具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白及其生產(chǎn)方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請根據(jù)美國法典35 § 119(e)要求2013年2月13日提交的標(biāo)題為"具有經(jīng)修 飾的糖基化的蛋白及其生產(chǎn)方法"的美國臨時(shí)申請系列號61/764, 502的權(quán)益，其全部公開 通過提述完整并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及蛋白和蛋白生產(chǎn)方法的領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0004] 蛋白在乳腺中的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生允許大量蛋白的產(chǎn)生，包括治療性蛋白。然而，在乳腺 中產(chǎn)生的蛋白的糖基化模式有時(shí)候與血清產(chǎn)生的蛋白的糖基化模式不同。因此，需要修飾 乳腺產(chǎn)生的蛋白的糖基化的方法。
[0005] 發(fā)明簡述
[0006] 在一個(gè)方面，本公開提供具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白及其生產(chǎn)方法。一方面，本公 開提供用于生產(chǎn)具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所 述經(jīng)修飾的糖基化是增加的唾液酸化。
[0007] 在一個(gè)方面，本公開提供生產(chǎn)具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白的方法，所述方法包含 提供轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物，其已經(jīng)經(jīng)過修飾以在乳腺中具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，其中 所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在乳腺中表達(dá)蛋白，并且從所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺中收獲所述蛋 白。
[0008] 在一個(gè)方面，本公開提供生產(chǎn)具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白的方法，所述方法包括 提供乳腺上皮細(xì)胞，其已經(jīng)經(jīng)過修飾以具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，其中所述乳腺上皮 細(xì)胞表達(dá)蛋白，并且從所述乳腺上皮細(xì)胞中收獲所述蛋白。
[0009] 在本文提供的方法的一些實(shí)施方案中，與在尚未修飾為具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白相比，糖基化是經(jīng)修飾的。在本文提 供的方法的一些實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的糖基化是增加的唾液酸化。
[0010] 在一個(gè)方面，本公開提供生產(chǎn)具有增加的唾液酸化的蛋白的方法，所述方法包含 提供轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物，其已經(jīng)經(jīng)過修飾以在乳腺中具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，其中 所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物在乳腺中表達(dá)蛋白，并且從所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺中收獲具有增 加的唾液酸化的蛋白。
[0011] 在本文提供的方法的一些實(shí)施方案中，與在尚未修飾為具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶 表達(dá)的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白相比，唾液酸化是增加的。
[0012] 在本文提供的方法的一些實(shí)施方案中，所述具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白或具有增 加的唾液酸化的蛋白是人蛋白。在本文提供的方法的一些實(shí)施方案中，所述具有經(jīng)修飾的 糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是抗體。在本文提供的方法的一些實(shí)施方案 中，所述具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白是抗凝血酶。在本文提 供的方法的一些實(shí)施方案中，所述具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋 白是α-1抗胰蛋白酶。
[0013] 在一個(gè)方面，本公開提供了根據(jù)本文中提供的任何方法生產(chǎn)的具有經(jīng)修飾的糖基 化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白。
[0014] 在一個(gè)方面，本公開提供組合物，其包含根據(jù)本文提供的任意方法生產(chǎn)的具有經(jīng) 修飾的糖基化的蛋白或具有增加的唾液酸化的蛋白，所述組合物進(jìn)一步包含乳。
[0015] 在一個(gè)方面，本公開提供在乳腺中增加唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的方法，所述方法包含 提供轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其已經(jīng)經(jīng)過修飾以在乳腺中具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)。
[0016] 在一個(gè)方面，本公開提供生產(chǎn)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包含提供轉(zhuǎn)基因哺 乳動(dòng)物，其已經(jīng)經(jīng)過修飾以在乳腺中具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，以及從所述轉(zhuǎn)基因哺 乳動(dòng)物的乳腺中收獲唾液酸轉(zhuǎn)移酶。在本文提供的方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一 步包括使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶來使蛋白唾液酸化。
[0017] 在一個(gè)方面，本公開提供在乳腺中增加唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性的方法，所述方法包含 生成轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物，其已經(jīng)經(jīng)過修飾以在乳腺中具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)。在一 個(gè)方面，本公開提供生產(chǎn)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的方法，所述方法包含生成轉(zhuǎn)基因的哺乳動(dòng)物，其已 經(jīng)經(jīng)過修飾以在乳腺中具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，并從所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳腺中 收獲唾液酸轉(zhuǎn)移酶。在本文提供的方法的一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包含使用唾液 酸轉(zhuǎn)移酶來使蛋白唾液酸化。在一些實(shí)施方案中，將唾液酸轉(zhuǎn)移酶置于與所述蛋白接觸。
[0018] 在一個(gè)方面，本公開提供根據(jù)本文提供的任意方法生產(chǎn)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
[0019] 在一個(gè)方面，本公開提供組合物，其包含根據(jù)本文提供的任意方法生產(chǎn)的唾液酸 轉(zhuǎn)移酶，并進(jìn)一步包含乳。
[0020] 在本文提供的方法、蛋白、組合物、轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞的一些實(shí)施方 案中，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞已經(jīng)通過將編碼唾液酸轉(zhuǎn)移酶的核酸序列引入所述 轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞的基因組中來修飾。
[0021 ] 在本文提供的方法、蛋白、組合物、轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞的一些實(shí)施方 案中，在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)的蛋白由引入所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺 上皮細(xì)胞的基因組中的核酸序列編碼。
[0022] 在一個(gè)方面，本公開提供轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其已經(jīng)經(jīng)過修飾以在乳腺中具有增加 的唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)。在本文提供的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因哺乳 動(dòng)物進(jìn)一步在乳腺中表達(dá)外源性蛋白。在本文提供的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的一些實(shí)施方案中， 所述外源性蛋白是人蛋白。在本文提供的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的一些實(shí)施方案中，外源性蛋白 是抗體。在本文提供的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的一些實(shí)施方案中，所述外源性蛋白是抗凝血酶。在 本文提供的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的一些實(shí)施方案中，所述外源性蛋白是α-1抗胰蛋白酶。
[0023] 在一個(gè)方面，本公開提供乳腺上皮細(xì)胞，其已經(jīng)經(jīng)過修飾以具有增加的唾液酸轉(zhuǎn) 移酶表達(dá)。在本文提供的乳腺上皮細(xì)胞的一些實(shí)施方案中，所述乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá) 外源性蛋白。在本文提供的乳腺上皮細(xì)胞的一些實(shí)施方案中，所述外源性蛋白是人蛋白。在 本文提供的乳腺上皮細(xì)胞的一些實(shí)施方案中，外源性蛋白是抗體。在本文提供的乳腺上皮 細(xì)胞的一些實(shí)施方案中，所述外源性蛋白是抗凝血酶。在本文提供的乳腺上皮細(xì)胞的一些 實(shí)施方案中，所述外源性蛋白是α-l抗胰蛋白酶。
[0024] 在本文提供的方法、蛋白、組合物、轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞的一些實(shí)施方 案中，所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是有蹄類動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，所述有蹄類動(dòng)物是山羊。
[0025] 在本文提供的方法、蛋白、組合物、轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞的一些實(shí)施方 案中，唾液酸轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)在乳啟動(dòng)子的控制下。在一些實(shí)施方案中，所述乳啟動(dòng)子是山羊 β酷蛋白啟動(dòng)子。
[0026] 在本文提供的方法、蛋白、組合物、轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞的一些實(shí)施方 案中，所述唾液酸轉(zhuǎn)移酶是β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（beta-galactosamide alpha-2, 6-sialyltranferase) 〇
[0027] 在本文提供的方法、蛋白、組合物、轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物或乳腺上皮細(xì)胞的一些實(shí)施方 案中，所述唾液酸轉(zhuǎn)移酶是β-半乳糖酰胺α-2, 3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶。
[0028] 本發(fā)明的每種限制可以涵蓋本發(fā)明的各種實(shí)施方案。因此，預(yù)期每種涉及任意一 種元素或元素組合的本發(fā)明的限制可以包括在本發(fā)明的每個(gè)方面中。本發(fā)明在其應(yīng)用上不 限于以下描述中所列或圖中顯示的組分的構(gòu)建和排列的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠有其它實(shí)施方案 并能夠以各種方式實(shí)踐或?qū)嵤Ａ硗猓疚氖褂玫拇朕o和術(shù)語用于描述的目的，而不應(yīng)理解 為限制性的。
[0029] 附圖簡述
[0030] 圖僅為說明性的，對于本公開的啟用不是必須的。
[0031] 圖1示出了與人蛋白（SEQIDΝ0:2)比較（標(biāo)示為"對象"的底部序列）ST6f3-半 乳糖酰胺α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶GENEID: 100861310ST6GAL1[山羊]的序列（SEQID NO: 1)(標(biāo)示為"查詢"的上部序列）。
[0032] 圖2提供了ST6β-半乳糖酰胺α-2, 6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因的圖示。
[0033] 圖3提供了等電點(diǎn)聚焦（IEF)凝膠，顯示具有增加的唾液酸水平的蛋白。圖3Α 描述了兩塊凝膠：左側(cè)組中的凝膠顯示了pi標(biāo)準(zhǔn)梯（第1道），α-抗胰蛋白酶（ΑΑΤ，第2 道），以及使用商業(yè)化的唾液酸轉(zhuǎn)移酶混合物處理的ΑΑΤ(第3道）。右側(cè)組中的凝膠描述 了pi標(biāo)準(zhǔn)梯（第1道），使用唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理前的ΑΑΤ(第2道），使用商業(yè)化的唾液酸 轉(zhuǎn)移酶混合物處理后的AAT(第3道），或使用從轉(zhuǎn)基因山羊的乳中純化的單個(gè)唾液酸轉(zhuǎn)移 酶處理后的AAT(第4和5道）。圖3B描繪了凝膠，其示出了Alfala:stin(? (AAT的一種唾 液酸化形式）（第1道），使用從產(chǎn)生唾液酸轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因山羊的乳處理的AAT(第2道和 第7道），使用來自對照動(dòng)物的乳處理的AAT(第3和8道），使用來自對照動(dòng)物的乳和轉(zhuǎn)基 因產(chǎn)生的唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理的AAT(第4道），使用緩沖液和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的唾液酸轉(zhuǎn)移酶處 理的AAT(第5道），以及使用緩沖液處理的AAT(第6道）。
[0034] 圖4提供的圖解示出了使用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的唾液酸轉(zhuǎn)移酶在體外使α1抗胰蛋白酶 唾液酸化。
[0035] 圖5示出了在乳腺中過表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因山羊（第2列）和對照動(dòng)物 (第1列）中乳鐵蛋白的唾液酸化。
[0036] 圖6示出了在產(chǎn)生唾液酸轉(zhuǎn)移酶和ΑΑΤ兩者（頂部圖）和僅產(chǎn)生ΑΑΤ(底部圖） 的山羊的乳腺中，ΑΑΤ的"體內(nèi)"唾液酸化。
[0037] 圖7示出了與血漿衍生的AAT (pdAAT)相比，ST3和ST6唾液酸化的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的 AAT的藥代動(dòng)力學(xué)特性。
[0038] 發(fā)明詳述
[0039] 在一個(gè)方面，本公開提供具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白及其生產(chǎn)方法。在一個(gè)方面， 本公開提供用于生產(chǎn)具有經(jīng)修飾的糖基化的蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物和細(xì)胞。
[0040] 在一個(gè)方面，本公開提供具有增加的唾液酸化的蛋白及其生產(chǎn)方法。在一個(gè)方面， 本公開提供用于生產(chǎn)具有增加的唾液酸化的蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物和細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基 因哺乳動(dòng)物或細(xì)胞經(jīng)修飾以具有增加的唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達(dá)。
[0041] 在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的乳腺中生產(chǎn)蛋白具有允許大量蛋白產(chǎn)生的優(yōu)勢。多種蛋 白可以在乳腺中產(chǎn)生，并且在非人哺乳動(dòng)物中轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)已經(jīng)用于產(chǎn)生人治療性蛋白，例 如血清蛋白。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的血清蛋白的一個(gè)例子是一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的抗凝血酶， 其已經(jīng)在美國和歐洲批準(zhǔn)應(yīng)用（見，例如，US5, 843, 705,US6, 441，145,US7, 019, 193和US7,928,064)。
[0042] 在乳腺中轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的蛋白與"天然"蛋白具有相同的氨基酸序列，只要引入轉(zhuǎn)基 因哺乳動(dòng)物中的編碼所述蛋白的核酸與"天然"蛋白相同。然而，如果所述轉(zhuǎn)基因蛋白是糖 蛋白，那么與"天然"蛋白相比，在轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的乳腺中產(chǎn)生的蛋白的糖基化模式 可以有不同。例如，與從血清中分離的相同蛋白相比，乳腺產(chǎn)生的蛋白可以具有更低的唾液 酸化水平（見例如Edmunds,T，etal.，Blood91(12)，1998,4561-4571;Geun-CheolGilet al.，Glycobiology18(7)，2008, 526 - 539)。重組產(chǎn)生的蛋白和天然蛋白之間糖基化的差 異并不是乳腺中產(chǎn)生的重組（轉(zhuǎn)基因）蛋白所獨(dú)有的。重組蛋白的幾乎任何產(chǎn)生方法（例 如在CH0細(xì)胞中產(chǎn)生）可以導(dǎo)致與天然蛋白相比的糖基化差異，這僅僅是因?yàn)榧?xì)胞類型之 間糖基化酶的不同可用度和活性。重組產(chǎn)生的蛋白的糖基化的差異可以是相關(guān)或不相關(guān)