本發(fā)明屬于害蟲生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用宿主種群內(nèi)各家系對(duì)不同微生物敏感性差異互補(bǔ)控制斜紋夜蛾的方法。
二、技術(shù)背景
昆蟲病原微生物是害蟲生物防治的重要組成部分，主要包括細(xì)菌、真菌及病毒等，一些病原微生物可在自然環(huán)境下調(diào)節(jié)害蟲的種群數(shù)量。昆蟲對(duì)病原微生物表現(xiàn)出豐富的表型多樣性，這種多樣性受宿主遺傳異質(zhì)性大小的影響。病原微生物在遺傳異質(zhì)性低的宿主種群比遺傳異質(zhì)性高的宿主種群中更易流行，后者對(duì)病原微生物的敏感性更為多樣化(Elton 1958，Leonard 1969，Hamilton 1987，Sherman et al.1988，Schmid-Hempel 1998)。宿主種群遺傳異質(zhì)性高可減慢病原微生物的流行，但這也受病原微生物株系影響(Boomsma and Ratnieks，1996；Van Baalen and Beekman，2006)。在大型水蚤中，發(fā)現(xiàn)病原微生物的流行水平與種群遺傳多樣性和病原微生物株系多樣性均相關(guān)，在所有宿主種群中，病原微生物株系多樣性越豐富，其在宿主種群中流行水平越高。在遺傳多樣性豐富低的宿主種群中，當(dāng)受多種病原微生物侵染時(shí)，較遺傳性低的宿主種群，其流行水平更低(Ganz等，2010)。
然而關(guān)于病原微生物在昆蟲種群中的流行受宿主遺傳異質(zhì)性和寄生物株系多樣性影響的研究僅局限于大型水蚤等少數(shù)昆蟲中，并且也主要關(guān)注宿主種群間遺傳異質(zhì)性以及同類寄生物多種株系間差異，對(duì)許多農(nóng)業(yè)重大害蟲病原微生物流行與宿主種群遺傳異質(zhì)性及不同類別微生物關(guān)系等還未有報(bào)道，更沒有合理利用它們進(jìn)行害蟲控制的有效方法。而當(dāng)前殺蟲微生物在生產(chǎn)上的應(yīng)用普遍存在控害效果不高的問題，揭示重大農(nóng)業(yè)害蟲種群內(nèi)各家系或種群間與殺蟲微生物敏感性差異等關(guān)系，不僅能夠豐富害蟲與殺蟲微生物協(xié)同進(jìn)化理論，還可以獲得合理有效利用殺蟲微生物進(jìn)行害蟲防控的方法，提升害蟲生物防治水平。
斜紋夜蛾屬鱗翅目夜蛾科害蟲，其食性雜、食量大、繁殖力強(qiáng)，近年來在我國不少地區(qū)常暴發(fā)成災(zāi)，給蔬菜生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。已發(fā)現(xiàn)自然界中斜紋夜蛾可感染斜紋夜蛾核型多角體病毒(SpltNPV)等病毒(任彬元等，2014)，也發(fā)現(xiàn)其還可以感染萊氏野村菌等真菌(鐘萬芳等，2015)。比較研究斜紋夜蛾同一種群內(nèi)不同家系對(duì)殺蟲真菌萊氏野村菌、殺蟲細(xì)菌粘質(zhì)沙雷氏菌以昆蟲病毒敏感性，以了解害蟲種群內(nèi)不同家系對(duì)微生物敏感性的差異是否一致，可明確害蟲與殺蟲微生物的協(xié)同進(jìn)化策略，同時(shí)也為合理高效利用害蟲對(duì)不同殺蟲微生物敏感性差異提供依據(jù)，對(duì)于創(chuàng)新和高效利用殺蟲微生物防治農(nóng)業(yè)重大害蟲至關(guān)重要。
三、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
1、發(fā)明目的
提供一種利用宿主種群內(nèi)各家系對(duì)不同微生物敏感性差異互補(bǔ)控制斜紋夜蛾的方法，能有效提高殺蟲微生物的控害效果，提升害蟲的生物防治水平。
2、技術(shù)方案
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明選用能侵染害蟲的細(xì)菌、真菌和病毒等不同類微生物，比較分析其對(duì)害蟲種群內(nèi)不同家系的致病力，明確各類微生物對(duì)害蟲不同家系致病力是否存在差異，且差異是否不同，利用宿主種群內(nèi)各家系對(duì)微生物敏感性差異互補(bǔ)，篩選對(duì)各家系致病力最高的微生物種類，組合它們控制害蟲。
本發(fā)明為一種利用宿主種群內(nèi)各家系對(duì)不同微生物敏感性差異互補(bǔ)控制斜紋夜蛾的方法，其特征在于利用萊氏野村菌、粘質(zhì)沙雷氏菌和斜紋夜蛾核型多角體病毒對(duì)斜紋夜蛾各家系敏感性差異的互作來控制斜紋夜蛾，提升害蟲生物防治水平。
3、有益效果
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，產(chǎn)生以下有益效果：與當(dāng)前單種殺蟲微生物控制害蟲相比，有效地提升了害蟲生物防治水平。
四、具體實(shí)施方式：
本發(fā)明的實(shí)施例是采用室內(nèi)生物測定方法。
供試材料
斜紋夜蛾：斜紋夜蛾A、B和C三個(gè)家系為斜紋夜蛾安徽和縣種群中通過單對(duì)配對(duì)所建立，在室內(nèi)用人工飼料進(jìn)行繼代飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度為27±1℃，光周期14L：10D，蟲卵用2％甲醛消毒，幼蟲在3齡前群體飼養(yǎng)，3齡后單獨(dú)飼養(yǎng)。
粘質(zhì)沙雷氏菌：本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存，于2012年8月從江蘇省南京市田間采集自然感病的褐飛虱中分離。在超凈臺(tái)上用滅菌挑針挑取菌落單一的粘質(zhì)沙雷氏菌放置無菌水中，并稀釋成不同濃度，用移液槍吸取100μl菌液至在LB(胰蛋白胨1％，氯化鈉1％，酵母提取物0.5％，瓊脂2％)培養(yǎng)基上，采取涂板的方法進(jìn)行培養(yǎng)。在溫度為25±1℃的恒溫箱中培養(yǎng)，待48h平板上形成完整典型菌落后，挑取不同單孢菌落中心移至新的LB培養(yǎng)基上進(jìn)一步分離純化和擴(kuò)大培養(yǎng)，備用。
萊氏野村菌：由罹病斜紋夜蛾幼蟲蟲體上分離得到，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，備用。
斜紋夜蛾核型多角體病毒：SpltNPV和縣株從安徽和縣田間感染斜紋夜蛾中分離出，室內(nèi)在斜紋夜蛾幼蟲中繁殖，病毒多角體純化后放于4℃冰箱備用。
試驗(yàn)方法
萊氏野村菌分生孢子液的制備：將分生孢子粉刮到一個(gè)三角瓶中，加入10mL的0.05％吐溫-80及少量的玻璃珠，充分振蕩后過濾，除去菌絲和雜質(zhì)。利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法，把分生孢子配成實(shí)驗(yàn)需要的108孢子/ml懸浮液。
粘質(zhì)沙雷氏菌液的配制：在超凈臺(tái)中用已滅菌的挑針刮取已純化培養(yǎng)好的粘質(zhì)沙雷氏菌平板，加少量無菌水制成原液，顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后將原液稀釋至濃度為107cfu/ml的菌液。
斜紋夜蛾核型多角體病毒多角體懸浮液的配制：將在斜紋夜蛾活體上繁殖的SpltNPV經(jīng)差速離心，獲得純化多角體，加無菌水配成原液，顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后將原液稀釋至5×106pIB/ml懸浮劑。
生物測定：采用飼料喂毒法進(jìn)行生物測定。將大小一致的斜紋夜蛾3齡幼蟲置于六孔板中，每孔1頭，每孔中加入一塊體積為64立方毫米的正方體人工飼料，用移液器將20μL真菌液或10μL病毒液或10μL細(xì)菌液加入飼料上，同時(shí)設(shè)有清水對(duì)照組，每處理10個(gè)板，每兩板為一個(gè)重復(fù)。置于溫度為27±1℃和光周期為14L：10D的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行飼養(yǎng)，每天定時(shí)觀察，記錄各板的病死和非病死蟲數(shù)。
應(yīng)用SPSS軟件對(duì)殺蟲微生物作用后的致死率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
實(shí)施例
分別比較研究了斜紋夜蛾3個(gè)家系對(duì)殺蟲細(xì)菌粘質(zhì)沙雷氏菌、殺蟲真菌萊氏野村菌以及斜紋夜蛾核型多角體病毒的敏感性。發(fā)現(xiàn)三個(gè)家系對(duì)同種微生物的敏感性不同，但這種敏感性差異因微生物不同而異。斜紋夜蛾3個(gè)家系對(duì)108孢子/ml萊氏野村菌的敏感性存在差異，家系A(chǔ)的死亡率為23.3％，顯著高于家系B(8.3％)，但與家系C無顯著差異(F2，14＝4.294，P＝0.039)。3個(gè)家系對(duì)107cfu/ml粘質(zhì)沙雷氏菌的敏感性同樣有顯著差異，家系A(chǔ)，B和C的死亡率分別為13.3％、20％和10％，其中對(duì)家系B的死亡率顯著高于家系C，而與家系A(chǔ)無顯著差異(F2，14＝4.308，P＝0.039)。3個(gè)家系對(duì)5×106PIB/ml斜紋夜蛾核型多角體病毒的敏感性也存在顯著差異，其中以家系C最敏感，害蟲的死亡率高達(dá)93.3％，顯著高于家系C的死亡率(55％)，與家系A(chǔ)無顯著差異(F2，14＝8.667，P＝0.005)。
綜合斜紋夜蛾種群內(nèi)三個(gè)家系對(duì)不同微生物的敏感性，可看出對(duì)真菌、細(xì)菌和病毒的敏感性最高的家系分別為家系A(chǔ)、B和C，要實(shí)現(xiàn)對(duì)害蟲的高效控制，需利用宿主種群內(nèi)各家系對(duì)不同微生物敏感性差異互補(bǔ)，篩選出對(duì)各家系致病力最高的微生物組合控制害蟲。因此，利用萊氏野村菌、粘質(zhì)沙雷氏菌和斜紋夜蛾核型多角體病毒來組合控制斜紋夜蛾，可提升害蟲生物防治水平。
表1斜紋夜蛾不同家系對(duì)三種微生物的敏感性比較
注：同一行數(shù)字后相同字母表示5％水平上無顯著差異。