本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進月季種子無菌萌發(fā)的方法。
背景技術(shù)：
月季(Rosa chinensis)是薔薇科薔薇屬的植物，原產(chǎn)于中國，其用途廣泛，有“花中皇后”、“花中女王”的美譽。月季是我國十大名花之一，是當今世界四大鮮切花之一。種子繁殖是月季進行育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，但薔薇屬植物的種子都具有休眠的特性，萌發(fā)困難，自然發(fā)芽率極低，常規(guī)方法發(fā)芽率通常低于10％，且發(fā)芽時間長，整齊度差。因此，打破種子休眠是種子萌發(fā)的根本前提。月季種子必須經(jīng)歷一定時間的低溫層積才能解除休眠。
目前，低溫層積的傳統(tǒng)做法是：利用冬季低溫條件，將種子埋藏在沙子中，經(jīng)過一段時間后，即可使種子萌發(fā)。這種打破種子休眠的方法將時間限制在冬天，具有一定的局限性，一定程度上限制了月季育種的工作進程。尤其是在進行月季的遠緣雜交育種中，利用胚挽救技術(shù)獲得月季組培植株的方法需要經(jīng)歷的時間更長。若能夠人為控制層積的溫度，將低溫層積與無菌技術(shù)相結(jié)合，則可有效快速地獲得月季的無菌組培苗，有利于縮短月季遠緣雜交育種的進程。目前尚未有將低溫層積與無菌相結(jié)合的技術(shù)方法應(yīng)用于月季種子的無菌萌發(fā)上。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種促進月季種子無菌萌發(fā)的方法，從而可以達到提高月季種子的發(fā)芽率。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種促進月季種子無菌萌發(fā)的方法，包括如下步驟：
(1)河沙的無菌處理：將濕潤的河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為25-30min，滅菌后使其自然冷卻，備用；
(2)無菌水的制備：在組培瓶中裝入70-80mL的自來水，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013mPa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為25-30min，得到無菌水；
(3)種子的無菌處理：滅菌前，先將月季種子倒入盛有清水的容器中，并分攪拌，撈出漂浮在水面的癟種子和雜質(zhì)，然后在自來水中浸泡24h，浸泡完成后即可進行滅菌處理：先將月季種子先用0.1-0.5％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下沖洗30min，再轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75％乙醇浸泡種子20-30s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡種子12-15min，此操作過程中輕輕震蕩月季種子，使升汞溶液很好地接觸種子，最后無菌水沖洗3次，得到無菌月季種子；
(4)種子的預處理：將無菌月季種子用濃度為200-250mg/L的無菌GA3溶液浸泡24h，備用；
(5)無菌低溫層積：在超凈工作臺上，將經(jīng)過無菌處理的月季種子埋入經(jīng)高溫滅菌的沙子中，并在沙子中加入無菌水使其保持濕潤，種子播種完畢，將裝有沙子的組培瓶置于冰箱的冷藏室進行冷藏40-60d；待冷藏結(jié)束后，將組培瓶移入培養(yǎng)室進行常溫遮光培養(yǎng)10-15d，待遮光培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計出芽率。
作為優(yōu)選，步驟(1)中所述的組培瓶規(guī)格為240mL，直徑68mm，口徑62mm，高90mm。
作為優(yōu)選，步驟(5)中冷藏室的溫度設(shè)定為4-7℃。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明的促進月季種子無菌萌發(fā)的方法將低溫層積與無菌相結(jié)合的技術(shù)方法應(yīng)用于月季種子的無菌萌發(fā)上，可顯著提高月季種子的出芽率，出芽時間短，可有效快速地獲得月季的無菌組培苗，有利于縮短月季遠緣雜交育種的進程。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和本質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
實施例1：
一種促進月季種子無菌萌發(fā)的方法，包括如下步驟：
(1)河沙的無菌處理：將濕潤的河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為30min，滅菌后使其自然冷卻，備用；所述的組培瓶規(guī)格為240mL，直徑68mm，口徑62mm，高90mm；
(2)無菌水的制備：在組培瓶中裝入80mL的自來水，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013mPa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為30min，得到無菌水；
(3)種子的無菌處理：滅菌前，先將月季種子倒入盛有清水的容器中，并分攪拌，撈出漂浮在水面的癟種子和雜質(zhì)，然后在自來水中浸泡24h，浸泡完成后即可進行滅菌處理：先將月季種子先用0.5％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下沖洗30min，再轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75％乙醇浸泡種子30s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡種子15min，此操作過程中輕輕震蕩月季種子，使升汞溶液很好地接觸種子，最后無菌水沖洗3次，得到無菌月季種子；
(4)種子的預處理：將無菌月季種子用濃度為250mg/L的無菌GA3溶液浸泡24h，備用；
(5)無菌低溫層積：在超凈工作臺上，將經(jīng)過無菌處理的月季種子埋入經(jīng)高溫滅菌的沙子中，并在沙子中加入無菌水使其保持濕潤，種子播種完畢，將裝有沙子的組培瓶置于冰箱的冷藏室進行冷藏60d；待冷藏結(jié)束后，將組培瓶移入培養(yǎng)室進行常溫遮光培養(yǎng)15d，待遮光培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計出芽率；冷藏室的溫度設(shè)定為7℃。
實施例2：
一種促進月季種子無菌萌發(fā)的方法，包括如下步驟：
(1)河沙的無菌處理：將濕潤的河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為25min，滅菌后使其自然冷卻，備用；所述的組培瓶規(guī)格為240mL，直徑68mm，口徑62mm，高90mm；
(2)無菌水的制備：在組培瓶中裝入70mL的自來水，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013mPa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為25-30min，得到無菌水；
(3)種子的無菌處理：滅菌前，先將月季種子倒入盛有清水的容器中，并分攪拌，撈出漂浮在水面的癟種子和雜質(zhì)，然后在自來水中浸泡24h，浸泡完成后即可進行滅菌處理：先將月季種子先用0.1％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下沖洗30min，再轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75％乙醇浸泡種子20s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡種子12min，此操作過程中輕輕震蕩月季種子，使升汞溶液很好地接觸種子，最后無菌水沖洗3次，得到無菌月季種子；
(4)種子的預處理：將無菌月季種子用濃度為200mg/L的無菌GA3溶液浸泡24h，備用；
(5)無菌低溫層積：在超凈工作臺上，將經(jīng)過無菌處理的月季種子埋入經(jīng)高溫滅菌的沙子中，并在沙子中加入無菌水使其保持濕潤，種子播種完畢，將裝有沙子的組培瓶置于冰箱的冷藏室進行冷藏40d；待冷藏結(jié)束后，將組培瓶移入培養(yǎng)室進行常溫遮光培養(yǎng)10d，待遮光培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計出芽率；冷藏室的溫度設(shè)定為4℃。
實施例3：
一種促進月季種子無菌萌發(fā)的方法，包括如下步驟：
(1)河沙的無菌處理：將濕潤的河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為28min，滅菌后使其自然冷卻，備用；所述的組培瓶規(guī)格為240mL，直徑68mm，口徑62mm，高90mm；
(2)無菌水的制備：在組培瓶中裝入75mL的自來水，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013mPa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為28min，得到無菌水；
(3)種子的無菌處理：滅菌前，先將月季種子倒入盛有清水的容器中，并分攪拌，撈出漂浮在水面的癟種子和雜質(zhì)，然后在自來水中浸泡24h，浸泡完成后即可進行滅菌處理：先將月季種子先用0.2％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下沖洗30min，再轉(zhuǎn)入超凈工作臺上，用75％乙醇浸泡種子25s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡種子14min，此操作過程中輕輕震蕩月季種子，使升汞溶液很好地接觸種子，最后無菌水沖洗3次，得到無菌月季種子；
(4)種子的預處理：將無菌月季種子用濃度為220mg/L的無菌GA3溶液浸泡24h，備用；
(5)無菌低溫層積：在超凈工作臺上，將經(jīng)過無菌處理的月季種子埋入經(jīng)高溫滅菌的沙子中，并在沙子中加入無菌水使其保持濕潤，種子播種完畢，將裝有沙子的組培瓶置于冰箱的冷藏室進行冷藏50d；待冷藏結(jié)束后，將組培瓶移入培養(yǎng)室進行常溫遮光培養(yǎng)13d，待遮光培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計出芽率；冷藏室的溫度設(shè)定為5℃。
將上述實施例1-3得到的促進月季種子無菌萌發(fā)的方法得到月季種子出芽率進行調(diào)查統(tǒng)計，結(jié)果見表1。
表1本發(fā)明的促進月季種子無菌萌發(fā)的方法對月季種子出芽率的測定
注：對照為采用常規(guī)方法對月季種子進行處理。
由表1可知，本發(fā)明的實施例1-3中月季種子的出芽率分別為52％、48％和49％，遠高于對照?？梢姡景l(fā)明的方法具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，值得進一步推廣和應(yīng)用。
前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。