本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說是涉及一種牙齒標本保存液及其應(yīng)用以及牙齒標本保存方法。
背景技術(shù)：
：牙髓干細胞(dentalpulpstemcells,DPSCs)是存在于牙齒牙髓組織中的一類具有自我更新、增殖能力強，及多向分化能力的間充質(zhì)干細胞。牙髓干細胞具有多向分化的潛能，它除了能形成礦化結(jié)節(jié)能力的細胞外，經(jīng)過不同細胞因子的誘導，還能夠分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、血管內(nèi)皮、肝、神經(jīng)等細胞系類型。成功從離體的牙齒中提取出足夠量符合標準的牙髓干細胞，首先遇到的問題就是離體牙齒保存的問題。口腔環(huán)境較其他組織環(huán)境不同，口腔內(nèi)的細菌數(shù)量很多，種類相當繁雜，離體牙齒保存不當極易發(fā)生染菌，且牙齒內(nèi)細胞量較少，離體牙齒保存不當也極易發(fā)生牙髓干細晌提取失敗的情況。文獻《六種保存液對牙周膜成纖維細胞活性的影響》(陳富波等，口腔材料器械，2012年第21卷第4期)中公開了6種脫位牙的保存液，雖然該文獻研究內(nèi)容是保存液對已提取的牙周膜成纖維細胞活性的影響，但是經(jīng)過試驗研究發(fā)現(xiàn)，這6種脫位牙保存液無法對牙齒標本提供有效的保護，存在易染菌和影響牙髓干細胞的問題。中國專利CN104705289A公開了一種離體牙齒保存液，每升保存液中有以下組分：青霉素0.3-0.6g、鏈霉素0.5-1g、甲硝唑0.02-0.04g、兩性霉素B0.015-0.025g、羥甲基纖維素5-10g、胰島素50-100μg，余量為MEM。上述保存液能夠有效保持牙髓干細胞的活性，并在一定程度上降低細菌污染，但是對于細菌污染的降低程度仍然不夠理想，需要提供更加優(yōu)異的保存液來加大對牙齒標本的保護程度。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種牙齒標本保存液及其應(yīng)用以及牙齒標本保存方法，使得所述保存液能夠有效保護牙齒標本，進而保證牙齒中的牙髓干細胞活性，顯著降低細菌感染細胞的程度。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種牙齒標本保存液，包括：氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、青霉素、鏈霉素和兩性霉素B。針對現(xiàn)有的牙齒保存液存在較大的細菌感染問題，本發(fā)明調(diào)整了牙齒標本保存液的組分，在保證牙齒中牙髓干細胞活性較高的前提下，顯著地降低了細胞感染細菌的程度。其中，所述保存液在具體實施過程中各組分濃度為：氯化鈉8g/L、氯化鉀0.2g/L、磷酸氫二鈉1.44g/L、磷酸二氫鉀0.24g/L、青霉素50U-500U/mL、鏈霉素50μg-500μg/mL和兩性霉素B0.5μg-5μg/mL，pH值7.2。進一步優(yōu)選地，所述青霉素濃度為100U/mL，所述鏈霉素濃度為100μg/mL，所述兩性霉素B濃度為1μg/mL。同時，本發(fā)明還提供了所述保存液的制備方法，配制氯化鈉8g/L、氯化鉀0.2g/L、磷酸氫二鈉1.44g/L、磷酸二氫鉀0.24g/L的混合溶液，調(diào)pH值為7.2，滅菌后加入青霉素、鏈霉素以及兩性霉素B，使其終濃度分別為500U-50U/mL、500μg-50μg/mL、5μg-0.5μg/mL。在實際配制過程中，可以定容到1L來進行配制。在本發(fā)明所述保存液與專利CN104705289A保存液的對比試驗中，從本發(fā)明保存的牙齒中提取的牙髓干細胞活性和其相當，但是細胞細菌污染的比例僅是10％，而現(xiàn)有保存液的比例是30％。此外，本發(fā)明還采用了《六種保存液對牙周膜成纖維細胞活性的影響》中牛奶、HBSS和DMEM高糖培養(yǎng)基3種脫位牙保存液進行相同的試驗，結(jié)果顯示這三種保存液在牙髓干細胞活性和細菌污染程度上都不及本發(fā)明保存液。基于上述的技術(shù)效果，本發(fā)明提出了所述保存液在保存牙齒標本、制備保存牙齒標本的產(chǎn)品和/或?qū)ρ例X標本消毒中的應(yīng)用。根據(jù)應(yīng)用，本發(fā)明提供了一種牙齒標本的保存方法，將采集的牙齒標本進行消毒，然后放入到本發(fā)明所述的保存液中，在低溫環(huán)境下保存。其中，所述消毒為采用酒精或碘伏消毒，所述低溫為2-8℃，更優(yōu)選為4℃。由以上技術(shù)效果可知，本發(fā)明選擇氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、青霉素、鏈霉素和兩性霉素B組成一種新型的牙齒標本保存液，相對于現(xiàn)有保存液，本發(fā)明保存液能提供更適合牙髓干細胞的生存環(huán)境，不影響其活性，同時極大地降低了細菌污染細胞的程度，無論從保存和運輸都提供了有效保護。具體實施方式本發(fā)明實施例公開了一種牙齒標本保存液及其應(yīng)用以及牙齒標本保存方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、應(yīng)用和方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的產(chǎn)品、應(yīng)用及方法進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種牙齒標本保存液及其應(yīng)用以及牙齒標本保存方法進行詳細說明。實施例1：配制本發(fā)明所述保存液8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，調(diào)pH7.2，定容1L；然后高壓蒸汽滅菌，取10mL溶液加入青霉素，使其終濃度為100U/mL，加入鏈霉素使其終濃度為100μg/mL,加入兩性霉素B，使其終濃度為1μg/ml，放置4℃?zhèn)溆?。實施?：配制本發(fā)明所述保存液8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，調(diào)pH7.2，定容1L；然后高壓蒸汽滅菌，取10mL溶液加入青霉素，使其終濃度為50U/mL，加入鏈霉素使其終濃度為500μg/mL,加入兩性霉素B，使其終濃度為0.5μg/ml，放置4℃?zhèn)溆?。實施?：配制本發(fā)明所述保存液8g氯化鈉(NaCl)，0.2g氯化鉀(KCl)、1.44g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)，0.24g磷酸二氫鉀(KH2PO4)，調(diào)pH7.2，定容1L；然后高壓蒸汽滅菌，取10mL溶液加入青霉素，使其終濃度為500U/mL，加入鏈霉素使其終濃度為50μg/mL,加入兩性霉素B，使其終濃度為5μg/ml，放置4℃?zhèn)溆?。實施?：對比試驗1、牙齒標本保存方法將采集的牙齒標本進行碘伏消毒，然后放入到保存液中，在4℃下保存72小時，所述牙齒取自18-30歲以內(nèi)無齲病、無釀炎的完整健康的智齒，大小差異不明顯。2、保存液本發(fā)明實施例1-3保存液、CN104705289A實施例1保存液、牛奶、HBSS和DMEM高糖培養(yǎng)基。3、牙髓干細胞提取方法將牙齒經(jīng)過碘伏消毒1min后，用PBS清洗2次。再用鉗子鉗開牙齒，組織鑷取出牙髓。放置在0.3％I型膠原酶+0.4％分散酶消化30-60min后，以1200rpm離心10min中，用PBS清洗一次后，過100μm細胞篩，再次以1200rpm離心5min。用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素、1μg/ml兩性霉素B的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，接種到25ml培養(yǎng)瓶中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)，每2天換液一次，當細胞待細胞達到匯合點(即細胞長滿瓶底的70％-80％)時，用2.5g/L胰蛋白酶消化進行傳代，按1:3傳代，第5代細胞進行細胞活力檢測及取樣進行微生物檢測。4、試驗結(jié)果見表1。表1不同保存液保存后牙髓干細胞活性和細菌污染細胞比例保存液細胞活力細菌污染細胞比例實施例190％±1.5％10％實施例291.5％±1％8％實施例393％±2％7％現(xiàn)有專利實施例192％±1％30％牛奶78％±4％45％HBSS85％±3％25％DMEM高糖培養(yǎng)基94％±2％34％由上表可知，本發(fā)明保存液和現(xiàn)有專利的保存液保存后的牙齒標本，在分離的細胞活力上無明顯差異，但分離后的牙髓干細胞細菌污染比例本發(fā)明明顯低于現(xiàn)有專利，說明現(xiàn)有專利保存液有利于細菌的增殖，而本發(fā)明保存液大大抑制了細菌增殖的趨勢，同時不損傷牙髓干細胞活性。雖然DMEM高糖培養(yǎng)基處理中牙髓干細胞的活性較高，但是其染菌細胞比例也是比較高的。而牛奶和HBSS無論在染菌方面和細胞活性方面都比較差。以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。當前第1頁1 2 3