本發(fā)明涉及到生物材料玻璃化保存中的降/復(fù)溫領(lǐng)域，具體為一種面向玻璃化保存的降復(fù)溫工質(zhì)驅(qū)動(dòng)裝置及其控制方法。

背景技術(shù)：

低溫保存是眾多生物材料目前唯一有效的長(zhǎng)期保存手段，在國(guó)計(jì)民生的眾多領(lǐng)域都發(fā)揮著不可替代的作用。在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，越來越多的疾病可以通過細(xì)胞和組織的移植而得到醫(yī)治，大規(guī)模的低溫保存則是解決這些重要生物材料臨床供應(yīng)問題的重要手段。低溫保存的生物材料需要經(jīng)歷從常溫至低溫的跨越，這一過程中冰晶生長(zhǎng)是保存成功的最大障礙。玻璃化保存是一種革命性的新方法，在玻璃化保存的過程中生物樣品內(nèi)不產(chǎn)生(或僅產(chǎn)生極少量)冰晶，溶液的濃度無明顯變化，過冷時(shí)間短，因此能有效避免各種因素導(dǎo)致的低溫?fù)p傷，相對(duì)傳統(tǒng)方法有原理性的突破。

為了獲得玻璃化轉(zhuǎn)變所需的超高降復(fù)溫速率，標(biāo)準(zhǔn)方法中使用細(xì)管(French Mini-straw,0.25ml)承載微量樣品并直接投入液氮(-196℃)，通過樣品與液氮間的巨大的溫差以及液氮在細(xì)管表面的汽化作用驅(qū)動(dòng)樣品迅速降溫，在復(fù)溫環(huán)節(jié)，則將細(xì)管直接投入恒溫水浴(約30℃)中，以樣品和溫水間的溫差驅(qū)動(dòng)樣品快速升溫。在此基礎(chǔ)上，Vajta等人改進(jìn)了細(xì)管的結(jié)構(gòu)，提出了開放式拉長(zhǎng)細(xì)管法(Open Pulled Straw，OPS)，所得到的降溫速率大大提高。Reubinnoff也應(yīng)用了這種方法首次成功進(jìn)行了干細(xì)胞玻璃化低溫保存中，后續(xù)研究對(duì)這種方法進(jìn)行了持續(xù)的改進(jìn)，先后出現(xiàn)了封口式拉長(zhǎng)細(xì)管法(Closed Pulled Straw，CPS)、微量吸頭法(Micropipette)、Cryotop及Cryotip等方法。

無論結(jié)構(gòu)如何改進(jìn)，以上方法中承載樣品的各種容器在降溫或復(fù)溫過程中都會(huì)對(duì)樣品與工作液體，如制冷劑(液氮)或復(fù)溫劑(溫水)間的換熱起一定的熱阻作用。為了消除容器的影響，另一部分研究中采用了直接接觸的方式，即使得微量樣品與制冷劑或復(fù)溫劑直接接觸，實(shí)現(xiàn)更高的換熱效率。典型方法包電鏡網(wǎng)法(Electron Mmicroscope Grids，EMG)、冷環(huán)法(Cryoloop)等，分別用精細(xì)的銅網(wǎng)及尼龍環(huán)承載微量的細(xì)胞。近期研究中還出現(xiàn)一種細(xì)胞微滴法(Micro Droplet，MD)，利用微流控芯片生成包裹細(xì)胞的微滴，并直接滴入到液氮中降溫。這類方法能獲得較高的降復(fù)溫速率，但需要解決細(xì)胞的回收及直接接觸帶來的污染問題。

總的來說，雖然玻璃化保存方法研究已經(jīng)取得了一系列成果，但現(xiàn)有降復(fù)溫技術(shù)仍不成熟，表現(xiàn)在：

(1)換熱效率有限?，F(xiàn)有的降溫方法從本質(zhì)上來說都是通過樣品在液氮中的池沸騰(Pool boiling)來獲得較高的降溫速率，但池沸騰過程中會(huì)產(chǎn)生大量的液氮蒸汽包裹在樣品周圍，對(duì)進(jìn)一步的降溫產(chǎn)生隔熱的作用，因此換熱系數(shù)一般較低；對(duì)復(fù)溫過程來說，現(xiàn)有復(fù)溫方法一般通過樣品與恒溫水浴間的溫差驅(qū)動(dòng)升溫，換熱效率更低，而且隨著樣品溫度回升、溫差減小，復(fù)溫速率迅速衰減，很容易產(chǎn)生反玻璃化等問題；

(2)操作偶然因素影響大。將樣品浸入液氮實(shí)現(xiàn)降溫和投入恒溫浴實(shí)現(xiàn)復(fù)溫的方式，工質(zhì)被動(dòng)的作用于生物樣品或載體，降復(fù)溫速率難以控制，缺乏穩(wěn)定性和一致性，并且無法調(diào)節(jié)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述存在的問題或不足，為了解決玻璃化保存中存在的換熱效率有限、操作偶然因素影響大等問題，本發(fā)明提供了一種面向玻璃化保存的降復(fù)溫工質(zhì)驅(qū)動(dòng)裝置及其控制方法。

具體技術(shù)方案如下：

該面向玻璃化保存的降復(fù)溫工質(zhì)驅(qū)動(dòng)裝置，包括高壓惰性氣體輸入端、壓力調(diào)節(jié)閥、球閥、降復(fù)溫工質(zhì)容器、樣品段和儲(chǔ)液槽，通過導(dǎo)管采用串聯(lián)的方式將上述部件依次進(jìn)行連接，如圖1所示。

本發(fā)明利用高壓惰性氣體作為驅(qū)動(dòng)，驅(qū)動(dòng)降復(fù)溫容器中的降復(fù)溫工質(zhì)高速運(yùn)動(dòng)通過樣品段，并作用在樣品或其載體上，從而實(shí)現(xiàn)樣品的降復(fù)溫。

另外，使用壓力調(diào)節(jié)閥調(diào)節(jié)輸入至降復(fù)溫工質(zhì)容器的高壓惰性氣體的壓強(qiáng)，使用球閥用于開關(guān)，控制輸入高壓惰性氣體的通斷。并可通過壓力調(diào)節(jié)閥調(diào)整驅(qū)動(dòng)壓強(qiáng)的方式實(shí)現(xiàn)降復(fù)溫速率的調(diào)節(jié)。

所述高壓惰性氣體輸入端通入的高壓惰性氣體為壓強(qiáng)在0.1Mpa及以上的氮?dú)狻?/p>

所述導(dǎo)管，其內(nèi)壁為聚四氟乙烯材質(zhì)，能夠耐受‐200℃低溫，外部包裹隔熱材料，隔熱材料材質(zhì)為泡沫。

所述樣品段，存放需要玻璃化保存的樣品或其載體，并設(shè)有入口和出口；設(shè)有降復(fù)溫工質(zhì)的流道，降復(fù)溫工質(zhì)在樣品段中高速運(yùn)動(dòng)過程中作用在樣品上進(jìn)行高強(qiáng)度換熱。

所述降復(fù)溫工質(zhì)，包含液氮和酒精溶液，其中液氮用于降溫，酒精溶液用于復(fù)溫。

所述降復(fù)溫工質(zhì)容器，儲(chǔ)存降復(fù)溫工質(zhì)。降復(fù)溫工質(zhì)容器由外部高強(qiáng)度外殼和內(nèi)部的保溫材料組成，并帶有輸入端口和輸出端口，其中輸入端口聯(lián)通內(nèi)部空間的頂層，輸出端口接通內(nèi)部空間的底部，當(dāng)輸入端口接通高壓惰性氣體時(shí)，降復(fù)溫工質(zhì)容器中的降復(fù)溫工質(zhì)在高壓作用下經(jīng)輸出端口高速輸出。降復(fù)溫工質(zhì)容器的輸出端口通過導(dǎo)管與樣品段入口相連。使用時(shí)降復(fù)溫工質(zhì)不接觸降復(fù)溫工質(zhì)容器的輸入端口，淹沒降復(fù)溫工質(zhì)容器的輸出端口

所述壓力調(diào)節(jié)閥，調(diào)節(jié)輸入至降復(fù)溫工質(zhì)容器輸入端口的高壓惰性氣體的壓強(qiáng)，壓力調(diào)節(jié)閥壓強(qiáng)調(diào)節(jié)范圍為0.1Mpa至20Mpa。

所述球閥，用于開關(guān)，控制輸入至降復(fù)溫工質(zhì)容器的高壓惰性氣體的通斷。

所述儲(chǔ)液槽是一容器，通過導(dǎo)管與樣品段的出口相連，用于收集通過樣品段后的降復(fù)溫工質(zhì)。

上述面向玻璃化保存的降復(fù)溫工質(zhì)驅(qū)動(dòng)裝置的降復(fù)溫過程如下：

通過高壓惰性氣體驅(qū)動(dòng)降復(fù)溫工質(zhì)容器中的降復(fù)溫工質(zhì)，使降復(fù)溫工質(zhì)高速運(yùn)動(dòng)并作用在樣品段內(nèi)的樣品或其載體上，實(shí)現(xiàn)樣品的超高速降復(fù)溫。

本發(fā)明利用高壓惰性氣體驅(qū)動(dòng)技術(shù)，提出了一種面向玻璃化保存的降復(fù)溫工質(zhì)驅(qū)動(dòng)裝置及其控制方法。該方法旨在通過高壓惰性氣體來驅(qū)動(dòng)降復(fù)溫工質(zhì)高速運(yùn)動(dòng)并作用在樣品或其載體上，作用方式變被動(dòng)為主動(dòng)。從而實(shí)現(xiàn)更高的換熱效率以及更好的過程穩(wěn)定性和一致性。此外，通過調(diào)節(jié)高壓氣體的壓強(qiáng)，可改變工質(zhì)的作用速率，從而實(shí)現(xiàn)降復(fù)溫速率的大范圍調(diào)節(jié)，可適應(yīng)不同對(duì)象保存的需求。解決了傳統(tǒng)玻璃化保存降復(fù)溫工質(zhì)被動(dòng)方式作用于樣品引起的諸多問題。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明以高壓惰性氣體作為驅(qū)動(dòng)力，驅(qū)動(dòng)降復(fù)溫工質(zhì)來實(shí)現(xiàn)樣品的玻璃化保存，變現(xiàn)有的被動(dòng)的作用方式為主動(dòng)，大大提高了低溫保存的穩(wěn)定性和一致性。

(2)本發(fā)明通過壓力調(diào)節(jié)閥來調(diào)整驅(qū)動(dòng)壓強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品降復(fù)溫速率的大范圍調(diào)節(jié)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的結(jié)構(gòu)及其控制方法示意圖；

圖2是本發(fā)明的降復(fù)溫工質(zhì)容器示意圖；

圖3是實(shí)施例的示意圖；

圖4是實(shí)施例的降溫測(cè)試結(jié)果示意圖；

圖5是實(shí)施例的復(fù)溫測(cè)試結(jié)果示意圖；

附圖標(biāo)記：1高壓惰性氣體輸入端，2壓力調(diào)節(jié)閥，3球閥，4降復(fù)溫工質(zhì)容器，5降復(fù)溫工質(zhì)，6樣品段，7儲(chǔ)液槽，8導(dǎo)管，9熱電偶，10數(shù)據(jù)采集卡，11計(jì)算機(jī)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

如圖3所示，一種面向玻璃化保存的降復(fù)溫工質(zhì)驅(qū)動(dòng)裝置與控制方法示意圖，包括1高壓惰性氣體輸入端，2壓力調(diào)節(jié)閥，3球閥，4降復(fù)溫工質(zhì)容器，5降復(fù)溫工質(zhì)，6樣品段，7儲(chǔ)液槽，8導(dǎo)管，9熱電偶，10數(shù)據(jù)采集卡，11計(jì)算機(jī)。

本實(shí)施例使用的高壓惰性氣體為壓強(qiáng)在0.1Mpa及以上的氮?dú)狻?/p>

導(dǎo)管8內(nèi)壁為聚四氟乙烯材質(zhì)，能夠耐受‐200℃低溫，外部包裹隔熱材料，隔熱材料材質(zhì)為泡沫。

樣品段6存放需要玻璃化保存的樣品或其載體，樣品段有入口和出口。

降復(fù)溫工質(zhì)5包含液氮和酒精溶液，其中液氮用于降溫，酒精溶液用于復(fù)溫。

E、降復(fù)溫工質(zhì)容器

使用降復(fù)溫工質(zhì)容器4儲(chǔ)存降復(fù)溫工質(zhì)5。降復(fù)溫工質(zhì)容器4的輸入端口聯(lián)通內(nèi)部空間的頂層，輸出端口接通內(nèi)部空間的底部，當(dāng)輸入端口接通高壓惰性氣體時(shí)，降復(fù)溫工質(zhì)容器4中的降復(fù)溫工質(zhì)5在高壓作用下經(jīng)輸出端口高速輸出。降復(fù)溫工質(zhì)容器的輸出端口通過導(dǎo)管8與樣品段6入口相連。

壓力調(diào)節(jié)閥2調(diào)節(jié)輸入至降復(fù)溫工質(zhì)容器4輸入端口的高壓惰性氣體的壓強(qiáng)，壓力調(diào)節(jié)閥壓強(qiáng)調(diào)節(jié)范圍為0.1Mpa至20Mpa。

球閥3控制輸入至降復(fù)溫工質(zhì)容器4中高壓惰性氣體的通斷。

儲(chǔ)液槽7通過導(dǎo)管8與樣品段6出口相連。

I、溫度數(shù)據(jù)采集模塊

溫度數(shù)據(jù)采集模塊由熱電偶、數(shù)據(jù)采集卡、計(jì)算機(jī)組成，熱電偶探頭插入步驟D中樣品內(nèi)，將信號(hào)傳輸至數(shù)據(jù)采集卡，并通過計(jì)算機(jī)處理輸出。

J、降復(fù)溫過程

通過高壓惰性氣體驅(qū)動(dòng)降復(fù)溫工質(zhì)容器4中的降復(fù)溫工質(zhì)5，使降復(fù)溫工質(zhì)5高速運(yùn)動(dòng)并作用在樣品段6內(nèi)的樣品或其載體上，實(shí)現(xiàn)樣品的超高速降復(fù)溫。

步驟如下：

a)按上述步驟完成本發(fā)明裝置的的組裝。

b)往降復(fù)溫工質(zhì)容器中添加液氮。

c)調(diào)節(jié)壓力調(diào)節(jié)閥使輸入至降復(fù)溫工質(zhì)容器中的高壓惰性氣體壓強(qiáng)為0.1Mpa(0.2Mpa,0.3Mpa,0.4Mpa,0.5Mpa,0.6Mpa,0.7Mpa)。

d)使用溫度數(shù)據(jù)采集模塊進(jìn)行溫度數(shù)據(jù)采集。

e)使用球閥控制輸入高壓惰性氣體通路，10秒后，使用球閥控制輸入高壓惰性氣體斷路，完成樣品降溫過程。

f)樣品段從裝置中取出放入液氮罐中保存。

g)取出在液氮罐中保存的樣品段，完成本發(fā)明裝置的組裝。

h)往降復(fù)溫工質(zhì)容器中添加37℃85％的酒精溶液。

i)調(diào)節(jié)壓強(qiáng)調(diào)節(jié)裝置使高壓惰性氣體壓強(qiáng)為0.1Mpa(0.2Mpa,0.3Mpa,0.4Mpa,0.5Mpa,0.6Mpa,0.7Mpa)。

j)使用溫度數(shù)據(jù)采集模塊進(jìn)行溫度數(shù)據(jù)采集。

k)使用球閥控制輸入高壓惰性氣體通路，10秒后，使用球閥控制輸入高壓惰性氣體斷路，完成樣品復(fù)溫過程

圖4是樣品在不同壓強(qiáng)下的降溫速率。圖5是樣品在不同壓強(qiáng)下的復(fù)溫速率。

由結(jié)果可以看出，對(duì)于降溫過程，驅(qū)高壓惰性氣體壓強(qiáng)的增加使得流過樣品段的液氮流速變快，強(qiáng)化了裝置換熱效果。當(dāng)高壓惰性氣體壓強(qiáng)為0.1Mpa時(shí)，樣品的降溫速率降溫速率達(dá)30000℃/min，而當(dāng)高壓惰性氣體壓強(qiáng)提高到0.6Mpa時(shí)，降溫速率約為47698℃/min,這說明了本發(fā)明可以通過實(shí)驗(yàn)操作條件的控制實(shí)現(xiàn)大范圍調(diào)節(jié)玻璃化保存降溫速率。通過在統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)條件下多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(次數(shù)≥3)，降溫速率偏差可控制在10％左右，這說明本發(fā)明在玻璃化保存降溫過程中具有穩(wěn)定性和一致性。

對(duì)于復(fù)溫過程，高壓惰性氣體壓強(qiáng)的增加使得流過微樣品段的酒精流速變快，強(qiáng)化裝置換熱效果。當(dāng)高壓惰性氣體壓強(qiáng)為0.1Mpa時(shí)，復(fù)溫速率達(dá)16438℃/min；而當(dāng)高壓惰性氣體壓強(qiáng)提升到0.7Mpa時(shí)，復(fù)溫速率達(dá)到約47965℃/min，這說明本發(fā)明可以通過實(shí)驗(yàn)操作條件的控制實(shí)現(xiàn)大范圍調(diào)節(jié)玻璃化保存復(fù)溫速率。通過在統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)條件下的多次實(shí)驗(yàn)(次數(shù)≥3)，復(fù)溫速率偏差可控制在10％左右，這說明本發(fā)明在玻璃化保存復(fù)溫過程中具有穩(wěn)定性和一致性。