本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種名貴易危魚類長臀鮠的精液超低溫保存方法及其稀釋液。

背景技術(shù)：

長臀鮠是鲇形目，長臀鮠科，長臀鮠屬魚類。體長，側(cè)扁，背鰭起點為體最高處。頭平扁，略呈三角形，背面骨粗糙裸露。吻突出，鈍圓。口近端位，弧形，上頜略突出。為亞熱帶山麓河溪底層魚類，喜清澈流水環(huán)境。長臀鮠無肌間刺，肉味鮮美，營養(yǎng)價值高，所以市面上價格較高，經(jīng)常出現(xiàn)供不應(yīng)求的狀況。野生長臀鮠由于過度捕撈，導(dǎo)致其野生資源和苗種的匱乏（導(dǎo)致種苗等野生資源十分匱乏）。同時，長臀鮠是珠江流域最名貴、人工繁育難度最大的名優(yōu)經(jīng)濟(jì)魚類之一?？v然國內(nèi)部分學(xué)者長期致力于長臀鮠的人工繁殖學(xué)，受精生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，力求找到影響長臀鮠人工受精苗種受精率存活率的關(guān)鍵因素，但效果甚微。

我們課題組在珠江長臀鮠初步人工繁殖成功的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)制約長臀鮠人工繁殖的主要因素不是水溫、ph等傳統(tǒng)環(huán)境生態(tài)因子，也不是雌性親魚卵質(zhì)不好，問題可能出在雄親魚身上，與雄親魚的性腺發(fā)育狀態(tài)有關(guān)，而發(fā)育較好的雄親魚很難獲得，即使偶爾獲得了發(fā)育較好的雄親魚，但雌親魚也可能沒有發(fā)育成熟，這種雌雄發(fā)育不同步的現(xiàn)象是長臀鮠人工繁殖不能成功的瓶頸問題。因此，對長臀鮠雄性親魚精液的保存是至關(guān)重要的，目前尚未見有相關(guān)的研究和報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有長臀鮠精液保存技術(shù)的不足，提供一種長臀鮠精液稀釋液和超低溫保存方法，為其種質(zhì)研究及遺傳管理、精液冷凍保存及種質(zhì)保護(hù)等提供保障，對解決長臀鮠人工繁殖技術(shù)難題、保護(hù)長臀鮠資源及實現(xiàn)我國名優(yōu)魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供重要的科學(xué)指導(dǎo)。

本發(fā)明的目的是提供一種長臀鮠精液保存稀釋液。

本發(fā)明另一目的是提供一種長臀鮠精液超低溫保存方法。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種長臀鮠精液保存稀釋液，由糖、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、酪氨酸、甘氨酸、蒸餾水和抗凍劑組成；所述抗凍劑為二甲基亞砜。

其中，優(yōu)選地，所述糖為葡萄糖，或所述糖為葡萄糖和果糖。

優(yōu)選地，所述鈉鹽為nacl、nahco3或na2hpo4中的一種或幾種。

優(yōu)選地，所述鉀鹽為kcl，或所述鉀鹽為kcl和kh2po4。

優(yōu)選地，所述鈣鹽為cacl2。

優(yōu)選地，所述長臀鮠精液保存稀釋液還包含有鎂鹽；優(yōu)選地，所述鎂鹽為mgcl2或mgso4。

本發(fā)明的長臀鮠精液保存稀釋液使用前加入硫酸新霉素和鏈霉素。優(yōu)選地，硫酸新霉素和鏈霉素的加入體積比均為1～1.2：1。

具體優(yōu)選地，本發(fā)明所述長臀鮠精液保存稀釋液有以下a、b、c三種配方：

a配方：每100ml蒸餾水中含有0.15～0.2g葡萄糖、1.5～1.6gnacl、0.15～0.18gkcl、0.02～0.03gcacl2、0.04～0.05gmgso4·7h2o、0.06～0.07gnahco3、0.03～0.04gna2hpo4·h2o、0.01～0.015gkh2po4、0.18～0.2gc6h12o6·h2o，終體積濃度為5%～15%的二甲基亞砜；

b配方：每100ml蒸餾水中含有1.5～2g葡萄糖、1～1.5g果糖、0.05～0.1gkcl、0.01～0.03gcacl2、0.18～0.25gnahco3，終體積濃度為5%～15%的二甲基亞砜；

c配方：每100ml蒸餾水中含有2.5～3g葡萄糖、0.8～1gnacl、0.1～0.2gkcl、0.02～0.04gcacl2、0.01～0.02gmgcl2·6h2o、0.05～0.08gna2hpo4、0.3～0.4gnahco3、0.1～0.2g酪氨酸、0.05～0.1g甘氨酸，終體積濃度為5%～15%的二甲基亞砜。

更優(yōu)選地，所述長臀鮠精液保存稀釋液的a、b、c三種配方如下：

a配方：每100ml蒸餾水中含有0.18g葡萄糖、1.52gnacl、0.168gkcl、0.028gcacl2、0.0472gmgso4·7h2o、0.065gnahco3、0.035gna2hpo4·h2o、0.012gkh2po4、0.188gc6h12o6·h2o，終體積濃度為10%的二甲基亞砜；

b配方：每100ml蒸餾水中含有1.8g葡萄糖、1.2g果糖、0.08gkcl、0.02gcacl2、0.21gnahco3，終體積濃度為10%的二甲基亞砜；

c配方：每100ml蒸餾水中含有2.68g葡萄糖、0.98gnacl、0.16gkcl、0.03gcacl2、0.012gmgcl2·6h2o、0.06gna2hpo4、0.32gnahco3、0.12g酪氨酸、0.08g甘氨酸，終體積濃度為10%的二甲基亞砜。

以上精子保存液均用可密封棕色玻璃瓶低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

以上三種精液保存稀釋液配方中，尤以c配方的效果最顯著。

另外，一種長臀鮠精液的超低溫保存方法，包括如下步驟：

s1.魚種選擇：選擇無疾病、性成熟特征明顯的雄性親魚；

s2.配制精液保存稀釋液；

s3.采集精液：對步驟s1的雄性親魚進(jìn)行精液采集；

s4.精液超低溫保存：將步驟s2的精液保存稀釋液中加入硫酸新霉素和鏈霉素后，按照精液：保存稀釋液=1：5～6的體積比，將s3采集的精液保存在保存稀釋液中；然后采用-10～-11℃/30s的降溫速率，在到達(dá)-150℃后，放入液氮中進(jìn)行超低溫保存；

s5.解凍復(fù)蘇：取出超低溫保存的長臀鮠精液，加入解凍液，放入32℃～40℃的水浴中快速解凍復(fù)蘇；所述解凍液為體積分?jǐn)?shù)0.65%～0.7%的pbs緩沖液。

其中，優(yōu)選地，步驟s1所述魚種選擇具體是：先選育出外形無傷病、年齡較大（成熟期），個體較重（3斤以上）的個體進(jìn)行強(qiáng)化培育；然后選擇體質(zhì)強(qiáng)壯健康、體表無損傷、無充血、腹脹、爛鰭、突眼等病癥，且性成熟特征明顯、體質(zhì)健壯、形態(tài)端正、游姿平穩(wěn)、體色鮮艷的雄性親魚采集精液。此法對后期的精液保存極其重要。

優(yōu)選地，步驟s3采集精液的具體方法可以參考如下：采精前擦干魚體并排除尿液和糞便，使用ms-222麻醉劑對親魚進(jìn)行麻醉后，于無菌操作臺上迅速取出精巢，稱重，用剪刀將精巢徹底剪碎使精子充分釋放，收集得精子懸液。以上全過程均在冰上操作，精子懸液中包含精子、精細(xì)胞、精漿、血細(xì)胞及微小組織碎片等。

優(yōu)選地，步驟s4所述硫酸新霉素或鏈霉素：保存稀釋液的體積比均為1～1.2：1。

優(yōu)選地，步驟s4所述降溫速率為-10.5℃/30s。

優(yōu)選地，步驟s4中使用的容器為塑料離心管，即將步驟s2的精液保存稀釋液加入塑料離心管中，再加入硫酸新霉素和鏈霉素，按照精液：保存稀釋液=1：5～6的體積比，將s3采集的精液加入塑料離心管；然后采用-10.5℃/30s的下降速率，在到達(dá)-150℃低溫后，將塑料離心管直接浸入液氮中進(jìn)行超低溫保存。

優(yōu)選地，步驟s5所述解凍復(fù)蘇的溫度為36℃。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供的長臀鮠精液稀釋液和超低溫保存及復(fù)蘇方法，能夠保證長臀鮠精液保存時間的持久性，精液超低溫保存技術(shù)極大的促進(jìn)了長臀鮠種質(zhì)資源開發(fā)與育種改良，在長臀鮠養(yǎng)殖中有著重大的理論和現(xiàn)實意義。首先，通過建立優(yōu)良養(yǎng)殖長臀鮠的冷凍精子庫，可將優(yōu)良長臀鮠的原良種進(jìn)行長期保存，從而避免因過渡捕撈、環(huán)境污染及生態(tài)破壞而造成的長臀鮠物種滅絕或生產(chǎn)上長期養(yǎng)殖和近親交配導(dǎo)致種質(zhì)資源退化和變異現(xiàn)象；其次，通過精子超低溫保存，可使性腺發(fā)育和生殖期不同步、性逆轉(zhuǎn)及地理隔離的養(yǎng)殖品系得以交配，恢復(fù)種質(zhì)資源和自然保存量，而且可進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；a(chǎn)，具有十分可觀的生態(tài)經(jīng)濟(jì)和社會效益。

具體地，本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下顯著的創(chuàng)新和意義：

1、改進(jìn)采樣方法：以珠江名貴易危的長臀鮠為發(fā)明對象，采集不同地理種群的野生的長臀鮠親魚，利用精液超低溫保存技術(shù)初步解決了雌雄性腺發(fā)育不同步的問題。

2、改良保存稀釋液配方：根據(jù)長臀鮠的生物學(xué)和性腺特征以及不同稀釋液配方保存后精子的成活率高低，對長臀鮠精子保存稀釋液配方作了進(jìn)一步的改良，并選取了3個優(yōu)良配方，效果均良好，尤以c配方效果顯著。

3、改進(jìn)精液保護(hù)劑：精子保護(hù)劑采用一定比例的硫酸新霉素和鏈霉素復(fù)合劑，取代了單純的青霉素，對精子起到了較好的保護(hù)作用。精子抗凍劑濃度的摸索，我們發(fā)現(xiàn)添加10%二甲基亞砜對超低溫保存的精子效果最好。

4、優(yōu)化降溫法：超低溫保存使用逐級快速降溫法，在前人基礎(chǔ)上作了較大的改進(jìn)，對精子的保存效果具有積極的意義。

5、改良凍精解凍液：長臀鮠凍精解凍液用體積分?jǐn)?shù)0.65%～0.7%的pbs緩沖液，取代了生理鹽水或蒸餾水，對精液的保護(hù)效果更好。

附圖說明

圖1為精液的percoll分離結(jié)果示意圖。

圖2為精液的3層percoll不連續(xù)梯度分離結(jié)果。

圖3為長臀鮠精子超低溫冷凍保存30d后精子運動率及存活率結(jié)果。

圖4為不同復(fù)蘇溫度對精子活力的影響。

圖5為顯微鏡16×10倍數(shù)下觀察復(fù)蘇后精子情況。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。

實施例1長臀鮠的精液保存稀釋液

1、精子保存液稀釋a配方：分別配制甲液和乙液，根據(jù)我們的摸索和實驗，甲液最佳配方為：葡萄糖1.80g，nacl15.2g，kcl1.68g，cacl20.28g，mgso4·7h2o0.472g，最后加入100ml的蒸餾水溶解；

乙液配方為nahco30.65g，na2hpo4·h2o0.35g，kh2po40.12g，c6h12o6·h2o1.88g，最后加入100ml的蒸餾水溶解。

取甲液、乙液各10ml，混合后加蒸餾水定容至100ml，并加入終體積濃度為5%、10%或15%的二甲基亞砜，即配制成精子保存稀釋液a。

2、精子保存稀釋液b配方：葡萄糖1.80g，果糖1.2g，kcl0.08g，cacl20.02g，nahco30.21g，蒸餾水100ml，并加入終體積濃度為5%、10%或15%的二甲基亞砜。

3、精子保存稀釋液c配方：葡萄糖2.68g，nacl0.98g，kcl0.16g，cacl20.03g，mgcl2·6h2o0.012g，na2hpo40.06g，nahco30.32g，酪氨酸0.12g，甘氨酸0.08g，蒸餾水100ml，并加入終體積濃度為5%、10%或15%的二甲基亞砜。

經(jīng)過試驗驗證，上述3個優(yōu)良配方保存后精子的成活率均較好，尤以c配方效果最顯著。二甲基亞砜的體積濃度以10%的效果最好。

實施例2長臀鮠的精液超低溫保存方法

本發(fā)明提供了長臀鮠的精液超低溫保存方法，主要步驟如下：魚種選擇、精子保存稀釋液和抗凍劑配制、精子采集與品質(zhì)觀察、精液超低溫保存、解凍復(fù)蘇、精子活力觀察。具體的操作方法如下：

1、魚種選擇

自然環(huán)境的魚種采集是長臀鮠重要的親魚來源，通過長期的野外調(diào)研，我們引進(jìn)采集長臀鮠親魚300多尾，其中選育出外形無傷病、年齡較大，個體較重的3斤以上個體100多尾，在清遠(yuǎn)市興漁水產(chǎn)科技有限公司科研示范基地進(jìn)行強(qiáng)化培育。在采集精液時選擇體質(zhì)強(qiáng)壯健康，體表無損傷，無充血、腹脹、爛鰭、突眼等病癥，且性成熟特征明顯、體質(zhì)健壯、形態(tài)端正、游姿平穩(wěn)、體色鮮艷的雄性親魚。此法對后期的精液保存極其重要。

2、精子保存稀釋液配制

按照實施例1，配制精子保存稀釋液。

3、精子采集、分離與品質(zhì)觀察

（1）精子采集選用10ml可密封避光離心管，經(jīng)滅菌處理后作為精子保存容器，共60個，每種保存液20個，將保存液小心的加入到離心管中，并分別按照1～1.2：1的比例加入硫酸新霉素和鏈霉素，對照組不加硫酸新霉素和鏈霉素，并編好號。

采精前擦干魚體并排除尿液和糞便，使用ms-222麻醉劑對親魚進(jìn)行麻醉后，于無菌操作臺上迅速取出精巢，稱重，用剪刀將精巢徹底剪碎使精子充分釋放。分別將收集得的精子懸液通過沙絹網(wǎng)過濾并做好標(biāo)記。

以上全過程均在冰上操作，精子懸液中包含精子、精細(xì)胞、精漿、血細(xì)胞及微小組織碎片等。等滲的100%percoll溶液以percoll(pharmacia,uppsala,sweden)原液及10×pbs按9：1的比例混勻而成。隨后的percoll梯度則按實驗需求通過1×pbs進(jìn)行稀釋（10%～90%），此過程使用三種規(guī)格的無菌離心管。

（2）采集結(jié)束后進(jìn)行鏡檢，取2μl精液在顯微鏡下進(jìn)行觀察，精子的活力為：大約有82%可作快速直線前進(jìn)運動，9%作微弱的曲線運動或擺動，6%原地打轉(zhuǎn)，3%不動，精子活率為0.82。

進(jìn)一步利用計算機(jī)精子輔助分析儀檢測顯示，新鮮精液的ph值為7.1。

長臀鮠精子percoll分離結(jié)果如附圖1所示，3層percoll不連續(xù)梯度分離結(jié)果如圖2所示。

4、精液低溫和超低溫保存

（1）將精子分成兩部分，一部分精子用于低溫保存實驗，另一半精子用于超低溫保存實驗。冷凍方法采用塑料離心管冷凍法，具有冷凍量大、操作簡便、安全性高等特點，可用于精液冷凍保存和精子庫建立。

取出精液，測量精液體積量，等體積置于離心管，精液與保存液比例為1：5～6，此法簡便、成本低廉，適合在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

（2）具體地，我們對精子進(jìn)行了低溫保存實驗，精子4℃低溫保存結(jié)果如下表1所示：

表1精液4℃低溫保存結(jié)果

注：“++”表示80～90%以上的精子快速運動；“+”表示50～60%精子快速運動；“+－”表示20～30%精子快速運動；“－”表示全部死亡或少量在原地振動。

我們發(fā)現(xiàn)，過快或過慢的冷卻速率均會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，降低長臀鮠精子的存活率。因此，我們將采集的精液采用逐級快速降溫法進(jìn)行低溫保存，我們針對長臀鮠的精子，具體方法是采用-10.5℃/30s的下降速率，在到達(dá)-150℃低溫后，直接浸入液氮中，此法效果較好，可以最大限度的保護(hù)精子，每種精子保存液分3組保存觀察。我們的具體做法是將長臀鮠精子超低溫凍存30天后取出解凍，解凍后發(fā)現(xiàn)添加5%二甲亞砜與10%二甲亞砜對冷凍保存的精子運動率影響差異不顯著（37.6%和36.2%）但都顯著高于15%二甲亞砜組（24.4%），但通過精子存活率來看，10%二甲亞砜保持46.6%顯著高于5%二甲亞砜組的37.2%（如圖3）。綜上所述，添加10%二甲基亞砜作為抗凍劑效果最好。

5、解凍復(fù)蘇

解凍復(fù)蘇是精子升溫溶解復(fù)蘇的過程，也是精子恢復(fù)活力的過程，解凍的關(guān)鍵因素是解凍液和解凍速度。

經(jīng)過我們反復(fù)的試驗和摸索，長臀鮠凍精解凍液用體積分?jǐn)?shù)0.65%～0.7%的pbs緩沖液效果較好。

解凍速度采用的是快速解凍法，具體操作是在32℃～40℃的水浴鍋中快速解凍。本方法與快速冷凍的過程相對應(yīng)，起到了很好的效果。

我們比對分析了不同復(fù)蘇溫度對解凍后長臀鮠精子活力的影響發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇溫度為36℃時，復(fù)蘇后的精子活力最高，為30.66%。具體不同復(fù)蘇溫度對精子活力的影響如圖4所示。

6、精子活力觀察

保存效果評價以精子被激活后的活力(快速運動精子占總精子數(shù)的百分比)作為指標(biāo)。先將精子保存液取出搖勻，然后快速用移液槍吸出一小滴置于載玻片上，在顯微鏡16×10倍數(shù)下觀察精子，觀察到精子后立即用半滴蒸餾水激活，觀察其運動情況并記錄。我們發(fā)現(xiàn)，視野中作直線前進(jìn)運動的精子的百分比為45%以上，在原地顫動、擺動或作微弱曲線運動的精子35%左右，完全不動的精子少于20%，這些精子無受精能力（顯微鏡16×10倍數(shù)下觀察精子情況如圖5所示）。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。