)也可抑制組織中的炎癥。

實(shí)施例12

(對(duì)抑制細(xì)胞死亡的效果的研究)

針對(duì)上述(1)～(4)的各小鼠的經(jīng)移植的心臟，制作各心臟的固定切片，對(duì)抑制細(xì)胞死亡的效果進(jìn)行研究。使用cardiotacsinsituapoptosisdetectionkit(trevigen公司，cat.4827-30-k)進(jìn)行tunel(terminaldeoxynucleotidyltransferasedutpnickendlabelling)染色(將發(fā)生凋亡的細(xì)胞染成藍(lán)紫色)，然后利用顯微鏡以100、200倍的倍率進(jìn)行觀察，對(duì)tunel陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行比較。另外，對(duì)任意的9hpf/sample(≥3只/組)中的進(jìn)行了染色的凋亡細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算在全部細(xì)胞中的比例并進(jìn)行比較。作為對(duì)照，使用剛切除的且未進(jìn)行移植的心臟(naive)、和未將摘取心臟浸漬于保存液中而直接進(jìn)行移植且經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠的心臟(fresh)。結(jié)果示于圖14和圖15的圖中。

(結(jié)果12)

由圖14明顯可見，就c-24hr-poh24的心臟(參照?qǐng)D14(d))和htk-24hr-poh的心臟(參照?qǐng)D14(c))而言，藍(lán)紫色的量沒有顯著差異，但與c-48hr-poh24的心臟(參照?qǐng)D14(f))相比，htk-48hr-poh24的心臟(參照?qǐng)D14(e))的藍(lán)紫色顯著增多。另外，由圖15明顯可見，與c-48hr-poh24的心臟、fresh的心臟相比，發(fā)生細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的比例在htk-48hr-poh24的心臟中顯著增多。因此，確認(rèn)了在摘取心臟的浸漬時(shí)間為48小時(shí)的情況下，與使用htk液作為保存液相比，使用保存液(c)可顯著地抑制細(xì)胞凋亡。

實(shí)施例13

(對(duì)抑制細(xì)胞中的dna損傷的效果的研究)

針對(duì)移植了在上述保存液(c)或htk液中浸漬了24小時(shí)的摘取心臟并且從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(c-24hr-poh24或htk-24hr-poh24)的各心臟，制作心臟的固定切片，對(duì)抑制dna損傷的效果進(jìn)行研究。利用將核染成褐色的抗8-ohdg抗體并使用酶標(biāo)記抗體法(mog-100p、japaninstituteforcontrolofaging、nikkenseilco.)進(jìn)行染色，同時(shí)還利用將核染成藍(lán)色的蘇木精進(jìn)行染色。利用顯微鏡以100、200倍的倍率對(duì)該切片進(jìn)行觀察，對(duì)8-ohdg陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行比較。需要說明的是，8-ohdg為dna損傷標(biāo)記物，顯示出由活性氧導(dǎo)致的細(xì)胞的損傷程度。作為對(duì)照，使用剛切除的心臟(naive)和切除后立即移植且經(jīng)過了24小時(shí)的心臟(fresh-poh24)。另外，對(duì)任意的9hpf/sample(≥3只/組)中的進(jìn)行了染色的8-ohdg陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算在全部細(xì)胞中的比例。結(jié)果示于圖16的染色圖和圖17的圖中。

(結(jié)果13)

由圖16可見，與htk-24hr-poh24的心臟(參照?qǐng)D16(c))相比，c-24hr-poh24的心臟(參照?qǐng)D16(d))的被染成褐色的8-ohdg陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目少，因此，dna損傷被抑制，另外，由圖17可見，與c-24hr-poh24、fresh-poh24相比，htk-24hr-poh24的經(jīng)染色的8-ohdg陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，確認(rèn)了在摘取心臟的浸漬時(shí)間為24小時(shí)的情況下，與使用htk液作為保存液相比，使用保存液(c)可顯著地抑制由活性氧導(dǎo)致的dna傷害。需要說明的是，對(duì)于摘取心臟的浸漬時(shí)間為48小時(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)而言，由于心肌組織破壞，背景噪聲(background)變高，無(wú)法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，因此未示出數(shù)據(jù)。

實(shí)施例14

(抑制血清中的dna損傷的效果的研究)

針對(duì)移植了在上述保存液(c)或htk液中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟并且從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(c-48hr-poh24或htk-48hr-poh24)，從各小鼠進(jìn)行采血并提取血清，對(duì)抑制dna損傷的效果進(jìn)行研究。從各小鼠進(jìn)行采血并提取血清。使用highlysensitiveelisakitfor8-ohdg(kog-hs10/e,japaninstituteforcontrolofaging,nikkenseilco.公司制)，對(duì)血清中的8-ohdg量進(jìn)行比較。作為對(duì)照，使用未進(jìn)行移植手術(shù)的小鼠(naive)、和摘取后立即進(jìn)行移植并且經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(fresh)。結(jié)果示于圖18中。

(結(jié)果14)

由圖18可以確認(rèn)的是，在摘取心臟的浸漬時(shí)間為48小時(shí)的情況下，與使用htk液作為保存液相比，使用保存液(c)可顯著地抑制dna損傷。

實(shí)施例15

(炎癥·氧化應(yīng)激標(biāo)記物基因表達(dá)的變化的研究(定量rt-pcr))

針對(duì)移植了在上述保存液(c)或htk液中浸漬了48小時(shí)的摘取心臟并且從手術(shù)完成開始經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠(c-48hr-poh24或htk-48hr-poh24)的經(jīng)移植的心臟，將組織破碎后提取總rna，使用primescript(注冊(cè)商標(biāo))rtreagentkit(takarabio公司制)將其逆轉(zhuǎn)錄為cdna，使用premixextaq^tm(takarabio公司制)通過定量rt-pcr對(duì)與炎癥·氧化應(yīng)激相關(guān)的基因簇的表達(dá)加以比較。

作為未處理組，使用剛切除的心臟(naive)和切除后立即移植并且經(jīng)過了24小時(shí)的小鼠的心臟(fresh)。結(jié)果示于圖19中。在圖19中，對(duì)于il-6，從左起為naive(n＝5)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝5)、c-48hr-poh24(n＝4)；ho-1為naive(n＝6)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝4)、c-48hr-poh24(n＝5)；對(duì)于inos，從左起為naive(n＝6)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝4)、c-48hr-poh24(n＝5)；對(duì)于cd11b，從左起為naive(n＝6)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝4)、c-48hr-poh24(n＝4)；對(duì)于nrf2，從左起為naive(n＝6)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝3)、c-48hr-poh24(n＝5)；對(duì)于nf-kb，從左起為naive(n＝6)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝3)、c-48hr-poh24(n＝5)；對(duì)于tnf-α，從左起為naive(n＝6)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝3)、c-48hr-poh24(n＝5)；arg-1為naive(n＝6)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝3)、c-48hr-poh24(n＝5)；對(duì)于hif-1α，從左起為naive(n＝6)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝3)、c-48hr-poh24(n＝5)；對(duì)于tgf-β，從左起為naive(n＝6)、fresh(n＝3)、htk-48hr-poh24(n＝3)、c-48hr-poh24(n＝5)。

(結(jié)果15)

與htk-48hr-poh24的心臟相比，c-48hr-poh24的心臟的顯示出明顯低的值的項(xiàng)目是il-6：炎癥性細(xì)胞因子基因；ho-1：抗氧化蛋白基因；inos：抗氧化蛋白基因；cd11b：在損傷部位積聚的巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因。另一方面，與htk-48hr-poh24的心臟相比，c-48hr-poh24的心臟的顯示出明顯高的值的項(xiàng)目是nrf2；nf-kb；hif-1α：細(xì)胞的與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子；tgf-β：炎癥抑制性細(xì)胞因子基因。這表明使用保存液(c)作為保存液可抑制炎癥。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

本發(fā)明在器官移植這樣的醫(yī)療領(lǐng)域中有用。