本發(fā)明涉及大百合無性繁殖技術(shù)，具體涉及一種提前打破大百合休眠的方法。

背景技術(shù)：

大百合（Cardiocrinum giganteum（Wall.）Makino），又名百合蓮、百洼等，莖卵形，葉紙質(zhì)網(wǎng)狀脈，花白色狹喇叭形，蒴果近球形。原產(chǎn)中國(guó)，因其植株粗壯、高大，顯著區(qū)別于百合屬植物而得名。是我國(guó)南方常用的野生民間草藥，球徑可入藥，有性味淡，平。清熱止咳，寬胸利氣。用于肺癆咯血，咳嗽痰喘，小兒高燒，胃痛及反胃，嘔吐功能；另外球徑可編淀粉含量較高可曬干后磨粉直接食用。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，當(dāng)前以大百合為原料生產(chǎn)的純天然、安全、保健的食品品和醫(yī)藥用品需求量極大，而大量的采集勢(shì)必造成野生大百合資源的日益枯竭。因此，推進(jìn)人工繁殖育苗的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，縮短休眠周期，對(duì)滿足制藥行業(yè)的需求，實(shí)現(xiàn)資源可持續(xù)發(fā)展有著積極的意義。

大百合的繁殖方法主要為主要用分球法繁殖，其次可用鱗片扦插。由于大百合球莖休眠時(shí)間較長(zhǎng)，所以大百合規(guī)?；a(chǎn)就受到限制。因此，開發(fā)一種有效的提前打破大百合休眠的方法非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能克服大百合球莖休眠時(shí)間過長(zhǎng)的問題方法，為下一步的增殖培養(yǎng)提供量足、質(zhì)優(yōu)的無菌材料，促進(jìn)大百合在生產(chǎn)過程中快速繁殖體系的建立。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種提前打破大百合休眠的方法，包括外植體獲取、外植體消毒、外植體低溫處理和芽誘導(dǎo)培養(yǎng)工序，采集秋季生長(zhǎng)發(fā)育成熟大百合小球作為外植體，通過對(duì)外植體無菌消毒、低溫處理后，置于適宜的溫度、濕度和光照強(qiáng)度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽的萌發(fā)；其主要操作步驟為：

（1）外植體獲?。翰杉锛旧L(zhǎng)發(fā)育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內(nèi)；

（2）外植體消毒：對(duì)大百合小球進(jìn)行洗滌預(yù)處理后，再用化學(xué)試劑進(jìn)行消毒處理；

（3）外植體低溫處理：將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為3-5℃的冰箱或冷庫中低溫處理，放置40-50天；

（4）芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：將步驟（3）低溫處理的大百合小球接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，再置于適宜的條件下進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，誘導(dǎo)芽萌發(fā)。

以上步驟（2）中所述的洗滌預(yù)處理的方法是將得到的大百合小球及時(shí)用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸低濃度的洗潔精溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內(nèi)并置于流水中，沖洗15-20min。

以上所述的低濃度的洗潔精溶液是體積濃度為1.5-3.0%的洗潔精水溶液。

以上步驟（2）中所述的消毒處理的方法是將洗滌預(yù)處理后的大百合小球置于干凈燒杯內(nèi)，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶?jī)?nèi)倒入福爾馬林溶液滅菌液進(jìn)行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動(dòng)三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。

以上步驟（3）中所述的低溫處理在將大百合小球放入冰箱或冷庫的過程中，必須保證每個(gè)大百合小球之間不發(fā)生接觸。

以上步驟（4）中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+1.5-2.0 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

以上步驟（4）中所述的室內(nèi)培養(yǎng)條件為白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃，采用日光燈培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1600-1800lx，光照時(shí)數(shù)10h?d^{- 1}。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

1、本發(fā)明的一種提前打破大百合休眠的方法，利用球莖材料，在室內(nèi)繁殖幼苗，不受季節(jié)限制，既可以滿足生產(chǎn)上的數(shù)量需求，又可保持母本性狀，并有效克服大百合生產(chǎn)過程中球莖休眠時(shí)間的過長(zhǎng)的問題，縮短大百合休眠時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了大百合的規(guī)?；a(chǎn)。

2、本發(fā)明的一種提前打破大百合休眠的方法，通過對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理和消毒滅菌后，放入于冰箱進(jìn)行低溫處理，外植體發(fā)芽率較好，萌發(fā)時(shí)間為縮短3-4個(gè)月左右，可滿足下一步的增殖培養(yǎng)的需要。

3、本發(fā)明的一種提前打破大百合休眠的方法，采用秋天生長(zhǎng)發(fā)育成熟的小球作為外植體，保證了外植體活力。

4、本發(fā)明的一種提前打破大百合休眠的方法，材料易得，成本低，方法簡(jiǎn)單，操作方便，質(zhì)量保證，能實(shí)現(xiàn)大百合快速繁殖體系的建立，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：

一種提前打破大百合休眠的方法，在9月初采集生長(zhǎng)發(fā)育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內(nèi)，及時(shí)用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸體積濃度為1.5%的洗潔精水溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內(nèi)并置于流水中，沖洗15min。將洗滌預(yù)處理后的大百合小球置于干凈燒杯內(nèi)，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶?jī)?nèi)倒入福爾馬林溶液滅菌液進(jìn)行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動(dòng)三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為3℃的冰箱中低溫處理，放置40天。在將大百合小球放入冰箱的過程中，必須保證每個(gè)大百合小球之間不發(fā)生接觸。將低溫處理的大百合小球接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將接種后的外植體置于白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃的室內(nèi)，采用日光燈培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1600-1800lx，光照時(shí)數(shù)10h?d^{- 1}，誘導(dǎo)芽萌發(fā)。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+1.5 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

7d后調(diào)查，外植體發(fā)芽率為87.6%，芽苗生長(zhǎng)正常。

實(shí)施例2：

一種提前打破大百合休眠的方法，在10月中旬采集生長(zhǎng)發(fā)育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內(nèi)，及時(shí)用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸體積濃度為2.0%的洗潔精水溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內(nèi)并置于流水中，沖洗15min。將洗滌預(yù)處理后的大百合小球置于干凈燒杯內(nèi)，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶?jī)?nèi)倒入福爾馬林溶液滅菌液進(jìn)行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動(dòng)三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為3℃的冰箱或冷庫中低溫處理，放置45天。在將大百合小球放入冰箱的過程中，必須保證每個(gè)大百合小球之間不發(fā)生接觸。將低溫處理的大百合小球接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將接種后的外植體置于白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃的室內(nèi)，采用日光燈培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1600-1800lx，光照時(shí)數(shù)10h?d^{- 1}，誘導(dǎo)芽萌發(fā)。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+2.0 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

7d后調(diào)查，外植體發(fā)芽率為90.6%，芽苗生長(zhǎng)正常。

實(shí)施例3：

一種提前打破大百合休眠的方法，于11月上旬采集生長(zhǎng)發(fā)育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內(nèi)，及時(shí)用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸體積濃度為2.5%的洗潔精水溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內(nèi)并置于流水中，沖洗20min。將洗滌預(yù)處理后的大百合小球置于干凈燒杯內(nèi)，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶?jī)?nèi)倒入福爾馬林溶液滅菌液進(jìn)行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動(dòng)三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為5℃的冷庫中低溫處理，放置50天。在將大百合小球放入冰箱的過程中，必須保證每個(gè)大百合小球之間不發(fā)生接觸。將低溫處理的大百合小球接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將接種后的外植體置于白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃的室內(nèi)，采用日光燈培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1600-1800lx，光照時(shí)數(shù)10h?d^{- 1}，誘導(dǎo)芽萌發(fā)。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+1.5 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

7d后調(diào)查，外植體發(fā)芽率為90.8%，芽苗生長(zhǎng)正常。

實(shí)施例4：

一種提前打破大百合休眠的方法，在12月上旬采集生長(zhǎng)發(fā)育成熟的大百合小球作為外植體，將采集得到的大百合小球放入封口袋，立即帶回室內(nèi)，及時(shí)用自來水沖洗2-3遍，再用脫脂棉蘸體積濃度為3.0%的洗潔精水溶液擦拭大百合小球，最后將大百合小球裝入紗布袋內(nèi)并置于流水中，沖洗20min。將洗滌預(yù)處理后的大百合小球置于干凈燒杯內(nèi)，用無菌水清洗2-3次，然后將大百合小球轉(zhuǎn)到超凈工作臺(tái)上，置入滅菌過的廣口三角瓶，迅速向瓶?jī)?nèi)倒入福爾馬林溶液滅菌液進(jìn)行滅菌消毒，充分浸沒大百合小球后加蓋蓋好瓶口，輕輕晃動(dòng)三角瓶3-5min，然后將滅菌液倒出，然后立即將大百合小球倒入無菌水輕攪漂洗3次，每次不少于2min。將消毒后的大百合小球用無菌吸水紙吸干表面水分，然后再將大百合小球放入溫度為5℃的冷庫中低溫處理，放置45天。在將大百合小球放入冰箱的過程中，必須保證每個(gè)大百合小球之間不發(fā)生接觸。將低溫處理的大百合小球接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，將接種后的外植體置于白天溫度20 ±2℃，夜間溫度 14 ±2 ℃的室內(nèi)，采用日光燈培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1600-1800lx，光照時(shí)數(shù)10h?d^{- 1}，誘導(dǎo)芽萌發(fā)。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂+2.0 mg/L 6-BA+10mg/L維生素C+0.05mg/LNAA。

7d后調(diào)查，外植體發(fā)芽率為89.2%，芽苗生長(zhǎng)正常。