本發(fā)明屬于植物繁殖方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種綠嶺核桃體細(xì)胞胚育苗方法。

背景技術(shù)：

綠嶺核桃品種是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)、河北綠嶺果業(yè)有限公司1999年在5年生香玲中發(fā)現(xiàn)的優(yōu)良變異單株。2005年通過(guò)河北省林木品種審定委員會(huì)審定，是河北省林木種質(zhì)資源普查主栽經(jīng)濟(jì)林品種和審定品種重點(diǎn)調(diào)查內(nèi)容。其品種的生物學(xué)特征為：堅(jiān)果卵圓形，淺黃色，三徑平均為3.42cm，平均單果重12.8g。殼厚0.8mm，均勻不露仁，縫合線平滑而不突出，果面光滑美觀，用手輕輕一捏就可剝開；內(nèi)種皮淡黃色，無(wú)澀味，種仁飽滿濃香。出仁率67％以上，果仁顏色淺黃，營(yíng)養(yǎng)豐富，脂肪含量67％(香玲65.48％)、蛋白質(zhì)含量22％(香玲21.43％)。與香玲相比，果殼薄、個(gè)大、出仁率高，果形美觀，蛋白質(zhì)、脂肪含量均比香玲高。雄先型品種。以中短枝結(jié)果為主，果枝率88.5％，雙果率22.4％。早實(shí)、豐產(chǎn)，栽植第二年可結(jié)果。五年進(jìn)入盛果期，平均畝產(chǎn)200kg以上。抗逆性與抗病性較強(qiáng)，耐旱。對(duì)細(xì)菌性褐斑病和炭疽病具有較強(qiáng)的抗性，病果率小于3.5％。

核桃的繁殖是產(chǎn)品推廣的重要基礎(chǔ)工作，而傳統(tǒng)的育苗方法難以滿足穩(wěn)定的品種遺傳轉(zhuǎn)化的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種綠嶺核桃體細(xì)胞胚發(fā)生方法，為實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種綠嶺核桃體細(xì)胞胚育苗方法，包括以下過(guò)程：

(1)將核桃幼胚外植體消毒處理，達(dá)到無(wú)菌要求；

(2)將核桃幼胚外植體轉(zhuǎn)接到愈傷組織培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；

(3)將誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)體細(xì)胞胚培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；

(4)將質(zhì)量好的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽培養(yǎng)；

(5)經(jīng)過(guò)叢生芽培養(yǎng)的健壯芽接種到壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；

(6)經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)的無(wú)根苗接種到生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)；

(7)選擇根系長(zhǎng)到2-3cm的生根苗進(jìn)行煉苗移栽，應(yīng)用草炭土和珍珠巖配成的混合基質(zhì)。

具體的，步驟(1)中，所述的外植體消毒方法：用75％的酒精處理外植體30s，用無(wú)菌水沖洗5遍，再用0.1％的氯化汞消毒3-5分鐘，再用無(wú)菌水沖洗5遍。

步驟(2)中所述的愈傷組織培養(yǎng)基，為在按規(guī)定量稱取1lwpm培養(yǎng)基基本成分后添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、6-ba1.0mg、naa0.5mg，用純凈水定容至1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間30天。

步驟(3)中所述的誘導(dǎo)體細(xì)胞胚培養(yǎng)基，是在按規(guī)定量稱取1lwpm培養(yǎng)基基本成分后添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、6-ba1.0mg、tdz0.01mg、naa0.5mg，用純凈水定容至1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度3500iux，培養(yǎng)時(shí)間45天。

步驟(4)中所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是為在按規(guī)定量稱取1lwpm培養(yǎng)基基本成分后添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、6-ba1.0mg、zt0.5mg、naa0.5mg，用純凈水定容至1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度3500iux，培養(yǎng)時(shí)間60天。

步驟(5)中所述的壯苗培養(yǎng)基，是為在按規(guī)定量稱取1lwpm培養(yǎng)基基本成分后添加蔗糖30g、瓊脂粉6.5g、6-ba0.5mg、naa1mg，用純凈水定容至1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度3500iux，培養(yǎng)時(shí)間60天。

步驟(6)中所述的生根培養(yǎng)基，在按規(guī)定量稱取1lwpm培養(yǎng)基其中大量元素減一半，添加蔗糖20g、瓊脂粉6.5g、活性炭1g、iba1.5mg，用純凈水定容至1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度3500iux，培養(yǎng)時(shí)間70天。

具體的說(shuō)明，1升wpm基本培養(yǎng)基，包括以下元素，大量元素：nh4no3400mg；(nh4)2so4132mg；mgso4.7h2o370mg；kh2po4170mg；kno3400mg；k2so4900mg；鈣鹽：cacl296mg；ca(no3)2·4h2o556mg；微量元素：h3bo36.2mg；mnso4.h2o22.3mg；na2moo4·2h2o0.25mg；cuso4.5h2o0.025mg；znso4·7h2o8.6mg；鐵鹽：na2-edta37.3mg；feso4.7h2o27.8mg；維生素：肌醇100mg；煙酸(維生素pp)0.5mg；鹽酸吡多醇0.5mg；鹽酸硫胺素0.5mg；甘氨酸2mg。

步驟(7)所述的草炭土：珍珠巖的質(zhì)量比為3:2。

本發(fā)明提供的一種綠嶺核桃體細(xì)胞胚育苗方法，通過(guò)誘導(dǎo)核桃體細(xì)胞胚的方法建立植株再生的方法，為建立綠嶺核桃品種遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)誘導(dǎo)綠嶺核桃體細(xì)胞胚的發(fā)生方式達(dá)到植株再生繁殖的目的，具體方法如下：

(1)處理外植體用冷水浸泡一周，每天換水一次，然后太陽(yáng)下暴曬，裂開即可發(fā)芽，待發(fā)芽后，在超凈工作臺(tái)上取出完整的幼胚作為外植體備用。

(2)消毒處理，首先在超凈工作臺(tái)上用75％酒精處理30s，用無(wú)菌水沖洗5次，0.1％的氯化汞處理3-5分鐘，再用無(wú)菌水沖洗5遍。

(3)外植體誘導(dǎo)愈傷組織將消毒后的外植體接種到愈傷組織培養(yǎng)基中，以wpm為基本培養(yǎng)基添加蔗糖30g，瓊脂粉6.5g，6-ba1.0mg，naa0.5mg，用純凈水定容到1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，暗培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間30天。

(4)愈傷組織經(jīng)過(guò)再分化選擇質(zhì)地呈顆粒狀，顏色淺紅色的愈傷組織，轉(zhuǎn)接到再分化培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基為wpm基本培養(yǎng)基添加蔗糖30g，瓊脂6.5g，6-ba1.0mg，tdz0.01mg，naa0.5mg，純凈水定容至1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度3500iux，培養(yǎng)時(shí)間45天。

(5)叢生芽培養(yǎng)將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基以wpm為基本培養(yǎng)基添加蔗糖30g，瓊脂6.5g，6-ba1.0mg，zt0.5mg，naa0.5mg，定容水至1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度3500iux，培養(yǎng)時(shí)間60天。

(6)壯苗培養(yǎng)經(jīng)過(guò)叢生芽誘導(dǎo)后細(xì)小芽，轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基，培養(yǎng)基以wpm為基本培養(yǎng)基添加蔗糖30g，瓊脂6.5g，6-ba1.0mg，naa1.0mg，定容水至1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度3500iux，培養(yǎng)時(shí)間45天。

(7)生根培養(yǎng)經(jīng)過(guò)壯苗培養(yǎng)后，選擇2-3cm長(zhǎng)的芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基以1/2wpm為基本培養(yǎng)基添加蔗糖20g，瓊脂6.5g，活性炭1g，iba0.5mg，iaa0.3mg，定容水至1升，調(diào)整ph值6.5-6.8，培養(yǎng)溫度25±2℃，光照強(qiáng)度3500iux，培養(yǎng)時(shí)間60天。

(8)煉苗移栽在生根培養(yǎng)基中根長(zhǎng)到2-3cm時(shí)，即可煉苗移栽。移栽前先將瓶苗置于溫室中馴化7天左右，打開瓶蓋放置3天，用鑷子將苗輕輕取出，用溫水洗凈培養(yǎng)基后用1％的多菌靈浸泡4分鐘，栽入育苗穴盤中，移栽組培苗基質(zhì)比例：草炭土：珍珠巖為3:2，澆透水，用塑料薄膜遮陽(yáng)3-5天。