本發(fā)明涉及組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種造血干細(xì)胞細(xì)胞凍存劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

造血干細(xì)胞是血液系統(tǒng)中的成體干細(xì)胞，是一個(gè)異質(zhì)性的群體，具有長(zhǎng)期自我更新的能力和分化成各類成熟血細(xì)胞的潛能。它是研究歷史最長(zhǎng)且最為深入的一類成體干細(xì)胞，對(duì)研究各類干細(xì)胞，包括腫瘤干細(xì)胞，具有重要指導(dǎo)意義。

近幾年來.自體造血干細(xì)胞移植在惡性血液病和多種實(shí)體腫瘤的治療上得到了廣泛的應(yīng)用。如何高質(zhì)量地保存采集的自體造血干細(xì)胞是ahsct治療成功的關(guān)鍵之一。ahsc的保存分為非冷凍保存和冷凍保存兩種，前者雖無冷凍損傷。但保存時(shí)間短，限制了臨床應(yīng)用.后者將造血干細(xì)胞置于0℃以下，可以長(zhǎng)時(shí)間保存以供實(shí)驗(yàn)研究與臨床應(yīng)用，但凍存過程中會(huì)造成部分細(xì)胞的損傷和丟失，因此如何最大限度地使造血細(xì)胞在凍存過程中免受損傷是最需要解決的課題。

為了防止細(xì)胞在冷凍過程中因細(xì)胞內(nèi)液冰晶形成、滲透壓改變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致細(xì)胞損傷，加人冷凍保護(hù)劑是必要的。選擇不同的冷凍保護(hù)劑及其濃度對(duì)hsl的保護(hù)是有影響的。二甲基亞礬能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)人細(xì)胞中，降低冰點(diǎn)、延緩冷凍過程，使細(xì)胞有充足時(shí)間適應(yīng)降溫變化，同時(shí)提高胞內(nèi)離子濃度，減少胞內(nèi)冰晶形成從而減少細(xì)胞損傷。但臨床回輸用dmso凍存的hsc時(shí)出現(xiàn)高血壓、心律失常、胸悶、腹部不適等毒副作用.其發(fā)生率與dmsd的輸人量有關(guān)。于是人們開始尋找有效且毒副作用更小的冷凍保護(hù)劑?，F(xiàn)有技術(shù)用細(xì)胞內(nèi)冷凍保護(hù)劑5％dmso與細(xì)胞外冷序凍保護(hù)劑6％羥乙基淀粉hes冷凍保存外周血單個(gè)核細(xì)胞獲得了很好的回收率，顯示dmso/hes聯(lián)合應(yīng)用優(yōu)于dmso單用，但加果hes濃度過高會(huì)使細(xì)胞過度脫水、皺縮而造成損傷。在冷凍保護(hù)液中加人自體血漿或人血清白蛋白等對(duì)提高h(yuǎn)sc的保存質(zhì)量很重要，但它們的作用機(jī)制還不十分明確，可能與維持細(xì)胞在凍融過程中的活力有關(guān)。最近有人研究在冷凍液中加人細(xì)胞因子如:gh4-csf,il-3.il-1等，對(duì)提高冷凍保存hsc的增殖潛力有一定作用。據(jù)報(bào)告在冷凍前用造血生長(zhǎng)因子刺激千細(xì)胞、能有效提高凍存的hsc的增殖潛力，部分受冷凍損傷的hsc在一定條件下可恢復(fù)其增殖能力。

目前，干細(xì)胞凍存使用的凍存液有含血清和無血清的兩類，由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，無血清凍存和復(fù)蘇技術(shù)成為發(fā)展趨勢(shì)。低溫保存干細(xì)胞主要依靠抗凍液二甲基亞砜(dmso)和血清的保護(hù)。常用到的細(xì)胞保護(hù)劑還有羥乙基淀粉、聚乙二醇(peg)等。但是，dmso會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，對(duì)凍存的干細(xì)胞造成不可逆的損傷。為獲得來源方便的造血干細(xì)胞，開展有效的造血干細(xì)胞凍存方法是本領(lǐng)域迫切的需求，建立一種長(zhǎng)期低溫保存造血干細(xì)胞的方法對(duì)于促進(jìn)造血干細(xì)胞的研宄和應(yīng)用具有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種造血干細(xì)胞細(xì)胞凍存劑以及相應(yīng)的制備方法及使用方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種造血干細(xì)胞細(xì)胞凍存劑，其特征在于由如下各組分組成：谷氨酰胺20mg，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，維生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1-3任一所示。所述多肽由申請(qǐng)人通過特異性針對(duì)造血干細(xì)胞進(jìn)行的前期的大量的基因庫(kù)篩選得到，所述多肽具有保護(hù)造血干細(xì)胞免受損傷的功能。其名稱分別為

hscs-1：ftqnrcsyqqgssqgatlhpewiawir；

hscs-2：vweqylrrkrwrqcyekdhlsrhprhd；

hscs-3：tatinpyprsakwwkrwwspmwrycls。

在本發(fā)明的細(xì)胞的凍存液中，甘油和海藻糖以及維生素e和多肽具有明確的抵御外來傷害對(duì)細(xì)胞的損傷，特別是多肽，還具有保護(hù)細(xì)胞免受凍存時(shí)冰結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的損傷，其余集中組分對(duì)于維持特異性的造血干細(xì)胞的生存是必須的。

本發(fā)明還提供了一種細(xì)胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖勻即成。

本發(fā)明還提供了一種造血干細(xì)胞凍存方法，包括以下步驟:

a.凍存液制備:制備所述的細(xì)胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法將各組分按照相應(yīng)的比例混合即可獲得；

b.細(xì)胞懸液制備:培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的造血干細(xì)胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入步驟a凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內(nèi)；

c.冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；

d.細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次。所述細(xì)胞懸浮濃度為10⁸細(xì)胞/ml-10¹⁰細(xì)胞/ml。

本發(fā)明的有益效果:

本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，復(fù)蘇細(xì)胞存活率可達(dá)98.0％以上，較使用常規(guī)細(xì)胞凍存液的復(fù)蘇存活率有了顯著提高，基本上沒有細(xì)胞的損耗。

本發(fā)明的造血干細(xì)胞凍存液可以長(zhǎng)期保存造血干細(xì)胞，細(xì)胞活性不發(fā)生變化，保證了細(xì)胞生物學(xué)活性。

本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞凍存方法，操作簡(jiǎn)單可行，價(jià)格適宜，具有較好的實(shí)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

分別加入谷氨酰胺20mg，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，維生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：1所示。

實(shí)施例2

分別加入谷氨酰胺20mg，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，維生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：2所示。

實(shí)施例3

分別加入谷氨酰胺20mg，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子300μg，0.2％w/v蔗糖，0.5％w/v低密度脂蛋白，0.5％w/v的海藻糖，0.5％w/v卵磷脂，多肽100ppmw/v，bfgf0.6％w/v，維生素e0.5％w/v，甘油2％v/v最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml，所述多肽的序列如seqidno：3所示。

比較例i

將dmso，1640無菌培養(yǎng)基和血液保存液i三者體積比例:10:5:5混合。

比較例ii

將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。

比較例iii

將二甲基亞砜5％w/v，0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％w/v卵磷脂，多肽1％w/v，bfgf1％w/v，維生素e1％w/v，最后用dmem培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至100ml。

實(shí)施例3凍存液的效果驗(yàn)證

以上實(shí)施例1-3及比較例i-iii所制備的細(xì)胞凍存液，分別按照下述方法進(jìn)行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞凍存過程:

培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的造血干細(xì)胞，其細(xì)胞密度約6*10⁹個(gè)/ml，加入ph7.0的pbs洗細(xì)胞表面一次。

將細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰酶液，加入dmem培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離心4000轉(zhuǎn)/分，棄上清，加入實(shí)施例1-3和比較例1所制備的凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內(nèi)；

冷凍:先將凍存管在4℃下凍存30min，然后放入-30℃凍存lh，再放入-80℃凍存3h，最后移入液氮中保存；分別凍存1周，4個(gè)月，8個(gè)月。每組3個(gè)重復(fù)。

細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37℃水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用5倍dmem液稀釋，1000r/min離心5min,離心去除上清液,再重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果如下：

取8個(gè)月的凍存細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞分化培養(yǎng)，其中所述的造血干細(xì)胞能夠正常進(jìn)行分化，分化效率達(dá)到98.5％，而比較例i-iii取出的細(xì)胞其分化率只能達(dá)到62.3％,60.0％，67.4％，這充分的說明細(xì)胞活性收到很大的影響。

實(shí)施例4特異性檢測(cè)

將實(shí)施例1的培養(yǎng)基，分別針對(duì)其他幾種干細(xì)胞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞進(jìn)行采用實(shí)施例1的培養(yǎng)方式進(jìn)行冷凍試驗(yàn)，通過8個(gè)月的凍存試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)，8個(gè)月之后的這幾種細(xì)胞存活率分別為88.3％，87.5％，80.2％，說明，本發(fā)明的冷凍劑可以特異性的培養(yǎng)造血干細(xì)胞。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡(jiǎn)化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

〈110〉陳印平

〈120〉一種造血干細(xì)胞細(xì)胞凍存劑

〈160〉3

〈210〉1

〈211〉27

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈400〉hscs-1

ftqnrcsyqqgssqgatlhpewiawir；

〈211〉27

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈400〉hscs-2

vweqylrrkrwrqcyekdhlsrhprhd；

〈211〉27

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈400〉hscs-3

tatinpyprsakwwkrwwspmwrycls；