本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種動物模型的構(gòu)建方法和應用。

背景技術：

1、結(jié)直腸癌是人類最常見癌癥之一，也是導致死亡的主要癌癥之一。結(jié)直腸癌發(fā)病率高，會給社會和患者家庭帶來沉重的治療負擔問題。如果在早期發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸的早期治療的預后良好，i期的5年生存率為75％以上，早期干預至關重要，因此，通過食源性多糖免疫調(diào)節(jié)防控結(jié)直腸癌具有重要研究意義?，F(xiàn)在科學界應用及研究最廣泛的是apc基因突變的基因工程小鼠模型，但apc基因作為驅(qū)動突變?nèi)笔Ш螅Y(jié)直腸癌進展快速跨越早期病理階段，缺乏一個早期防控的窗口期，無法有效的對藥物及營養(yǎng)素的早期結(jié)直腸癌防控功效進行評價。

2、結(jié)直腸癌(crc)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型是研究腫瘤生物學和測試新治療方法的重要工具。以下是一些目前常用的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型：

3、apc?min/+(multiple?intestinal?neoplasia)模型：apc基因突變與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關。在這個模型中，小鼠攜帶有apc基因的突變，從而導致自發(fā)性小腸和結(jié)直腸腺瘤的發(fā)展。apc?min/+模型中的小鼠表現(xiàn)出與人類家族性腺瘤性息肉病(fap)相似的腫瘤特征。但是該模型腫瘤主要發(fā)生在小腸，而人類結(jié)直腸癌更多發(fā)生在結(jié)直腸區(qū)域。這一差異可能影響模型在某些研究中的適用性。apc?min/+模型為研究結(jié)直腸癌的遺傳、分子機制和治療策略提供了重要的平臺。然而，由于其腫瘤發(fā)生的部位與人類結(jié)直腸癌存在差異，需要在使用該模型時謹慎解讀數(shù)據(jù)。

4、p53突變腸癌模型：在該模型中，小鼠展現(xiàn)出加速的腫瘤發(fā)生過程，與人類中p53突變相關的腫瘤具有高度相似性。p53突變模型中的腫瘤表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)移性，尤其是到肝臟和肺部，這為研究腫瘤的轉(zhuǎn)移機制提供了重要工具。其存在的問題是腸道所有上皮細胞中的p53都是純合敲除。

5、除了轉(zhuǎn)基因模型外，亦有化學誘導aom/dss結(jié)直腸癌模型。aom/dss模型在復制炎癥驅(qū)動的結(jié)直腸癌(crc)方面，展示了與人類crc相似的多階段癌變過程。從炎癥誘導的上皮損傷到腺瘤和癌癥的發(fā)展，該模型揭示了腫瘤的進展與慢性炎癥之間的直接聯(lián)系。但該模型存在劣勢：由于腫瘤的發(fā)展依賴于化學誘導，這可能影響模型的適用性和結(jié)果的解釋；而且采用aom-dss進行誘導時，其會成瘤，成瘤的價值很有限，具體表現(xiàn)為腫瘤細胞周圍的微環(huán)境上皮細胞亦是p53基因突變的細胞，這與人的腸癌發(fā)生過程嚴重不符合。

6、綜上所述，傳統(tǒng)模型均不能模擬人結(jié)直腸腫瘤發(fā)生過程中腫瘤細胞如何與腫瘤微環(huán)境共同演變的過程，亟須一種能更真實模擬腫瘤發(fā)生發(fā)展進程(從基因突變-腫瘤發(fā)生-腫瘤發(fā)展)的小鼠模型。理解腫瘤早期發(fā)生發(fā)展過程，將極大加速解析腫瘤的發(fā)病機理，為藥物及營養(yǎng)素靶向免疫干預提供理論基礎。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于使用madm技術實現(xiàn)了對腸道干細胞中p53基因活性的精確控制，并通過aom誘導的炎癥環(huán)境進一步觀察了p53基因狀態(tài)改變后細胞行為的變化，構(gòu)建了一種自發(fā)性madm-p53突變早期腸癌動物模型而本發(fā)明的模型能實現(xiàn)微環(huán)境細胞與基因突變的細胞區(qū)分度。更重要的是，madm技術實現(xiàn)了基因型與顏色譜系示蹤連鎖，可以通過顏色來判斷基因型，因此這樣可以通過綠色就確定是p53基因突變的細胞；同時因為可以直接通過顏色區(qū)分，就更好的進行腫瘤的分析。

2、本發(fā)明所采取的技術方案是：

3、本發(fā)明的第一方面，提供了一種小鼠結(jié)直腸癌模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟：構(gòu)建p53突變-madm動物模型，然后使用aom誘導。

4、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述構(gòu)建p53突變-madm小鼠模型的方法包括：在小鼠的11號染色體p53基因組位點，構(gòu)建可誘導重組的p53?flox的遺傳基因編輯小鼠，隨后使用madm-chr11小鼠與p53flox突變遺傳小鼠交配獲得p53突變-madm小鼠。

5、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述構(gòu)建p53突變-madm小鼠模型的方法具體包括如下步驟：

6、(1)構(gòu)建stock?i小鼠：將gt11ml小鼠與hprt-cre小鼠交配獲得gtml11；hprt-cre雙雜合小鼠，將gtml11；hprt-cre雙雜合小鼠自交獲得基因型為gt11ml；hprt-cre的stocki小鼠。構(gòu)建stock?ii小鼠：將tg11ml小鼠與p53?flox小鼠交配產(chǎn)生tg11ml，p53?flox雙雜合陽性小鼠，將雙雜合陽性小鼠與tg11ml小鼠交配獲得基因型為tg11ml，p53?flox的stockii小鼠；

7、(2)將stock?i小鼠與stock?ii小鼠交配，獲得基因型為tg11ml，p53?flox；gt11ml；hprt-cre動物，即p53突變-madm小鼠模型；

8、其中，gt11ml和tg11ml為madm基因；中的g為綠色熒光蛋白，t為紅色熒光蛋白，11為代表madm等位基因敲入在動物11號染色體中，ml為multiple?flox?site；其中gt11ml和tg11ml位于不同染色體。

9、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述綠色熒光蛋白包括gfp。

10、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述綠色熒光蛋白為gfp。

11、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述紅色熒光蛋白包括tdtomato。

12、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述紅色熒光蛋白為tdtomato。

13、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述aom的單次注射劑量是5-20mg/kg

14、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述aom給藥次數(shù)為1次或多次。

15、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述aom給藥次數(shù)為每周1次，連續(xù)2周。

16、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述aom給藥方式包括但不限于靜脈注射、口服、肌肉注射、皮下注射、灌胃、腹腔注射等方式。

17、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述小鼠為4-50周齡，對性別不做特殊限定。

18、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述構(gòu)建方法中，所述小鼠的飼養(yǎng)方式為4-6只/籠，飼養(yǎng)于spf級屏障設施，自由飲食。

19、本發(fā)明的第二方面，提供本發(fā)明第一方面所述的構(gòu)建方法構(gòu)建的動物模型在研究疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制和/或篩選能夠預防、緩解或治療疾病的藥物中的應用。

20、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述疾病包括腫瘤。

21、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述腫瘤為結(jié)直腸癌。

22、本發(fā)明還提供了一種篩選能夠預防、緩解或治療結(jié)直腸癌的藥物的方法，包括給藥小鼠待測藥物，檢測給藥前后小鼠腫瘤狀態(tài)；選取可以預防、緩解或治療結(jié)直腸癌的藥物。

23、madm的癌癥模型具有三個獨特的優(yōu)勢使其成為研究癌癥細胞起源和腫瘤發(fā)生發(fā)展的理想工具：

24、(1)madm基于雜合性缺失(loss-of-heterozygosity)的基因突變并產(chǎn)生數(shù)目稀少的癌變細胞。這一過程高度模擬在自發(fā)狀態(tài)下機體產(chǎn)生腫瘤細胞的過程；

25、(2)在起始突變引入細胞的同時即將該細胞和其產(chǎn)生的子代細胞永久性標記gfp，從而實現(xiàn)在傳統(tǒng)病理學分析無法檢測的癌癥初期階段對突變細胞行為進行高分辨率的觀察和細胞世系追蹤分析。

26、(3)每產(chǎn)生一個綠色突變細胞，就會有一個紅色正常細胞相伴而生。通過對兩種顏色標記的細胞之間進行比較可以得出關于突變細胞行為異常的精確信息。利用madm的獨特優(yōu)勢，研究腫瘤微環(huán)境演化進程。

27、基于madm技術，本發(fā)明構(gòu)建madm-p53結(jié)直腸癌新模型(基因敲入在11號染色體)，在該模型中，綠色熒光蛋白標記的細胞為p53基因敲除細胞，紅色熒光蛋白為正常細胞(參考圖1)。由于腸道炎癥與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，潰瘍性腸炎(ulcerativecolitis)和克羅恩病(crohn’s?disease)患者發(fā)展為結(jié)直腸癌的風險明顯高于正常人群，因此，本發(fā)明旨在基于madm-p53新模型，采用偶氮甲烷(aom)誘導腸道炎癥，促進p53基因敲除細胞綠色細胞的克隆性擴增，從而獲得不同病理分期的結(jié)直腸癌新模型(早期-中期)。

28、在腫瘤生物學研究中，理解腸道干細胞中特定基因如p53的功能及其在腫瘤發(fā)展中的作用至關重要。本發(fā)明通過結(jié)合hprt-cre誘導的madm(mosaic?analysis?with?doublemarkers)重組技術和化學誘導劑偶氮甲烷(aom)的使用，開發(fā)了一種創(chuàng)新的結(jié)直腸癌模型，該模型能夠模擬癌癥從早期到中期的發(fā)展過程。

29、madm技術是一種先進的遺傳工具，允許在單個細胞層面上精確控制基因表達，特別是在有嚴格細胞類型特異性要求的復雜組織中。在本技術中，通過將hprt啟動子與cre重組酶的表達相結(jié)合，能夠特異性地在腸道干細胞中誘導p53基因的敲除或過表達。這一點是通過madm系統(tǒng)中的cre依賴性重組實現(xiàn)的，該系統(tǒng)允許目標基因在細胞有絲分裂時的特定階段進行敲除或激活，從而產(chǎn)生含有標記的嵌合體細胞克隆。同時由于本發(fā)明的madm為小鼠11號染色體偶聯(lián)，因此其嵌合體等位基因需要位于11號染色體，與madm11連鎖，而p53位于小鼠11號染色體(chr11:69,471,185-69,482,698)位點，滿足與madm11遺傳連鎖的條件。

30、一般來說，madm技術在神經(jīng)科學領域(如大腦)的使用較為廣泛，其在其他組織如腸道的應用相對較少，并且可能面臨一些特定挑戰(zhàn)，例如：cre酶的表達量和活性直接影響到madm重組的效率，hprt啟動子控制的cre酶在腸道細胞中的表達水平正好滿足誘導madm重組的同時產(chǎn)生非常稀釋的干細胞標記，這為偶氮甲烷(aom)誘導促進p53純合敲除細胞快速擴增的核心基礎。

31、通過使用偶氮甲烷(aom)，一種已知能夠誘導腸道炎癥并促進腸癌發(fā)展的化學物質(zhì)，本模型進一步模擬了腸癌的病理環(huán)境。aom的應用不僅加速了帶有p53突變的腸道干細胞的克隆性擴展，還復制了癌癥發(fā)展中的早期到中期階段的環(huán)境壓力和細胞動態(tài)變化。這種結(jié)合使用遺傳和化學誘導的方法允許我們觀察p53功能失調(diào)如何在真實的腸道微環(huán)境中推動腸癌的進展。

32、本發(fā)明的有益效果是：

33、本發(fā)明提供了一種自發(fā)性結(jié)直腸癌小鼠模型的構(gòu)建方法；具體為將基因型為gt11ml；hprt-cre的小鼠與tg11ml,p53?flox小鼠進行交配，最終可穩(wěn)定獲得基因型為tg11ml,p53?flox；gt11ml；hprt-cre小鼠。采用本發(fā)明方法構(gòu)建所得的基因型小鼠在采用氧化偶氮甲烷(aom)造模8周后結(jié)直腸區(qū)域特異特地產(chǎn)生結(jié)直腸腫瘤。采用本發(fā)明構(gòu)建方法構(gòu)建所得的基因型小鼠能夠快速的產(chǎn)生結(jié)直腸癌形狀，發(fā)病率達100％、性狀穩(wěn)定。

34、本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于使用madm技術實現(xiàn)了對腸道干細胞中p53基因活性的精確控制，并通過aom誘導的炎癥環(huán)境進一步觀察了p53基因狀態(tài)改變后細胞行為的變化，構(gòu)建了一種自發(fā)性madm-p53突變早期腸癌動物模型；相比傳統(tǒng)化學藥物誘導小鼠模型更接近、更適用于早期腸癌相關治療方法、藥物以及營養(yǎng)素的開發(fā)；相比其它基因編輯造模或化學藥物造模構(gòu)建的模型，本發(fā)明提供的小鼠結(jié)直腸癌模型具有從基因突變、腫瘤發(fā)生到腫瘤發(fā)展的過程，更能真實模擬腫瘤的發(fā)生發(fā)展全過程，可特異性地在結(jié)直腸產(chǎn)生腫瘤，且可監(jiān)測突變細胞的轉(zhuǎn)移或異常行為等優(yōu)點，對開展相關領域的營養(yǎng)素及藥物研發(fā)具有重要意義。

35、而且本發(fā)明的造模方法創(chuàng)新，結(jié)果穩(wěn)定，填補了針對小鼠早期腸癌領域的模型空白；這種方法的引入，也為研究腸癌發(fā)生的分子機制提供了新的視角，特別是在探索腫瘤抑制基因如p53在早期腸癌發(fā)展中的作用。此外，這一模型的開發(fā)為未來可能的治療靶點提供了實驗平臺，尤其是在針對早期到中期結(jié)直腸癌的干預策略的開發(fā)中。