本發(fā)明屬于細胞凍存領(lǐng)域，具體涉及一種用于cik細胞于-80℃直接凍存的凍存液。
背景技術(shù)：
凍存cik細胞時，一般降溫程序為：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，最后轉(zhuǎn)至-80℃低溫冰箱放置(或用液氮保存)，程序繁瑣。但是，若直接將cik細胞轉(zhuǎn)至-80℃低溫冰箱保存，會顯著降低cik細胞對腫瘤細胞的殺傷活性【參考文獻：-80℃冰箱直接凍存對細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞殺傷活性的影響，細胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28(10)】。
這主要與細胞凍存液有關(guān)，現(xiàn)有凍存液不適合用作cik細胞于-80℃直接凍存的保護劑。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，簡化cik細胞低溫凍存工藝，提供一種用于cik細胞于-80℃直接凍存的凍存液。
本發(fā)明通過如下技術(shù)方案得以實現(xiàn)：
一種細胞凍存液，以rpmi-1640培養(yǎng)液為基質(zhì)，在基質(zhì)中添加dmso、fbs復(fù)配而成，基質(zhì)中還添加有效量的人β2-微球蛋白。
優(yōu)選地，1l基質(zhì)添加1-2g人β2-微球蛋白。
優(yōu)選地，1l基質(zhì)添加80-120mldmso。
優(yōu)選地，1l基質(zhì)添加180-220mlfbs。
上述細胞凍存液在cik細胞凍存方面的應(yīng)用。
本發(fā)明優(yōu)點：
使用本發(fā)明提供的細胞凍存液凍存cik細胞時，可以直接于-80℃凍存，且不會導(dǎo)致cik細胞殺傷力明顯降低，可以簡化cik細胞低溫凍存工藝。
附圖說明
圖1為不同cik細胞對k562細胞的殺傷率(％)。
具體實施方式
為了更好地解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例進一步介紹。實施例中未特別強調(diào)的實驗材料均為常規(guī)實驗材料，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員易于獲得的范疇。
實施例1
一、實驗材料和方法
1、細胞凍存液的配制
在rpmi-1640培養(yǎng)液(美國gibco公司)中添加二甲基亞砜(dmso)、胎牛血清(fbs，美國gibco公司)和人β2-微球蛋白(購于武漢戴安生物技術(shù)有限公司，貨號p0008)，其中：1lrpmi-1640培養(yǎng)液中分別添加1.5g人β2-微球蛋白、100mldmso、200mlfbs?；旌暇鶆蚝笥?℃低溫保存，使用前取出并輕輕搖勻。
另按照常規(guī)配方配制對比凍存液，對比凍存液的成分為含10％dmso及20％fbs的rpmi-1640作為凍存劑。
2、cik細胞的培養(yǎng)擴增
取肝素抗凝的健康志愿者外周血20ml，用淋巴細胞分離液密度梯度離心(2400×g，20min)，輕輕吸取灰白色層的單個核細胞，用生理鹽水洗滌3次，以rpmi-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為5×106/ml，加到培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶15ml，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，輕輕搖勻，吸出懸浮細胞，離心后去上清用rpmi-1640培養(yǎng)液(含100ml/lfbs、rhil-2500u/ml，小鼠抗人cd3單克隆抗體500ng/ml，ifn-γ1000u/ml，rhil-1100u/ml)調(diào)細胞密度為2.5×106/ml，加到培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶20ml。接種當(dāng)天記為0天，每隔3d半量換液并補足rhifn-γ及rhil-2。
3、cik細胞的凍存和復(fù)蘇
cik培養(yǎng)至第12天時，留1瓶cik用于檢測殺傷活性外，收集其余細胞，計數(shù)，分別用上述本發(fā)明配方凍存液和對比凍存液調(diào)整細胞密度為5×107/ml，直接凍存于-80℃冰箱。
凍存6個月后，將凍存管從-80℃冰箱取出后立即投入40℃水浴中快速融化，800r/min離心10min，棄上清，用rpmi-1640培養(yǎng)液(含100ml/lfbs、rhil-2500u/ml，ifn-γ1000u/ml，rhil-1100u/ml)重懸細胞，調(diào)整細胞密度為2.5×106/ml，37℃、5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
3、cik細胞的殺傷活性
分別將培養(yǎng)至第12天未凍存、用本發(fā)明細胞凍存液凍存6月復(fù)蘇培養(yǎng)5天、用對比凍存液凍存6月復(fù)蘇培養(yǎng)5天的cik細胞與對數(shù)期的k562細胞按照效靶比20:1混合，同時設(shè)單獨的靶細胞及效應(yīng)細胞孔，用ldh釋放法，測定490nm的吸光度(a)值，計算各組cik對k562細胞的殺傷率(％)。
二、實驗結(jié)果
培養(yǎng)至第12天未凍存、用本發(fā)明細胞凍存液凍存6月復(fù)蘇培養(yǎng)5天、用對比凍存液凍存6月復(fù)蘇培養(yǎng)5天的cik細胞對k562細胞的殺傷率如表1和圖1所示。與未凍存的cik細胞相比，用本發(fā)明細胞凍存液凍存6月復(fù)蘇培養(yǎng)5天、用對比凍存液凍存6月復(fù)蘇培養(yǎng)5天的cik細胞對k562細胞的殺傷率均降低，但是用本發(fā)明細胞凍存液凍存6月復(fù)蘇培養(yǎng)5天的cik細胞對k562細胞的殺傷率降低不明顯，顯著優(yōu)于對比凍存液的凍存效果。
表1不同cik細胞對k562細胞的殺傷率(％)
上述結(jié)果表明，使用本發(fā)明提供的細胞凍存液凍存cik細胞時，可以直接于-80℃凍存，且不會導(dǎo)致cik細胞殺傷力明顯降低，可以簡化cik細胞低溫凍存工藝。
上述實施例僅用于進一步解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，任何簡單替換或修改均不脫離本發(fā)明，本發(fā)明的保護范圍并不受限于上述具體實施例。