本發(fā)明屬于植物保護技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法。
背景技術(shù)：
番茄斑萎病毒（Tomato Spotted Wilt Virus, TSWV）已對煙葉生產(chǎn)構(gòu)成了巨大的威脅。在局部地區(qū)可造成60％以上的嚴(yán)重?fù)p失，并有擴大和加重的趨勢。現(xiàn)有的主栽烤煙品種均能被番茄斑萎病毒侵染，成為番茄斑萎病毒流行、爆發(fā)的潛在威脅。由于其傳播介體——薊馬具有發(fā)育周期短、個體小易隱蔽、對殺蟲劑極易產(chǎn)生抗藥性等的特點，所以現(xiàn)有的防治措施難以取得理想的控制效果，因而，選育抗TSWV的烤煙品種是最經(jīng)濟、最有效的手段。
由于傳毒薊馬個體小，飼養(yǎng)薊馬、分離無毒和帶毒薊馬需要較高的專業(yè)技術(shù)等限制，人工摩擦接種番茄斑萎病毒是抗病品種鑒定最常用的接種方法。然而具體操作下來，發(fā)現(xiàn)從田間采集的番茄斑萎病毒病葉直接接種煙草效率僅為60-70%，難以滿足煙草抗性鑒定的需要。推測原因為番茄斑萎病毒在作物上會產(chǎn)生壞死表型，壞死區(qū)域的細(xì)胞中病毒濃度較低，因此降低了病毒接種的起始濃度，造成了接種效率不能滿足抗性鑒定的需求。為加快抗病品種的鑒定和選育，急需發(fā)明一種改進的高效的人工接種方式。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法，利用本發(fā)明所述的方法，能顯著提高病毒接種的起始濃度，進而提高番茄斑萎病毒的接種效率，對于單株植物，能夠準(zhǔn)確反映其對番茄斑萎病毒抗病性，同時，可鑒定各品種煙苗對番茄斑萎病毒的抗感性。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法，包括如下步驟：
步驟（1），本氏煙育苗：將本氏煙種子播于帶煙草漂浮育苗基質(zhì)的漂浮育苗盤中育苗30-40天，剔除弱苗，挑選出長勢整齊一致的幼苗，并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的本氏煙幼苗；
步驟（2），抗病性待檢煙苗育苗：在本氏煙播種15天后，將擬進行抗病性鑒定的煙草種子播于帶煙草漂浮育苗基質(zhì)的漂浮育苗盤中育苗30-40天，剔除弱苗，挑選出長勢整齊一致的幼苗，并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的抗病性待檢煙苗；
步驟（3），接種緩沖液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸緩沖液，121℃滅菌20分鐘；在接種前半個小時內(nèi)，每100 mL磷酸緩沖液加入0.2 g亞硫酸鈉，10 uL beta-巰基乙醇，配成TSWV接種緩沖液，放置冰上，備用；
步驟（4），本氏煙煙苗接種：將田間獲得經(jīng)過TSWV試紙條檢測的TSWV毒源接種于步驟（1）獲得的本氏煙幼苗，具體步驟如下：
取TSWV毒源1-2g，放于研缽中，加入5-10mL步驟（3）獲得的TSWV接種緩沖液和2-3g 200-400目金剛砂，充分研磨至混合均勻，得到TSWV毒源汁液；
接種前洗凈雙手或者戴一次性乳膠手套操作；
接種時，首先將粒徑為200-400目金剛砂按照每片葉0.1-0.2g的用量均勻的撒至本氏煙幼苗的葉表面，之后取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接種本氏煙幼苗葉片，另一只手從待接種本氏煙幼苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量為每片葉50-100ul；
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片，接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養(yǎng)一天，之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
15天后，采集本氏煙苗上表現(xiàn)番茄斑萎病毒癥狀的葉片和/或莖干作為本氏煙TSWV毒源直接進行步驟（5）操作或保存于-80℃冰箱備用；
步驟（5），抗病性鑒定：取步驟（4）獲得的本氏煙TSWV毒源1-2g放于研缽中，加入5-10mL步驟（3）獲得的TSWV接種緩沖液和2-3g 200-400目金剛砂，充分研磨至混合均勻，得到本氏煙TSWV毒源汁液；
接種前洗凈雙手或者戴一次性乳膠手套操作；
接種時，首先將粒徑為200-400目金剛砂按照每片葉0.1-0.2g的用量均勻的撒至步驟（2）得到的抗病性待檢煙苗的葉表面，之后取本氏煙TSWV毒源汁液，用一只手托住待接種抗病性待檢煙苗葉片，另一只手從待接種抗病性待檢煙苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦本氏煙TSWV毒源汁液；本氏煙TSWV毒源汁液的用量為每片葉50-100 ul
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片，接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養(yǎng)一天，之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
每7天調(diào)查一次抗病性待檢煙苗的病害，并計算煙苗番茄斑萎病毒的發(fā)病率a，共調(diào)查3-4次，分抗、感性植株，以最高一次發(fā)病率調(diào)查結(jié)果作為該品種煙苗的病情進行統(tǒng)計；發(fā)病率a=（該品種感病植株數(shù)量/該品種總植株數(shù)量）×100%。
進一步，優(yōu)選的是，步驟（4）中，接種于步驟（1）獲得的本氏煙幼苗所采用的TSWV毒源為帶TSWV病毒的煙草葉片。
進一步，優(yōu)選的是，步驟（4）中，TSWV毒源接種于步驟（1）獲得的本氏煙幼苗時，選擇長成且還未衰老的葉片進行接種；
步驟（5）中，本氏煙TSWV毒源汁液接種于步驟（2）獲得的抗病性待檢煙苗時，選擇長成且還未衰老的葉片進行接種。
進一步，優(yōu)選的是，步驟（4）和步驟（5）涂擦后，均采用普通噴壺噴水沖洗接種過的葉片1-2次。用水沖洗的目的一是沖去金剛砂，而是保持葉片濕潤，防止葉片因為有傷口而導(dǎo)致的水分流失，從而萎蔫。
進一步，優(yōu)選的是，將粒徑為200-400目金剛砂均勻的撒至本氏煙幼苗或抗病性待檢煙苗的葉表面時，采用噴粉器噴撒。
進一步，優(yōu)選的是，步驟（4）和步驟（5）中接種取毒源汁液時，采用手指、棉球或者一次性的棉簽蘸取。
進一步，優(yōu)選的是，步驟（4）采集本氏煙苗上表現(xiàn)番茄斑萎病毒癥狀的葉片和莖干作為本氏煙TSWV毒源，本氏煙TSWV毒源的癥狀為葉片皺縮，輕微黃化褪綠，莖干彎曲。
進一步，優(yōu)選的是，步驟（5）中病害調(diào)查采用的方法為血清學(xué)檢測或分子生物學(xué)檢測；
血清學(xué)檢測時，采集抗病性待檢煙苗植株的葉片利用番茄斑萎病毒試紙條或者番茄斑萎病毒抗體進行ELISA檢測，呈陽性則表示為感病植株，反之則為抗病植株；
分子生物學(xué)檢測時，提取植株總RNA，利用番茄斑萎病毒特異性引物進行RT-PCR檢測，呈陽性則表示為感病植株，反之則為抗病植株。
進一步，優(yōu)選的是，步驟（5）中病害調(diào)查采用的方法還包括癥狀觀察；
癥狀觀察時，感病植株癥狀包括：系統(tǒng)葉出現(xiàn)壞死斑、皺縮、黃化，植株矮小，發(fā)病后期整株壞死。即可采用癥狀觀察和血清學(xué)檢測，或者癥狀觀察和分子生物學(xué)檢測。
進一步，優(yōu)選的是，發(fā)病率a=0為免疫品種，發(fā)病率0＜a≤25%為抗病品種，發(fā)病率25%＜a≤100%為感病品種。
本發(fā)明的原理是在進行煙草抗病性鑒定前，將田間采集的番茄斑萎病毒毒源在本氏煙上活化，采集本氏煙上的發(fā)病組織作為毒源進行抗病性鑒定。本發(fā)明可顯著提高番茄斑萎病毒接種效率，實現(xiàn)大規(guī)模數(shù)量的煙草品種抗病性鑒定，有效提高抗病性鑒定效率，特別適合從數(shù)量龐大的種質(zhì)資源中篩選抗病靶標(biāo)品種；并且減少了不同操作人員間的人為誤差，煙苗抗病性鑒定結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映煙苗在田間的抗病能力。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：
1、本發(fā)明中利用本氏煙接種番茄斑萎病毒后出現(xiàn)葉片皺縮，輕微黃化褪綠，莖干彎曲，不產(chǎn)生壞死表型，相對于番茄斑萎病毒在其他作物上易發(fā)生葉片壞死，單位葉片中的病毒濃度大大提高，這使得病毒接種的起始濃度顯著提高，進而使得番茄斑萎病毒的接種效率明顯提高，提高了抗病性鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性；
2、本發(fā)明中利用本氏煙接種番茄斑萎病毒，接種后番茄斑萎病毒不產(chǎn)生壞死表型，相對于番茄斑萎病毒在其他作物上易發(fā)生整株壞死的表型，該發(fā)明易于番茄斑萎病毒的活體長期保存，使得抗病性鑒定更加便利；
3、本發(fā)明中利用的本氏煙TSWV毒源，接種效率為100%，發(fā)病時間短且均一，在接種后7-15天全部發(fā)病，相對于其他作物作為中間材料擴繁病毒，接種效率提高了30%以上，用時更短，效率更高，鑒定結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映煙苗田間的抗病性；
4、本發(fā)明利用的本氏煙若感染煙草上其他常見病毒，如TMV、CMV，會產(chǎn)生壞死表型，可以進行病毒復(fù)合侵染的篩選，這大大提高番茄斑萎病毒接種的純度和準(zhǔn)確性，鑒定結(jié)果能夠更加準(zhǔn)確反映煙苗對番茄斑萎病毒抗病性。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
本發(fā)明煙草漂浮育苗基質(zhì)的廠家及型號無特別要求，只要符合煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 310-2009（煙草漂浮育苗基質(zhì)））即可。
本發(fā)明步驟（1）、步驟（2）中的育苗方法采用現(xiàn)有技術(shù)即可。
步驟（4）、步驟（5）植株的培養(yǎng)基質(zhì)為煙草漂浮育苗基質(zhì)。
本發(fā)明血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測依據(jù)文獻（Huang etal., 2016 , Plant Disease, 100:1957）進行。
實施例1
一種抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法，包括如下步驟：
步驟（1），本氏煙育苗：將本氏煙種子播于帶煙草漂浮育苗基質(zhì)的漂浮育苗盤中育苗30-35天，剔除弱苗，挑選出長勢整齊一致的幼苗，并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的本氏煙幼苗；
步驟（2），抗病性待檢煙苗育苗：在本氏煙播種15天后，將擬進行抗病性鑒定的煙草種子播于帶煙草漂浮育苗基質(zhì)的漂浮育苗盤中育苗30-35天，剔除弱苗，挑選出長勢整齊一致的幼苗，并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的抗病性待檢煙苗；
步驟（3），接種緩沖液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸緩沖液，121℃滅菌20分鐘；在接種前半個小時內(nèi)，每100 mL磷酸緩沖液加入0.2 g亞硫酸鈉，10 uL beta-巰基乙醇，配成TSWV接種緩沖液，放置冰上，備用；
步驟（4），本氏煙煙苗接種：將田間獲得經(jīng)過TSWV試紙條檢測的TSWV毒源接種于步驟（1）獲得的本氏煙幼苗；所述的TSWV毒源帶TSWV病毒的煙草葉片；
具體步驟如下：
取TSWV毒源1g，放于研缽中，加入5mL步驟（3）獲得的TSWV接種緩沖液和2g 200-300目金剛砂，充分研磨至混合均勻，得到TSWV毒源汁液；
接種前洗凈雙手；
選擇長成且還未衰老的葉片進行接種，接種時，首先將粒徑為200-300目金剛砂按照每片葉0.1g的用量均勻的采用噴粉器噴撒至本氏煙幼苗的葉表面，之后采用手指蘸取取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接種本氏煙幼苗葉片，另一只手從待接種本氏煙幼苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量為每片葉50ul；
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片1次，接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養(yǎng)一天，之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
15天后，采集本氏煙苗上表現(xiàn)番茄斑萎病毒癥狀的葉片和/或莖干作為本氏煙TSWV毒源直接進行步驟（5）操作或保存于-80℃冰箱備用；
表現(xiàn)番茄斑萎病毒癥狀為葉片皺縮，輕微黃化褪綠，莖干彎曲。
步驟（5），抗病性鑒定：取步驟（4）獲得的本氏煙TSWV毒源1g放于研缽中，加入5mL步驟（3）獲得的TSWV接種緩沖液和2g 200-300目金剛砂，充分研磨至混合均勻，得到本氏煙TSWV毒源汁液；
接種前洗凈雙手；
選擇長成且還未衰老的葉片進行接種，接種時，首先將粒徑為200-300目金剛砂按照每片葉0.1g的用量均勻的采用噴粉器噴撒至步驟（2）得到的抗病性待檢煙苗的葉表面，之后采用手指蘸取本氏煙TSWV毒源汁液，用一只手托住待接種抗病性待檢煙苗葉片，另一只手從待接種抗病性待檢煙苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦本氏煙TSWV毒源汁液；本氏煙TSWV毒源汁液的用量為每片葉50 ul
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片1次，接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養(yǎng)一天，之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
每7天調(diào)查一次抗病性待檢煙苗的病害，并計算煙苗番茄斑萎病毒的發(fā)病率a，共調(diào)查3次，分抗、感性植株，以最高一次發(fā)病率調(diào)查結(jié)果作為該品種煙苗的病情進行統(tǒng)計；發(fā)病率a=（該品種感病植株數(shù)量/該品種總植株數(shù)量）×100%。發(fā)病率a=0為免疫品種，發(fā)病率0＜a≤25%為抗病品種，發(fā)病率25%＜a≤100%為感病品種。
步驟（5）中病害調(diào)查采用的方法為血清學(xué)檢測和癥狀觀察；
血清學(xué)檢測時，采集抗病性待檢煙苗植株的葉片利用番茄斑萎病毒試紙條或者番茄斑萎病毒抗體進行ELISA檢測，呈陽性則表示為感病植株，反之則為抗病植株；
癥狀觀察時，感病植株癥狀包括：系統(tǒng)葉出現(xiàn)壞死斑、皺縮、黃化，植株矮小，發(fā)病后期整株壞死。
實施例2
一種抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法，包括如下步驟：
步驟（1），本氏煙育苗：將本氏煙種子播于帶煙草漂浮育苗基質(zhì)的漂浮育苗盤中育苗35-40天，剔除弱苗，挑選出長勢整齊一致的幼苗，并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的本氏煙幼苗；
步驟（2），抗病性待檢煙苗育苗：在本氏煙播種15天后，將擬進行抗病性鑒定的煙草種子播于帶煙草漂浮育苗基質(zhì)的漂浮育苗盤中育苗35-40天，剔除弱苗，挑選出長勢整齊一致的幼苗，并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的抗病性待檢煙苗；
步驟（3），接種緩沖液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸緩沖液，121℃滅菌20分鐘；在接種前半個小時內(nèi)，每100 mL磷酸緩沖液加入0.2 g亞硫酸鈉，10 uL beta-巰基乙醇，配成TSWV接種緩沖液，放置冰上，備用；
步驟（4），本氏煙煙苗接種：將田間獲得經(jīng)過TSWV試紙條檢測的TSWV毒源接種于步驟（1）獲得的本氏煙幼苗；所述的TSWV毒源帶TSWV病毒的煙草葉片；
具體步驟如下：
取TSWV毒源2g，放于研缽中，加入10mL步驟（3）獲得的TSWV接種緩沖液和3g 300-400目金剛砂，充分研磨至混合均勻，得到TSWV毒源汁液；
接種前戴一次性乳膠手套操作；
選擇長成且還未衰老的葉片進行接種，接種時，首先將粒徑為200-400目金剛砂按照每片葉0.2g的用量均勻的采用噴粉器噴撒至本氏煙幼苗的葉表面，之后采用一次性的棉簽蘸取取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接種本氏煙幼苗葉片，另一只手從待接種本氏煙幼苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量為每片葉100ul；
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片2次，接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養(yǎng)一天，之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
15天后，采集本氏煙苗上表現(xiàn)番茄斑萎病毒癥狀的葉片和/或莖干作為本氏煙TSWV毒源直接進行步驟（5）操作或保存于-80℃冰箱備用；
表現(xiàn)番茄斑萎病毒癥狀為葉片皺縮，輕微黃化褪綠，莖干彎曲。
步驟（5），抗病性鑒定：取步驟（4）獲得的本氏煙TSWV毒源2g放于研缽中，加入10mL步驟（3）獲得的TSWV接種緩沖液和3g 300-400目金剛砂，充分研磨至混合均勻，得到本氏煙TSWV毒源汁液；
接種前戴一次性乳膠手套；
選擇長成且還未衰老的葉片進行接種，接種時，首先將粒徑為300-400目金剛砂按照每片葉0.2g的用量均勻的采用噴粉器噴撒至步驟（2）得到的抗病性待檢煙苗的葉表面，之后采用一次性的棉簽蘸取本氏煙TSWV毒源汁液，用一只手托住待接種抗病性待檢煙苗葉片，另一只手從待接種抗病性待檢煙苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦本氏煙TSWV毒源汁液；本氏煙TSWV毒源汁液的用量為每片葉100 ul
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片2次，接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養(yǎng)一天，之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
每7天調(diào)查一次抗病性待檢煙苗的病害，并計算煙苗番茄斑萎病毒的發(fā)病率a，共調(diào)查4次，分抗、感性植株，以最高一次發(fā)病率調(diào)查結(jié)果作為該品種煙苗的病情進行統(tǒng)計；發(fā)病率a=（該品種感病植株數(shù)量/該品種總植株數(shù)量）×100%。發(fā)病率a=0為免疫品種，發(fā)病率0＜a≤25%為抗病品種，發(fā)病率25%＜a≤100%為感病品種。
步驟（5）中病害調(diào)查采用的方法為分子生物學(xué)檢測和癥狀觀察；
分子生物學(xué)檢測時，提取植株總RNA，利用番茄斑萎病毒特異性引物進行RT-PCR檢測，呈陽性則表示為感病植株，反之則為抗病植株。
癥狀觀察時，感病植株癥狀包括：系統(tǒng)葉出現(xiàn)壞死斑、皺縮、黃化，植株矮小，發(fā)病后期整株壞死。
實施例3
一種抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法，包括如下步驟：
步驟（1），本氏煙育苗：將本氏煙種子播于帶煙草漂浮育苗基質(zhì)的漂浮育苗盤中育苗32-38天，剔除弱苗，挑選出長勢整齊一致的幼苗，并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的本氏煙幼苗；
步驟（2），抗病性待檢煙苗育苗：在本氏煙播種15天后，將擬進行抗病性鑒定的煙草種子播于帶煙草漂浮育苗基質(zhì)的漂浮育苗盤中育苗32-38天，剔除弱苗，挑選出長勢整齊一致的幼苗，并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的抗病性待檢煙苗；
步驟（3），接種緩沖液的配制：配制0.1M pH7.0的磷酸緩沖液，121℃滅菌20分鐘；在接種前半個小時內(nèi)，每100 mL磷酸緩沖液加入0.2 g亞硫酸鈉，10 uL beta-巰基乙醇，配成TSWV接種緩沖液，放置冰上，備用；
步驟（4），本氏煙煙苗接種：將田間獲得經(jīng)過TSWV試紙條檢測的TSWV毒源接種于步驟（1）獲得的本氏煙幼苗；所述的TSWV毒源帶TSWV病毒的煙草葉片；
具體步驟如下：
取TSWV毒源1.2g，放于研缽中，加入8mL步驟（3）獲得的TSWV接種緩沖液和2.5g 200-400目金剛砂，充分研磨至混合均勻，得到TSWV毒源汁液；
接種前戴一次性乳膠手套操作；
選擇長成且還未衰老的葉片進行接種，接種時，首先將粒徑為200-400目金剛砂按照每片葉0.13g的用量均勻的采用噴粉器噴撒至本氏煙幼苗的葉表面，之后采用棉球蘸取取TSWV毒源汁液，用一只手托住待接種本氏煙幼苗葉片，另一只手從待接種本氏煙幼苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦TSWV毒源汁液；TSWV毒源汁液的用量為每片葉65ul；
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片2次，接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養(yǎng)一天，之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
15天后，采集本氏煙苗上表現(xiàn)番茄斑萎病毒癥狀的葉片和/或莖干作為本氏煙TSWV毒源直接進行步驟（5）操作或保存于-80℃冰箱備用；
表現(xiàn)番茄斑萎病毒癥狀為葉片皺縮，輕微黃化褪綠，莖干彎曲。
步驟（5），抗病性鑒定：取步驟（4）獲得的本氏煙TSWV毒源1.7g放于研缽中，加入6mL步驟（3）獲得的TSWV接種緩沖液和2.6g 200-400目金剛砂，充分研磨至混合均勻，得到本氏煙TSWV毒源汁液；
接種前戴一次性乳膠手套；
選擇長成且還未衰老的葉片進行接種，接種時，首先將粒徑為200-400目金剛砂按照每片葉0.16g的用量均勻的采用噴粉器噴撒至步驟（2）得到的抗病性待檢煙苗的葉表面，之后采用一次性的棉簽蘸取本氏煙TSWV毒源汁液，用一只手托住待接種抗病性待檢煙苗葉片，另一只手從待接種抗病性待檢煙苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦本氏煙TSWV毒源汁液；本氏煙TSWV毒源汁液的用量為每片葉75 ul
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片1次，接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養(yǎng)一天，之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續(xù)培養(yǎng)；
每7天調(diào)查一次抗病性待檢煙苗的病害，并計算煙苗番茄斑萎病毒的發(fā)病率a，共調(diào)查3次，分抗、感性植株，以最高一次發(fā)病率調(diào)查結(jié)果作為該品種煙苗的病情進行統(tǒng)計；發(fā)病率a=（該品種感病植株數(shù)量/該品種總植株數(shù)量）×100%。發(fā)病率a=0為免疫品種，發(fā)病率0＜a≤25%為抗病品種，發(fā)病率25%＜a≤100%為感病品種。
步驟（5）中病害調(diào)查采用的方法為分子生物學(xué)檢測和癥狀觀察；
分子生物學(xué)檢測時，提取植株總RNA，利用番茄斑萎病毒特異性引物進行RT-PCR檢測，呈陽性則表示為感病植株，反之則為抗病植株。
癥狀觀察時，感病植株癥狀包括：系統(tǒng)葉出現(xiàn)壞死斑、皺縮、黃化，植株矮小，發(fā)病后期整株壞死。
應(yīng)用實例1
采用與實施例3相同的方法，擬進行抗病性鑒定的煙草種子為紅花大金元、烤煙品種K326、花煙草（Nicotiana alata）和花煙草與烤煙雜交后代Polalta。
同時采用常規(guī)方法作為對比，即以田間采集新鮮毒源直接接種。
試驗結(jié)果見表1。
表1 烤煙品種紅花大金元、烤煙品種K326、花煙草（Nicotiana alata）和花煙草與烤煙雜交后代Polalta的抗病性鑒定結(jié)果
用本發(fā)明的本氏煙TSWV毒源后接種紅花大金元、K326、N. alata和Polalta各30株，發(fā)病株分別為30株，30株，0株和0株，發(fā)病率分別為100%，100%，0%和0%，其中N. alata和Polalta對TSWV免疫，發(fā)病率為0%；紅花大金元、K326發(fā)病率均為100%，為感病品種；
而用田間采集新鮮毒源接種紅花大金元、K326、N. alata和Polalta各30株，發(fā)病株分別為23株，21株，0株和0株，發(fā)病率分別為77%，70%，0%和0%。
應(yīng)用實例2
采用與實施例1相同的方法，擬進行抗病性鑒定的煙草種子為紅花大金元、烤煙品種K326、花煙草（Nicotiana alata）和花煙草與烤煙雜交后代Polalta。
同時采用常規(guī)方法作為對比，即以田間采集新鮮毒源直接接種。
試驗結(jié)果見表2。
表2烤煙品種紅花大金元、烤煙品種K326、花煙草（Nicotiana alata）和花煙草與烤煙雜交后代Polalta的抗病性鑒定結(jié)果
用本發(fā)明的-80℃保存后本氏煙TSWV毒源后接種紅花大金元、K326、N. alata和Polalta各30株，發(fā)病株分別為30株，30株，0株和0株，發(fā)病率分別為100%，100%，0%和0%，其中N. alata和Polalta對TSWV免疫，發(fā)病率為0%；紅花大金元、K326發(fā)病率均為100%，為感病品種；
而用田間采集新鮮毒源接種紅花大金元、K326、N. alata和Polalta各30株，發(fā)病株分別為20株，20株，0株和0株，發(fā)病率分別為67%，67%，0%和0%。
應(yīng)用例1和應(yīng)用例2，可以看出本發(fā)明的準(zhǔn)確率較高，而常規(guī)方法對不發(fā)病的植株無法完全確定其抗感性，因此，本方法極大增強了對于單株篩選的確定性，且利于后續(xù)的研發(fā)生產(chǎn)工作。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。