本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

植物免疫誘抗劑也叫植物疫苗，是一類新型生物農(nóng)藥，具有顯著防病、防凍、增產(chǎn)、改善品質(zhì)的效果，對(duì)人畜無害、不污染環(huán)境。是繼人用疫苗、動(dòng)物疫苗后，疫苗工程技術(shù)出現(xiàn)的新領(lǐng)域，也是國(guó)際上生物農(nóng)藥創(chuàng)制較為熱門的研究方向。

植物免疫誘抗劑對(duì)農(nóng)作物病蟲害沒有直接的殺滅作用，而是由外源生物或分子通過誘導(dǎo)或激活植物所產(chǎn)生的抗性物質(zhì)，對(duì)某些病原物產(chǎn)生抗性或抑制病菌的生長(zhǎng)。當(dāng)其施用在農(nóng)作物上后，通過誘導(dǎo)農(nóng)作物產(chǎn)生抵御或防控農(nóng)作物病蟲害的物質(zhì)，從而達(dá)到防治病蟲害的目的。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前，國(guó)內(nèi)已經(jīng)在農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所獲得正式登記的植物免疫誘抗劑主要有康壯素(蛋白質(zhì)激發(fā)子)、益微菌(枯草芽孢桿菌)、殼寡糖和脫落酸等藥物品種。有關(guān)植物免疫誘抗劑的研究與利用，目前也已經(jīng)得到了政府有關(guān)管理和推廣部門及廣大農(nóng)民的認(rèn)可，其在保護(hù)植物健康生長(zhǎng)、保障食品和生態(tài)安全方面發(fā)揮著越來越重要的作用。未來，植物免疫誘抗劑農(nóng)藥將有望成為具有巨大發(fā)展前景的新型戰(zhàn)略產(chǎn)業(yè)。

幾丁質(zhì)是已被確定的具有激發(fā)子活性的寡糖之一。幾丁質(zhì)有大量的來源，最為主要的來源為蝦蟹殼，其含量為20％～40％，充分利用蝦蟹殼來源，開發(fā)更為高效的幾丁質(zhì)植物免疫誘抗劑具有一定的市場(chǎng)前景。目前，利用幾丁質(zhì)制備植物免疫誘抗劑已有少量研究。中國(guó)專利CN105746591A公開了一種利用蟹殼制備植物免疫誘抗劑的方法，該專利對(duì)蟹殼中的幾丁質(zhì)進(jìn)行酯化并以此作為植物免疫誘抗劑的主體。然而，從蟹殼中直接提取幾丁質(zhì)的水溶性較差，而且?guī)锥≠|(zhì)酯化會(huì)使水溶性的進(jìn)一步降低，使其移動(dòng)性受到限制，難以涉足長(zhǎng)距離信號(hào)的傳導(dǎo)過程，使具有激發(fā)子活性的幾丁質(zhì)片段難以更好發(fā)揮其有效作用，對(duì)植物誘導(dǎo)抗病性大幅降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)幾丁質(zhì)難以涉足長(zhǎng)距離信號(hào)的傳導(dǎo)、誘導(dǎo)植物抗病性不足的問題，本發(fā)明提供了一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑及其制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)的：

一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑，所述植物免疫誘抗劑包括如下重量配比的原料：改性幾丁質(zhì)3～8份、中藥提取物0.5～1份、磷酸鹽0.1～0.5份、有機(jī)酸0.1～0.5份、水50～150份。

優(yōu)選地，所述中藥提取物包括如下重量配比的原料：黃連3～8份、板藍(lán)根5～8份、黃芩5～10份、黃柏10～15份、大黃3～5份、魚腥草3～5份、大青葉3～5份、穿心蓮1～5份、五味子3～8份，其制備方法如下：將黃連、板藍(lán)根、黃芩、黃柏、大黃、魚腥草、大青葉、穿心蓮、五味子混合并以固液重量比1：30～40浸入40wt％～60wt％乙醇水溶液中，于70～80℃條件下保溫3～4小時(shí)后過濾，對(duì)過濾液進(jìn)行噴霧干燥，收集干燥物，即為中藥提取物。

優(yōu)選地，所述噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為80～90℃，入口溫度為300～320℃，離心噴霧頭轉(zhuǎn)速為8000～12000轉(zhuǎn)/分。

優(yōu)選地，所述磷酸鹽為磷酸氫鋁、磷酸銅、磷酸鈣、磷酸鐵和磷酸鎂中的一種或幾種。

優(yōu)選地，所述有機(jī)酸為水楊酸和茉莉酸中的一種或兩種。

優(yōu)選地，所述改性幾丁質(zhì)的制備步驟如下：

1)取蝦蟹殼、去其殘肉，洗凈，于80～90℃條件下烘干后，粉碎至100～150目，得蝦蟹殼粉末；

2)取蝦蟹殼粉末按固液重量比1：30～40浸入0.5～1.5mol/L的鹽酸溶液中，升溫至60～80℃并保溫4～6小時(shí)后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

3)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：20～30浸入5～10g/L的氫氧化鈉溶液中，升溫至40～60℃并保溫4～6小時(shí)后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

4)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：20～30浸入10wt％～15wt％的雙氧水溶液中，升溫至80～100℃并保溫2～4小時(shí)后過濾，以水沖洗并于80～90℃條件下烘干，即得蝦蟹幾丁質(zhì)；

5)將蝦蟹幾丁質(zhì)以固液重量比1：4～6浸入40wt％～50wt％的氫氧化鈉溶液中，將混合溶液裝入不銹鋼容器中，通入氮?dú)?，升溫?0～80℃，保溫72～96小時(shí)，過濾，除去堿液，以水將蝦蟹幾丁質(zhì)洗至中性，于80～90℃條件下烘干后，即得脫乙酰幾丁質(zhì)；

6)取脫乙酰幾丁質(zhì)以固液重量比1：30～50溶于飽和碳酸氫銨溶液中，于室溫下靜置50～100h后，升溫至60～70℃，保溫1～2小時(shí)，真空濃縮該反應(yīng)液并進(jìn)行真空冷凍干燥，即得銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)；

7)稱取銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)加入等重量的二氯乙酸酐，于30～40℃下反應(yīng)6～8小時(shí)后，加入銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)重量5～8倍的水，于70～90℃下反應(yīng)6～8小時(shí)后，真空濃縮該反應(yīng)液并進(jìn)行真空冷凍干燥，即得改性幾丁質(zhì)。

幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁多糖的主要成分，植物幾丁質(zhì)酶的釋放的可溶性幾丁質(zhì)片段起到激發(fā)子的作用。然而幾丁質(zhì)水溶性較差，整體移動(dòng)性受到限制，不能涉足長(zhǎng)距離信號(hào)傳導(dǎo)過程，在本發(fā)明中，發(fā)明人通過結(jié)構(gòu)修飾制得具有良好生物活性的改性幾丁質(zhì)(I)，提高了幾丁質(zhì)的移動(dòng)性，使較長(zhǎng)距離信號(hào)傳導(dǎo)成為可能。

在本發(fā)明的植物免疫誘抗劑中，除了改性幾丁質(zhì)外，更引入了磷酸鹽、有機(jī)酸和中藥提取物。磷酸鹽的金屬離子可使離子通道發(fā)生變化，離子通道在原生質(zhì)膜去極化和激發(fā)子信號(hào)傳統(tǒng)過程中起到積極的作用；本發(fā)明所使用的有機(jī)酸為水楊酸和茉莉酸，水楊酸與茉莉酸為植物的內(nèi)源激發(fā)子，將這兩種有機(jī)酸作為外源激發(fā)子施用于植物之上，同樣可誘導(dǎo)植物提高抗病能力；此外，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)已遭受病原菌侵染的植物治愈，本發(fā)明添加了具有抗菌、殺菌活性的中藥提取物，結(jié)果顯示，中藥提取物的輔助作用進(jìn)一步提高了植物免疫誘抗劑的使用效果。

優(yōu)選地，步驟6)或步驟7)的真空濃縮的條件為：溫度為70～80℃，真空度為-0.08～-0.06MPa，時(shí)間為1～2小時(shí)；步驟6)或步驟7)的真空冷凍干燥的條件為：溫度-60～-40℃，真空度為-0.08～-0.06MPa，時(shí)間為96～120小時(shí)。

一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑的制備方法，所述植物免疫誘抗劑的制備方法為：按重量配比將改性幾丁質(zhì)、中藥提取物、磷酸鹽、有機(jī)酸、水混合，均質(zhì)后，對(duì)混合溶液進(jìn)行噴霧干燥，收集干燥物，即為植物免疫誘抗劑。

優(yōu)選地，所述噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為80～90℃，入口溫度為300～320℃，離心噴霧頭轉(zhuǎn)速為8000～12000轉(zhuǎn)/分。

本發(fā)明公開的一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑及其制備方法，其有益效果為：1)對(duì)源于蝦蟹殼的幾丁質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，制得一種具有長(zhǎng)距離傳導(dǎo)信號(hào)能力、高誘導(dǎo)植物抗性的改性幾丁質(zhì)，以此為主要成份的植物免疫誘抗劑對(duì)多種病原菌侵染具有積極的免疫效果，尤其是對(duì)番茄的根腐菌、甲疫病菌效果顯著，其病害發(fā)生率小于5％；2)本發(fā)明所制得的植物免疫誘抗劑免疫作用時(shí)間長(zhǎng)，與植物有較好的相容性，可被植物吸收或自行降解，對(duì)環(huán)境無污染。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明申請(qǐng)所述的一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑及其制備方法。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑，包括如下重量配比的原料：改性幾丁質(zhì)3Kg、中藥提取物0.5Kg、磷酸鈣0.1Kg、水楊酸0.1Kg、水50Kg，其制備方法為：按原料的重量稱取改性幾丁質(zhì)、中藥提取物、磷酸鈣、水楊酸、水混合，均質(zhì)后，對(duì)混合溶液進(jìn)行噴霧干燥，收集干燥物，即為植物免疫誘抗劑。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為80℃，入口溫度為300℃，離心噴霧頭轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分。

在本實(shí)施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，改性幾丁質(zhì)的制備步驟如下：

1)取蝦蟹殼、去其殘肉，洗凈，于80℃條件下烘干后，粉碎至100目，得蝦蟹殼粉末；

2)取20Kg蝦蟹殼粉末按固液重量比1：30浸入600Kg的0.5mol/L鹽酸溶液中，升溫至60℃并保溫4小時(shí)后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

3)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：20浸入5g/L的氫氧化鈉溶液中，升溫至40℃并保溫4小時(shí)后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

4)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：20浸入10wt％的雙氧水溶液中，升溫至80℃并保溫2小時(shí)后過濾，以水沖洗并于80℃條件下烘干，即得蝦蟹幾丁質(zhì)；

5)將蝦蟹幾丁質(zhì)以固液重量比1：4浸入40wt％的氫氧化鈉溶液中，將混合溶液裝入不銹鋼容器中，通入氮?dú)猓郎刂?0℃，保溫72小時(shí)，過濾，除去堿液，以水將蝦蟹幾丁質(zhì)洗至中性，于80℃條件下烘干后，即得脫乙酰幾丁質(zhì)；

6)取脫乙酰幾丁質(zhì)以固液重量比1：30溶于飽和碳酸氫銨溶液中，于室溫下靜置50h后，升溫至60℃，升溫1小時(shí)，真空濃縮該反應(yīng)液并進(jìn)行真空冷凍干燥，即得銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)；真空濃縮的條件為：溫度為70℃，真空度為-0.08MPa，時(shí)間為1小時(shí)；真空冷凍干燥的條件為：溫度-60℃，真空度為-0.08MPa，時(shí)間為96小時(shí)；

7)稱取銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)加入等重量的二氯乙酸酐，于30℃下反應(yīng)6小時(shí)后，加入銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)重量5倍的水，于70℃下反應(yīng)6小時(shí)后，真空濃縮該反應(yīng)液并進(jìn)行真空冷凍干燥，即得改性幾丁質(zhì)6.3Kg。真空濃縮的條件為：溫度為70℃，真空度為-0.08MPa，時(shí)間為1小時(shí)；真空冷凍干燥的條件為：溫度-60℃，真空度為-0.08MPa，時(shí)間為96小時(shí)。

在本實(shí)施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，中藥提取物包括如下重量的原料：黃連3Kg、板藍(lán)根5Kg、黃芩5Kg、黃柏10Kg、大黃3Kg、魚腥草3Kg、大青葉3Kg、穿心蓮1Kg、五味子3Kg，其制備方法如下：將黃連、板藍(lán)根、黃芩、黃柏、大黃、魚腥草、大青葉、穿心蓮、五味子混合并以固液重量比1：30浸入40wt％乙醇水溶液中，于70℃條件下保溫3小時(shí)后過濾，對(duì)過濾液進(jìn)行噴霧干燥，收集干燥物，即為中藥提取物0.57Kg。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為80℃，入口溫度為300℃，離心噴霧頭轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分。

實(shí)施例2

本實(shí)施例一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑，包括如下重量配比的原料：改性幾丁質(zhì)8Kg、中藥提取物1Kg、磷酸氫鋁0.5Kg、茉莉酸0.5Kg、水150Kg，其制備方法為：按原料的重量稱取改性幾丁質(zhì)、中藥提取物、磷酸氫鋁、茉莉酸、水混合，均質(zhì)后，對(duì)混合溶液進(jìn)行噴霧干燥，收集干燥物，即為植物免疫誘抗劑。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為90℃，入口溫度為320℃，離心噴霧頭轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分。

在本實(shí)施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，改性幾丁質(zhì)的制備步驟如下：

1)取蝦蟹殼、去其殘肉，洗凈，于90℃條件下烘干后，粉碎至150目，得蝦蟹殼粉末；

2)取20Kg蝦蟹殼粉末按固液重量比1：40浸入800Kg的1.5mol/L鹽酸溶液中，升溫至80℃并保溫6小時(shí)后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

3)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：30浸入10g/L的氫氧化鈉溶液中，升溫至60℃并保溫6小時(shí)后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

4)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：30浸入15wt％的雙氧水溶液中，升溫至100℃并保溫4小時(shí)后過濾，以水沖洗并于90℃條件下烘干，即得蝦蟹幾丁質(zhì)；

5)將蝦蟹幾丁質(zhì)以固液重量比1：6浸入50wt％的氫氧化鈉溶液中，將混合溶液裝入不銹鋼容器中，通入氮?dú)?，升溫?0℃，保溫96小時(shí)，過濾，除去堿液，以水將蝦蟹幾丁質(zhì)洗至中性，于90℃條件下烘干后，即得脫乙酰幾丁質(zhì)；

6)取脫乙酰幾丁質(zhì)以固液重量比1：50溶于飽和碳酸氫銨溶液中，于室溫下靜置100h后，升溫至70℃，保溫2小時(shí)，真空濃縮該反應(yīng)液并進(jìn)行真空冷凍干燥，即得銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)；真空濃縮的條件為：溫度為80℃，真空度為-0.06MPa，時(shí)間為2小時(shí)；真空冷凍干燥的條件為：溫度-40℃，真空度為-0.06MPa，時(shí)間為120小時(shí)；

7)稱取銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)加入等重量的二氯乙酸酐，于40℃下反應(yīng)8小時(shí)后，加入銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)重量8倍的水，于90℃下反應(yīng)8小時(shí)后，真空濃縮該反應(yīng)液并進(jìn)行真空冷凍干燥，即得改性幾丁質(zhì)6.3Kg。真空濃縮的條件為：溫度為80℃，真空度為-0.06MPa，時(shí)間為2小時(shí)；真空冷凍干燥的條件為：溫度-40℃，真空度為-0.06MPa，時(shí)間為120小時(shí)。

在本實(shí)施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，中藥提取物包括如下重量的原料：黃連8Kg、板藍(lán)根8Kg、黃芩10Kg、黃柏15Kg、大黃5Kg、魚腥草5Kg、大青葉5Kg、穿心蓮5Kg、五味子8Kg，其制備方法如下：將黃連、板藍(lán)根、黃芩、黃柏、大黃、魚腥草、大青葉、穿心蓮、五味子混合并以固液重量比1：40浸入60wt％乙醇水溶液中，于80℃條件下保溫4小時(shí)后過濾，對(duì)過濾液進(jìn)行噴霧干燥，收集干燥物，即為中藥提取物1.3Kg。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為90℃，入口溫度為320℃，離心噴霧頭轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分。

實(shí)施例3

本實(shí)施例一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑，包括如下重量配比的原料：改性幾丁質(zhì)6Kg、中藥提取物0.8Kg、磷酸鎂0.2Kg、磷酸鈣0.2Kg、水楊酸0.2Kg、茉莉酸0.2Kg、水100Kg，其制備方法為：按原料的重量稱取改性幾丁質(zhì)、中藥提取物、磷酸鎂、磷酸鈣、水楊酸、茉莉酸、水混合，均質(zhì)后，對(duì)混合溶液進(jìn)行噴霧干燥，收集干燥物，即為植物免疫誘抗劑。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為85℃，入口溫度為310℃，離心噴霧頭轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分。

在本實(shí)施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，改性幾丁質(zhì)的制備步驟如下：

1)取蝦蟹殼、去其殘肉，洗凈，于85℃條件下烘干后，粉碎至130目，得蝦蟹殼粉末；

2)取20Kg蝦蟹殼粉末按固液重量比1：35浸入700Kg的1.0mol/L鹽酸溶液中，升溫至70℃并保溫5小時(shí)后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

3)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：25浸入8g/L的氫氧化鈉溶液中，升溫至50℃并保溫5小時(shí)后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

4)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：25浸入12wt％的雙氧水溶液中，升溫至90℃并保溫3小時(shí)后過濾，以水沖洗并于85℃條件下烘干，即得蝦蟹幾丁質(zhì)；

5)將蝦蟹幾丁質(zhì)以固液重量比1：5浸入45wt％的氫氧化鈉溶液中，將混合溶液裝入不銹鋼容器中，通入氮?dú)?，升溫?5℃，保溫84小時(shí)，過濾，除去堿液，以水將蝦蟹幾丁質(zhì)洗至中性，于85℃條件下烘干后，即得脫乙酰幾丁質(zhì)；

6)取脫乙酰幾丁質(zhì)以固液重量比1：40溶于飽和碳酸氫銨溶液中，于室溫下靜置75h后，升溫至65℃，并保持1.5小時(shí)，真空濃縮該反應(yīng)液并進(jìn)行真空冷凍干燥，即得銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)；真空濃縮的條件為：溫度為75℃，真空度為-0.07MPa，時(shí)間為1.5小時(shí)；真空冷凍干燥的條件為：溫度-50℃，真空度為-0.07MPa，時(shí)間為108小時(shí)；

7)稱取銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)加入等重量的二氯乙酸酐，于35℃下反應(yīng)7小時(shí)后，加入銨基化脫乙酰幾丁質(zhì)重量7倍的水，于80℃下反應(yīng)7小時(shí)后，真空濃縮該反應(yīng)液并進(jìn)行真空冷凍干燥，即得改性幾丁質(zhì)6.1Kg。真空濃縮的條件為：溫度為75℃，真空度為-0.07MPa，時(shí)間為1.5小時(shí)；真空冷凍干燥的條件為：溫度-50℃，真空度為-0.07MPa，時(shí)間為108小時(shí)。

在本實(shí)施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，中藥提取物包括如下重量的原料：黃連6Kg、板藍(lán)根7Kg、黃芩8Kg、黃柏12Kg、大黃4Kg、魚腥草4Kg、大青葉4Kg、穿心蓮3Kg、五味子5Kg，其制備方法如下：將黃連、板藍(lán)根、黃芩、黃柏、大黃、魚腥草、大青葉、穿心蓮、五味子混合并以固液重量比1：35浸入50wt％乙醇水溶液中，于75℃條件下保溫3.5小時(shí)后過濾，對(duì)過濾液進(jìn)行噴霧干燥，收集干燥物，即為中藥提取物0.9Kg。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為85℃，入口溫度為310℃，離心噴霧頭轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)施例所制備的植物免疫誘抗劑的使用效果，請(qǐng)參見如下應(yīng)用實(shí)例：1、番茄品種“浙粉702”(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)

2、植物免疫誘抗劑的施用方式

2015年5月25日開始，對(duì)兩組(實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組)番茄進(jìn)行噴施，每組50株。實(shí)驗(yàn)組噴施由實(shí)施例1～3所制備的植物免疫誘抗劑水溶液(濃度為2g/L)，對(duì)照組噴施清水，每月噴施兩次，每株噴施30mL，其它肥料相同。2015年7月25日對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的每株番茄進(jìn)行檢查。結(jié)果如表1所示。

表1植物免疫誘抗劑對(duì)病害發(fā)生率的影響

由表1可知，與對(duì)照組(噴施清水)相比，所有實(shí)驗(yàn)組(噴施植物免疫誘抗劑)的番茄根浙粉702的根腐菌、甲疫病菌均有顯著下降，病害發(fā)生率為5％以下。