使用植物無菌水培裝置進行根瘤菌結(jié)瘤效果評價的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種植物無菌水培裝置及采用該裝置進行水培苜蓿的根瘤菌接菌及結(jié)瘤效果的評價方法。
【背景技術(shù)】
[0002]常見的植物無菌苗種植方法是配制瓊脂或植物凝膠等固體培養(yǎng)基，將植物種子消毒后種于固體培養(yǎng)基上。在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)無菌植物苗的方法存在一些缺陷，如苜蓿等植物在固體培養(yǎng)基上存在根發(fā)育緩慢，幼苗生長速度較慢。另外長時間培養(yǎng)后由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素消耗和有毒代謝產(chǎn)物的積累，無菌苗生長受到抑制甚至死亡。此時更換新的固體培養(yǎng)基是一種解決辦法，通常需要將無菌苗從舊的固體培養(yǎng)基中拔出移入新的固體培養(yǎng)基中，此操作容易對植物根造成傷害且操作不方便。
[0003]根瘤菌通過豆科植物根毛、側(cè)根杈口或其他部位侵入，刺激宿主皮層細胞分裂，形成根瘤，根瘤具有固氮功能，將空氣中氮氣還原成NH3,分泌至根瘤細胞內(nèi)，并合成酰胺類或酰尿類化合物，輸出根瘤，由根的傳導(dǎo)組織運輸至宿主地上部分供利用。宿主為根瘤菌提供良好的居住環(huán)境、碳源和能源以及其他必需營養(yǎng)，而根瘤菌則為宿主提供氮素營養(yǎng)，形成共生關(guān)系。
[0004]自然界土壤中存在多種根瘤菌，不同種類根瘤菌在不同豆科植物根部的結(jié)瘤固氮效果不同。為了篩選與苜蓿相匹配的最佳固氮根瘤菌株，通常在大田中進行接菌試驗，但此法存在受土壤中本身存在的根瘤菌及其它自然因素影響的影響。另外，還有方法將苜蓿種于高溫滅菌土壤中，然后接入根瘤菌。此方法存在土壤滅菌不徹底，觀察根瘤時需要將苗從土壤中拔出清洗等操作，存在對根造成較大傷害且操作不方便等缺陷。因此，需要一種便于接菌處理，不受其它細菌、霉菌等因素影響，觀察方便的根瘤菌接菌及結(jié)瘤效果評價的裝置和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可以實現(xiàn)多種適合水培植物的快速簡單無菌苗培養(yǎng)的植物無菌水培裝置。本發(fā)明還提供了采用本發(fā)明所述的植物無菌水培裝置進行水培苜蓿的根瘤菌接菌及結(jié)瘤效果的評價方法。
[0006]—種植物無菌水培裝置，包括玻璃杯和固定在其內(nèi)部的底部的至少一個濾網(wǎng)，在所述濾網(wǎng)內(nèi)設(shè)置有培養(yǎng)基質(zhì)，所述玻璃杯的頂部開口采用封口膜封口，在所述玻璃杯內(nèi)設(shè)置有水培液，所述水培液的液面高度低于所述培養(yǎng)基質(zhì)的上表面。
[0007]本發(fā)明所述的植物無菌水培裝置，其中，所述玻璃杯的內(nèi)部的底部中心位置設(shè)置有固定柱，所述濾網(wǎng)的底部設(shè)置有與所述固定柱相匹配的固定孔，所述固定孔穿過所述固定柱固定在所述玻璃杯的底部，所述濾網(wǎng)為不銹鋼筒狀濾網(wǎng)，所述濾網(wǎng)的頂部直徑大于底部直徑。
[0008]本發(fā)明所述的植物無菌水培裝置，其中，所述濾網(wǎng)采用厚度為0.5mm、孔密度為10目的不銹鋼濾網(wǎng)制作而成，所述濾網(wǎng)的底部外徑為40mm，頂部外徑為43mm，高度為50mm ;所述固定孔的直徑為1mm0
[0009]本發(fā)明所述的植物無菌水培裝置，其中，所述濾網(wǎng)為一個或多個，當(dāng)所述濾網(wǎng)為多個時，多個所述濾網(wǎng)上下疊加到設(shè)計高度，最底部的所述濾網(wǎng)固定在所述玻璃杯的底部，在最上端的所述濾網(wǎng)中設(shè)置有所述培養(yǎng)基質(zhì)，相鄰兩個所述濾網(wǎng)之間的疊加部分的高度為30mmo
[0010]本發(fā)明所述的植物無菌水培裝置，其中，所述玻璃杯的側(cè)壁的下部設(shè)置有換液口，所述換液口采用錐形橡膠塞密封；所述換液口為圓柱形管體，長度為5mm，內(nèi)徑為8mm、外徑為10mm，其一端與所述玻璃杯的下部相連，另一端采用所述錐形橡膠塞密封，所述錐形橡膠塞的長度為10mm，一端直徑為5mm，另一端直徑為1mm ;所述培養(yǎng)基質(zhì)為粒徑3?5mm的石英砂。
[0011]本發(fā)明所述的植物無菌水培裝置，其中，所述玻璃杯為圓桶形，側(cè)壁和底部的厚度為3mm，內(nèi)徑為94mm，外徑為100mm，高度為200?300mm，所述固定柱為圓柱形玻璃柱，直徑為8mm，高度為30mm。
[0012]采用本發(fā)明所述的植物無菌水培裝置進行水培苜蓿的根瘤菌接菌及結(jié)瘤效果的評價方法，包括如下步驟:
[0013](A)、準備工作:將裝有培養(yǎng)基質(zhì)的濾網(wǎng)與玻璃杯組合，用封口膜將玻璃杯上口密封，使用錐形橡膠塞將底部換液口密封，形成植物無菌水培裝置，將其在121°C下濕熱滅菌30min后放入超凈臺備用；配制水培液，121°C下濕熱滅菌30min放入超凈臺備用；
[0014](B)、播種:篩選籽粒飽滿的苜蓿種子，使用75%酒精消毒15min，然后用滅菌蒸餾水沖洗三遍，每遍lmin，將滅菌苜蓿種子分別在不同根瘤菌株液中浸泡2?5小時，打開所述植物無菌水培裝置的封口膜，將I?2粒接菌后的苜蓿種子放入濾網(wǎng)中的培養(yǎng)基質(zhì)的表面，沿所述玻璃杯的內(nèi)側(cè)壁加入經(jīng)高溫滅菌的所述水培液，液面高度低于所述培養(yǎng)基質(zhì)的表面高度，然后用封口膜將所述玻璃杯上口密封，播種操作均在超凈工作臺內(nèi)完成；將播種后的植物無菌水培裝置置于人工氣候箱中培養(yǎng)；
[0015](C)、更換水培液:每6?10天在超凈臺中更換一次所述水培液，更換所述水培液時將玻璃杯的底部錐形橡膠塞取出使所述水培液經(jīng)換液口流出，待所述水培液全部流出后重新使用所述錐形橡膠塞密封換液口，打開所述封口膜后沿內(nèi)側(cè)壁加入新的所述水培液，每更換一次所述水培液，其液面高度比前一次更換時的水培液的高度降低5?10_ ;最終液面低于水培液液面30?50mm ；
[0016](D)、觀察評價:將水培30天以上的苜蓿幼苗取出，并觀察評價不同根瘤菌的結(jié)瘤效果；
[0017]其中，所述水培液為無氮MS水培液。
[0018]采用本發(fā)明所述的植物無菌水培裝置進行水培苜蓿的根瘤菌接菌及結(jié)瘤效果的評價方法，包括如下步驟:
[0019](a)、準備工作:將裝有培養(yǎng)基質(zhì)的濾網(wǎng)與玻璃杯組合，配制Hogland水培液和無氮MS水培液；將所述Hogland水培液沿所述玻璃杯的內(nèi)側(cè)壁加入到所述玻璃杯內(nèi)，液面高度低于培養(yǎng)基質(zhì)表面高度，用封口膜將所述玻璃杯的上口密封，形成植物無菌水培裝置，在121°C下濕熱滅菌30min后放入超凈臺備用；
[0020](b)、打開所述植物無菌水培裝置的所述封口膜，選取發(fā)芽5天生長健壯的無菌苜蓿幼苗，將無菌苜蓿幼苗放入所述濾網(wǎng)中的培養(yǎng)基質(zhì)表面，然后用所述封口膜將所述玻璃杯口密封，上述操作均在超凈工作臺內(nèi)完成；將移栽無菌苗的所述植物無菌水培裝置置于人工氣候箱中培養(yǎng)；
[0021](c)、每6?10天在超凈臺中更換一次水培液，更換Hogland水培液時將所述玻璃杯的底部錐形橡膠塞取出，使水培液經(jīng)換液口流出，待Hogland水培液全部流出后重新使用所述錐形橡膠塞密封換液口，打開上部封口膜，沿所述玻璃杯的內(nèi)側(cè)壁加入新的Hogland水培液，每次更換新Hogland水培液的液面高度逐漸降低，最終液面高度低于所述培養(yǎng)基質(zhì)3的表面高度30?50mm ；
[0022](d)、經(jīng)無菌水培15天，苜蓿幼苗長出較多側(cè)根，取2種苜蓿根瘤菌保存液0.1mL分別接種于1mL液體YEB培養(yǎng)基中，在搖床中200r/min，28°C振蕩培養(yǎng)10?20小時，根瘤菌培養(yǎng)至濃度達到0D6。。= 0.5?0.8時備用，分別取0.2mL剛搖好的根瘤菌菌液加入苜蓿幼苗根部，將Hogland水培液更換為無氮MS水培液，每6?10天更換一次水培液，經(jīng)根瘤菌接菌水培30天的苜蓿苗用于結(jié)瘤效果的觀察評價，取出苜蓿根，記錄根瘤數(shù)量、大小和顏色，評價不同根瘤菌株的結(jié)瘤效果。
[0023]本發(fā)明植物無菌水培裝置及采用該裝置進行水培苜蓿的根瘤菌接菌及結(jié)瘤效果的評價方法與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于:
[0024]本發(fā)明植物無菌水培裝置可以通過高溫滅菌處理后進行無菌水培；以不銹鋼濾網(wǎng)盛放石英砂作為培養(yǎng)基質(zhì)便于植物幼苗的固定和根的生長；杯體下部有換液孔，在長時間培養(yǎng)時便于水培液更換且不易造成污染；該水培系統(tǒng)可以對多種豆科植物進行快速高效的無菌水培及根瘤菌接菌及結(jié)瘤效果觀察評價。
[0025]使用本發(fā)明植物無菌水培裝置進行植物無菌水培的方法具有如下優(yōu)點:
[0026]選擇滅菌處理的植物種子或無菌植物幼苗于本裝置中進行培養(yǎng)，與常規(guī)開放式水培方法相比，采用