本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種間充質(zhì)干細胞中macf1基因條件性敲除小鼠模型的建立及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,mscs)，是一種具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細胞，這種干細胞能夠分化成硬骨、軟骨、脂肪和其他類型的細胞。而始于間充質(zhì)干細胞的硬骨形成過程在骨構(gòu)建、骨重建及骨折愈合中扮演著重要的角色。如果間充質(zhì)干細胞骨形成能力降低，必然導(dǎo)致相應(yīng)骨骼疾病的發(fā)生，例如骨骼發(fā)育延遲、骨不連、骨折愈合延遲、骨質(zhì)疏松癥等骨形成障礙性疾病。然而骨形成障礙是一個比較復(fù)雜的過程，其相關(guān)的分子機理目前還不十分清楚。

微管微絲交聯(lián)因子macf1，又名acf7，是一種新型的細胞骨架交聯(lián)分子，在細胞極化、細胞遷移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及維持組織的完整性中發(fā)揮著重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，macf1與模擬失重條件下骨形成細胞中的微管微絲交聯(lián)發(fā)生改變相關(guān)(qianar,etal.[j].bioelectromagnetics,2009oct.30(7):545–555)；而且，在macf1穩(wěn)定低表達的mc3t3-e1前成骨細胞株中，macf1低表達影響前成骨細胞的形態(tài)、抑制前成骨細胞的增殖(hulf,etal.[j].bmbrep.2015oct.48(10):583-8.)。

可見，macf1在骨形成中具有重要的作用，只是目前關(guān)于macf1對骨形成作用的研究還非常少，只限于細胞水平。而細胞水平的實驗研究僅僅基于離體細胞本身的微小環(huán)境，忽視了生命體本身的整體環(huán)境及各組織系統(tǒng)間的協(xié)調(diào)互作。因此，在細胞水平上不能直觀全面地研究macf1在骨形成中的作用。而且，基于現(xiàn)有研究技術(shù)，對于macf1在骨骼中功能的研究，僅構(gòu)建有在前成骨細胞系mc3t3-e1中使macf1低表達的穩(wěn)定細胞株(騫愛榮等.抑制小鼠macf1基因表達的shrna序列及其應(yīng)用[p].北京：cn104531700a,20150422.)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了彌補骨形成研究領(lǐng)域內(nèi)macf1基因在間充質(zhì)干細胞中條件性敲除動物模型的空缺，以在動物水平研究macf1對骨形成的作用，本發(fā)明提供一種間充質(zhì)干細胞中macf1基因條件性敲除小鼠模型的建立及其應(yīng)用。利用cre-loxp系統(tǒng)，通過macf1^flox/flox小鼠與cre酶僅在間充質(zhì)干細胞中特異性表達的prrx1^cre小鼠交配，最終獲得prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠，成功獲得間充質(zhì)干細胞中macf1基因條件性敲除的小鼠模型。所述動物模型的macf1基因條件性失活，造成所述動物模型中新生小鼠的顱骨發(fā)育延遲、成年小鼠的骨形成能力降低，是一種骨骼發(fā)育延遲、骨形成能力降低的小鼠動物模型。該模型可以作為研究macf1基因在骨骼發(fā)育及骨形成中功能的動物模型；同時還可用于研究顱骨發(fā)育不全以及骨質(zhì)疏松癥等骨形成障礙性疾病的發(fā)病機制，并用于篩選改善或治療此類疾病的候選物質(zhì)，具有重要的應(yīng)用價值。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案：一種間充質(zhì)干細胞中macf1基因條件性敲除小鼠模型的建立方法，其特點是包括以下步驟：

(1)選用macf1^flox/+小鼠自交，擴繁獲得純合子macf1^flox/flox小鼠；

(2)選用prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠與spf級c57bl/6j小鼠交配，擴繁獲得prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠；

(3)將獲得的macf1^flox/flox小鼠與獲得的prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得半敲prrx1^cre；macf1^flox/+小鼠；

(4)將獲得的半敲prrx1^cre；macf1^flox/+小鼠自交，獲得間充質(zhì)干細胞中條件性敲除基因macf1小鼠模型，即全敲prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠。

(5)對所得到的macf1^flox/flox小鼠、prrx1^cre小鼠以及prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠利用特異性引物通過pcr方法進行基因型的鑒定。

所述特異性引物為一對時，首選

引物macf1-ap179：5'-agcgtttggtgttgattcgagc-3'和

引物macf1-ap180：5'-ggcttgcaggtacaggaggtag-3'。

所述特異性引物為兩對時，首選

引物prrx1-icre-wt-f：5'-agcgtttggtgttgattcgagc-3'和

引物prrx1-icre-wt-r：5'-agtcccggtgactccagcag-3'；

引物prrx1-icre-wt-f：5'-agcgtttggtgttgattcgagc-3'和

引物icre-mut-r2：5'-ggcttgcaggtacaggaggtag-3'。

所述特異性引物為三對時，首選

引物macf1-ap179：5'-aaagaaacggaaatactggcc-3'和

引物macf1-ap180：5'-gcagcttaattctgccaaattc-3'；

引物prrx1-icre-wt-f：5'-agcgtttggtgttgattcgagc-3'和

引物prrx1-icre-wt-r：5'-agtcccggtgactccagcag-3'；

引物prrx1-icre-wt-f：5'-agcgtttggtgttgattcgagc-3'和

引物icre-mut-r2：5'-ggcttgcaggtacaggaggtag-3'。

所述間充質(zhì)干細胞中macf1基因條件性敲除小鼠模型的用途，其特征在于：

第一方面，所述小鼠模型用于研究macf1基因在骨骼發(fā)育及骨形成中的功能；

第二方面，所述小鼠模型用于研究macf1基因在骨形成細胞的骨架結(jié)構(gòu)及在其形態(tài)、增殖、遷移、分化和凋亡這些細胞生命活動中的作用；

第三方面，所述小鼠模型作為顱骨發(fā)育不全以及骨質(zhì)疏松癥等骨形成障礙性疾病發(fā)病機制研究的動物模型；

第四方面，所述小鼠模型用于篩選改善或治療顱骨發(fā)育不全以及骨質(zhì)疏松癥等骨形成障礙性疾病的候選藥物；

第五方面，所述小鼠模型用于研究macf1基因在間充質(zhì)干細胞成骨、成脂和成軟骨多項分化中的作用；

第六方面，所述小鼠模型用于研究macf1基因?qū)χ拘纬苫蜍浌切纬傻淖饔谩?/p>

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用cre-loxp系統(tǒng)，通過macf1^flox/flox小鼠與cre酶僅在間充質(zhì)干細胞中特異性表達的prrx1^cre小鼠交配，最終獲得prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠，成功獲得間充質(zhì)干細胞中macf1基因條件性敲除的小鼠模型。所述動物模型的macf1基因條件性失活，造成所述動物模型中新生小鼠的顱骨發(fā)育延遲、成年小鼠的骨形成能力降低，是一種骨骼發(fā)育延遲、骨形成能力降低的小鼠動物模型。該模型可以作為研究macf1基因在骨骼發(fā)育及骨形成中功能的動物模型；同時還可用于研究顱骨發(fā)育不全以及骨質(zhì)疏松癥等骨形成障礙性疾病的發(fā)病機制，并用于篩選改善或治療此類疾病的候選物質(zhì)，具有重要的應(yīng)用價值。

本發(fā)明運用所構(gòu)建的模型首次揭示了macf1基因促進骨形成的生物學(xué)功能，說明可以將微管微絲交聯(lián)因子macf1及其上下游生物傳導(dǎo)通路作為藥物治療骨骼發(fā)育延遲以及骨質(zhì)疏松癥等骨形成障礙性疾病的新靶點。

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作詳細說明。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1構(gòu)建的間充質(zhì)干細胞中macf1基因條件性敲除小鼠模型；

圖2是本發(fā)明實施例1獲得的macf1^flox/+小鼠的pcr基因型鑒定結(jié)果照片；

圖3是本發(fā)明實施例1獲得的prrx1^cre小鼠的pcr基因型鑒定結(jié)果照片；

圖4是本發(fā)明實施例1最終獲得的prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠的雙重pcr基因型鑒定結(jié)果照片；

圖5是本發(fā)明實施例2對條件性敲除macf1基因新生乳鼠骨架進行阿爾辛藍和茜素紅染色后骨形成差異明顯的顱骨部位照片；

圖6是本發(fā)明實施例2對條件性敲除macf1基因成年小鼠股骨進行microct掃描的結(jié)果照片；

圖7是本發(fā)明實施例3對條件性敲除macf1基因小鼠的原代間充質(zhì)干細胞進行成骨分化誘導(dǎo)后的茜素紅染色顯示的礦化結(jié)節(jié)照片。

具體實施方式

以下實施例參照圖1-7。

實施例1：構(gòu)建間充質(zhì)干細胞中macf1基因條件性敲除小鼠模型。

1.1實驗動物。

macf1^flox/+小鼠與prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠的飼養(yǎng)：

macf1^flox/+小鼠與prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠的飼養(yǎng)按照spf動物飼養(yǎng)標準執(zhí)行，經(jīng)隔離觀察未見異常后進入飼養(yǎng)區(qū)，嚴格按照spf動物管理相關(guān)規(guī)定進行實驗操作。

1.2macf1^flox/+小鼠基因型鑒定。

剪取小鼠腳趾，提取macf1^flox/+小鼠基因組dna，采用引物進行小鼠基因型鑒定；以小鼠macf1基因序列為模板，具體設(shè)計引物序列如下：

引物macf1-ap179：5’-aaagaaacggaaatactggcc-3’和

引物macf1-ap180：5'-gcagcttaattctgccaaattc-3’。

圖2的pcr鑒定結(jié)果顯示擴增出700bp和750bp兩條帶，700bp表明macf1基因未被loxp位點標記，750bp表明macf1基因被loxp位點標記，兩條帶同時出現(xiàn)，則表明macf1基因的兩條同源染色體有一條被loxp位點標記，由此證明獲得的小鼠為目標雜合子macf1^flox/+小鼠。

1.3prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定。

剪取小鼠腳趾，提取prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠基因組dna，采用兩對引物，通過雙重pcr方法對小鼠進行基因型鑒定；其中，一對引物以prrx1基因序列為模板，具體設(shè)計序列如下：

引物prrx1-icre-wt-f：5'-agcgtttggtgttgattcgagc-3'和

引物prrx1-icre-wt-r：5'-agtcccggtgactccagcag-3'；

另一對引物分別以prrx1基因序列、cre基因序列為模板，具體設(shè)計序列分別如下：

引物prrx1-icre-wt-f：5'-agcgtttggtgttgattcgagc-3'和

引物icre-mut-r2：5'-ggcttgcaggtacaggaggtag-3'。

圖3的雙重pcr鑒定結(jié)果顯示分別擴增獲得267bp和322bp共兩個條帶，表明cre基因存在于間充質(zhì)干細胞標志基因prrx1的一條同源染色體中，由此證明獲得的小鼠為目標雜合子的prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.4間充質(zhì)干細胞中條件性敲除macf1基因小鼠模型的構(gòu)建。

(1)選用macf1^flox/+小鼠與macf1^flox/+小鼠交配，用引物macf1-ap179、macf1-ap180對其子代進行基因型鑒定，獲得純合子macf1^flox/flox小鼠。

(2)選用prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠與spf級c57bl/6j小鼠交配，用引物prrx1-icre-wt-f、icre-mut-r2對其子代進行基因型鑒定，獲得prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠。

(3)根據(jù)cre-loxp系統(tǒng)構(gòu)建條件性敲除動物的原理，將獲得的macf1^flox/flox小鼠與prrx1^cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，獲得間充質(zhì)干細胞中條件性敲除基因macf1雜合子小鼠，即半敲prrx1^cre；macf1^flox/+小鼠；再利用prrx1^cre；macf1^flox/+小鼠進行自交，獲得間充質(zhì)干細胞中條件性敲除基因macf1小鼠，即全敲prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠，繁育過程中所得子代小鼠的基因型皆經(jīng)三重pcr方法篩選鑒定。

該三重pcr方法進行基因型鑒定所用的三對引物分別為：

引物macf1-ap179：5'-aaagaaacggaaatactggcc-3’和

引物macf1-ap180：5'-gcagcttaattctgccaaattc-3’；

引物prrx1-icre-wt-f：5'-agcgtttggtgttgattcgagc-3'和

引物prrx1-icre-wt-r：5'-agtcccggtgactccagcag-3'；

引物prrx1-icre-wt-f：5'-agcgtttggtgttgattcgagc-3'和

引物icre-mut-r2：5'-ggcttgcaggtacaggaggtag-3'。

圖4的三重pcr鑒定結(jié)果顯示分別獲得750bp、267bp和322bp共3個條帶。

由此表明構(gòu)建成功了間充質(zhì)干細胞中條件性敲除基因macf1小鼠，即全敲prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠。

將獲得的prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠與macf1^flox/flox小鼠交配，以獲得較多的prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠(實驗組小鼠)與macf1^flox/flox小鼠(對照組小鼠)，然后對7-9天子代小鼠剪腳趾提取基因組dna，通過引物macf1-ap179、macf1-ap180和引物prrx1-icre-wt-f、icre-mut-r2經(jīng)雙重pcr方法篩選鑒定子代小鼠基因型，理論上產(chǎn)生的后代有1/2的macf1^flox/flox子鼠和1/2的prrx1^cre；macf1^flox/flox子鼠。子鼠基因型確定后，用于間充質(zhì)干細胞中條件性敲除基因macf1小鼠模型的表型鑒定。

實施例2：間充質(zhì)干細胞中條件性敲除macf1基因小鼠表型的鑒定。

發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞中條件性敲除macf1小鼠的顱骨發(fā)育延遲，股骨骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏、骨形成能力降低。

2.1條件性敲除macf1基因?qū)π律∈箫B骨發(fā)育的影響。

選取出生后一天的prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠和macf1^flox/flox小鼠，解剖獲得全身骨架，并對其進行茜素紅-阿爾辛藍染色，具體步驟如下：

1.1.5％戊巴比妥鈉麻醉乳鼠使其安樂死。

2.按以下步驟小心地剔除乳鼠的軟組織：

(1)用手術(shù)直剪在乳鼠腹部的中央橫向剪開一個口子，然后用鑷子夾住開口的皮膚，繞著乳鼠的腹部順時針橫向撕扯一圈；

(2)然后像脫上衣一樣向著頭部方向剝離上身、前肢及頭部的皮膚，再像脫褲子一樣剝離下身及后肢的皮膚，切勿脫臼四肢或頭部，趾骨及鼻子周圍的皮膚不用剝干凈，以免損傷骨組織；

(3)之后清除胸腔、腹腔內(nèi)的臟器，剝除頸部的甲狀腺及身體上的脂肪(尤其是肩胛骨部位)和多余軟組織；

(4)最后剝?nèi)パ劬?，用鑷子將兩?cè)瞳孔穿通，并與腦組織穿通，切勿損傷顱骨。

3.95％酒精固定樣品24h。

4.將樣品轉(zhuǎn)移至丙酮中，室溫下浸泡過夜(10-12h)以清除樣品的脂肪。

5.去離子水簡單清洗樣品3次后，0.03％阿爾新藍(300mgalcianblue,800ml98％ethanol,200mlaceticacid)中完全浸泡24h以染色樣品的軟骨。

note:因季節(jié)溫度差異，具體染色時間可依軟骨的染色程度來調(diào)整。

6.95％酒精中浸泡樣品3次，每次1h。

7.2％koh浸泡24h。

note:期間分別在2h、6h及13h時更換2％koh；因季節(jié)溫度差異，2％koh中浸泡時間最好根據(jù)小鼠骨架的情況調(diào)整，以免消化過度。

8.0.005％茜素紅(50mg/lalizarinredin2％koh)中浸泡24h以復(fù)染樣品的成骨部分。

9.1％koh中浸泡直至骨架清潔。

10.將樣品轉(zhuǎn)移至自來水中等待拍照記錄，但浸泡時間不宜超過3天。

11.拍照記錄，觀察分析。

從圖5可以發(fā)現(xiàn)，與對照組的macf1^flox/flox乳鼠相比，出生后1天的prrx1^cre；macf1^flox/flox乳鼠的顱骨矢狀縫稍大，人字縫明顯擴大，顱骨鈣化區(qū)域明顯減少，表現(xiàn)出明顯的顱骨發(fā)育延遲及其骨形成能力降低的癥狀。

2.2條件性敲除macf1基因?qū)π∈蠊晒枪切纬赡芰Φ挠绊憽?/p>

選取16w的prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠和macf1^flox/flox小鼠，解剖獲得其股骨，進行小動物microct掃描。

從圖6可以發(fā)現(xiàn)，與對照組的macf1^flox/flox小鼠相比，prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠股骨的骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏，松質(zhì)骨區(qū)域明顯減少，表現(xiàn)出明顯骨形成能力降低癥狀。

實施例3：條件性敲除macf1基因?qū)﹂g充質(zhì)干細胞成骨分化能力的影響。

從小鼠四肢骨的皮質(zhì)骨中提取原代間充質(zhì)干細胞，成骨分化誘導(dǎo)后，通過茜素紅染色檢測條件性敲除macf1基因?qū)﹂g充質(zhì)干細胞成骨分化能力的影響，具體步驟如下：

將prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠和macf1^flox/flox小鼠的原代間充質(zhì)干細胞接種于24孔板中，1.0x10⁵個/孔，各4個復(fù)孔；待24h后細胞長滿，加成骨分化誘導(dǎo)劑(1％l-谷氨酰胺+1％雙抗+1％vc+1％β-甘油+10％bi血清+86％α-mem培養(yǎng)基)誘導(dǎo)，每隔一天換次誘導(dǎo)劑，待礦化結(jié)節(jié)明顯時，進行茜素紅染色：

1.吸去細胞培養(yǎng)基，用pbs清洗細胞2次；

2.加10％甲醛固定細胞，室溫15min；

3.pbs清洗細胞1次，加入0.5％茜素紅s染液(ph4.2)，室溫染色15min；

4.使用自來水對細胞震蕩清洗4次，5min/次；

5.用掃描儀對著色礦化結(jié)節(jié)進行掃描；

6.保存掃描照片，觀察分析。

從圖7可以發(fā)現(xiàn)，相同條件下，與對照組macf1^flox/flox小鼠的原代間充質(zhì)干細胞相比，prrx1^cre；macf1^flox/flox小鼠的原代間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)成骨后形成的礦化結(jié)節(jié)明顯減少，表明其成骨分化能力明顯降低。

sequencelisting

<110>西北工業(yè)大學(xué)

<120>間充質(zhì)干細胞中macf1基因條件性敲除小鼠模型的建立及其應(yīng)用

<130>說明書，權(quán)利要求書

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工引物

<400>1

aaagaaacggaaatactggcc21

<210>2

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<212>dna

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ggcttgcaggtacaggaggtag22

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<210>4

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序列表

1