本發(fā)明屬于蘋果種植技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種提高蘋果轉(zhuǎn)基因材料再生效率的方法。

背景技術(shù)：

近年來，基因工程的發(fā)展為蘋果品種的遺傳改良提供了新的技術(shù)方法，拓寬了基因源，突破了種間界限，能從動植物及微生物中分離各種功能基因用于遺傳改良，縮短育種周期，提高育種效率，為蘋果遺傳育種研究及利用各種遺傳種質(zhì)資源開辟了一條新的技術(shù)途徑。國外早在1991年就成功應(yīng)用icp基因轉(zhuǎn)化蘋果，1992美國批準(zhǔn)將攜帶由icp基因的轉(zhuǎn)基因蘋果植株進(jìn)行田間試驗；國內(nèi)達(dá)克東等也應(yīng)用cpti基因轉(zhuǎn)化了皇家嘎拉。受基因的控制，有些蘋果砧木在扦插和壓條繁殖時，生根極為困難，為了提高M(jìn)26砧木生根能力，lamber等將來自發(fā)根農(nóng)桿菌ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)導(dǎo)入M26中，結(jié)果攜帶有ri質(zhì)粒的T-DNA的轉(zhuǎn)化植株有良好的根系，生根能力大大提高。蘋果愈傷組織再生植株尚存在較大困難，葉片再生胚狀體還不夠成熟且周期較長，所以，探索適用于蘋果遺傳轉(zhuǎn)化的新材料是蘋果育種工作者亟待解決的問題之一。

綜上所述，現(xiàn)有蘋果轉(zhuǎn)基因材料大部分是皇家嘎啦和M26，由于其他材料的再生體系不成熟，尚未廣泛推廣應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因材料相對單一，另一方面，蘋果葉片再生能力差，再生植株的效率比較低。尋求一種再生效率高的蘋果轉(zhuǎn)基因材料是蘋果育種工作者亟待解決的問題之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提高蘋果轉(zhuǎn)基因材料再生效率的方法，旨在解決現(xiàn)有使用的蘋果轉(zhuǎn)基因材料是皇家嘎啦和M26，轉(zhuǎn)基因材料單一，葉片再生植株的效率較低的問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種提高蘋果轉(zhuǎn)基因材料再生效率的方法，所述提高蘋果轉(zhuǎn)基因材料再生效率的方法包括以下步驟：

步驟一，圓葉海棠組培苗在擴(kuò)繁培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個月，將莖基部的愈傷用手術(shù)刀切下，然后將再生的莖段移植到繼代培養(yǎng)基中；

步驟二，再生的莖段在擴(kuò)繁培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個月，取完全伸展的功能葉橫切中脈兩至三刀，農(nóng)桿菌侵染后轉(zhuǎn)接到預(yù)分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-4天后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2周后光下培養(yǎng)，直至長出抗性芽，期間可以更換培養(yǎng)基；

步驟三，將抗性芽移植到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)20-30天；

步驟四，挑選株高達(dá)到1.5cm的再生植株移植到生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)一個月作用進(jìn)行移栽。

進(jìn)一步，所述步驟一和步驟三光下培養(yǎng)的條件光照16h/d、光照2000lux，溫度為25℃，平均濕度為70–80％。

進(jìn)一步，所述繼代培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，由IBA 0.1mg/L，6-BA 0.6mg/L，瓊脂8g/L和蔗糖30g/L組成，pH為5.8。

進(jìn)一步，所述預(yù)分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、2.0mg/L N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.2mg/L吲哚丁酸、瓊脂8g/L和蔗糖30g/L組成，pH為5.8。

進(jìn)一步，所述分化培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，由2.0mg/L N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲、0.2mg/L吲哚丁酸、200mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素、瓊脂8g/L和蔗糖30g/L組成，pH為5.8。

進(jìn)一步，所述生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，由IBA0.9mg/L組成，pH為5.8。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述提高蘋果轉(zhuǎn)基因材料再生效率的方法種植的蘋果。

本發(fā)明提供的提高蘋果轉(zhuǎn)基因材料再生效率的方法，圓葉海棠是蘋果苗木最常用的一種基砧，其顯著特點是硬枝可扦插繁育、抗逆性強(qiáng)、嫁接親和力好根系發(fā)達(dá)，成活率90％以上，具有抗冷、抗旱、抗鹽堿、抗病蟲等優(yōu)良性狀，提高圓葉海棠的再生效率對于實際生產(chǎn)也具有十分重要的作用，圓葉海棠再生體系的建立有利于提高蘋果轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明能夠提高蘋果轉(zhuǎn)基因效率，解決蘋果轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化效率低的問題，為鑒定基因功能奠定基礎(chǔ)，此材料并對指導(dǎo)實際生產(chǎn)具有十分重要的意義；此材料離體葉片再生效率達(dá)到80.33％，擴(kuò)繁系數(shù)達(dá)到8.2，生根率達(dá)到96.38％。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的提高蘋果轉(zhuǎn)基因材料再生效率的方法流程圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的提高蘋果轉(zhuǎn)基因材料再生效率的方法包括以下步驟：

S101：圓葉海棠組培苗在擴(kuò)繁培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個月，將莖基部的愈傷用手術(shù)刀切下，然后將再生的莖段移植到新的培養(yǎng)基中；

S102：再生的莖段在擴(kuò)繁培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個月，取完全伸展的功能葉橫切中脈兩至三刀，農(nóng)桿菌侵染后轉(zhuǎn)接到預(yù)分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-4天后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)2周后光下培養(yǎng)，直至長出抗性芽；

S103：將抗性芽移植到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)20-30天；

S104：挑選株高達(dá)到1.5cm的再生植株移植到生根培養(yǎng)基，培養(yǎng)一個月作用進(jìn)行移栽。

所述組培室光照16h/d、光照2000lux，溫度為25℃，平均濕度為70–80％。

所述預(yù)分化培養(yǎng)基配方：MS培養(yǎng)基，2.0mg/L N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲,0.2mg/L吲哚丁酸，瓊脂8g/L，蔗糖30g/L，pH為5.8；分化培養(yǎng)基配方MS培養(yǎng)基，2.0mg/L N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲,0.2mg/L吲哚丁酸，200mg/L頭孢霉素，50mg/L卡那霉素，瓊脂8g/L,蔗糖30g/L，pH為5.8；繼代培養(yǎng)基配方：MS培養(yǎng)基，IBA0.1mg/L，6-BA 0.6mg/L，瓊脂8g/L,蔗糖30g/L，pH為5.8；生根培養(yǎng)基配方：1/2MS培養(yǎng)基，IBA0.9mg/L，pH為5.8。

表1圓葉海棠擴(kuò)繁系數(shù)和再生率統(tǒng)計表

擴(kuò)繁系數(shù)計算公式為：經(jīng)過一個繼代周期的培養(yǎng)后，每一棵圓葉海棠組培苗能穩(wěn)定地轉(zhuǎn)接多少棵的數(shù)目。

再生率計算公式為：(已分化的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100。

表2圓葉海棠生根率、根數(shù)目、根長度和根生物量統(tǒng)計

生根率計算公式為：(生根的組培苗數(shù)/全部的組培苗數(shù))×100。

根長度使用直尺測量。

根生物量計算公式：根長度×根數(shù)目。

圓葉海棠是蘋果苗木最常用的一種基砧，其顯著特點是硬枝可扦插繁育、抗逆性強(qiáng)、嫁接親和力好根系發(fā)達(dá)，成活率90％以上，具有抗冷、抗旱、抗鹽堿、抗病蟲等優(yōu)良性狀，提高圓葉海棠的再生效率對于實際生產(chǎn)也具有十分重要的作用，圓葉海棠再生體系的建立有利于提高蘋果轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化效率，此發(fā)明將為基因功能鑒定奠定良好的基礎(chǔ)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。