一種液基薄層細(xì)胞保存液及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種液基薄層細(xì)胞保存液及其制備方法，所述液基薄層細(xì)胞保存液由以下組分組成：KCl1％?3％；KH2PO41％?3％；Na2HPO40.1％?1％；EDTA?2Na0.01％?0.1％；乙二醇5％?10％；dd H2O70％?77.79％；異丙醇15％?20％；甲醛0.1％?1％。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：采用KCl、KH2PO4和Na2HPO4混合體系，調(diào)節(jié)液基薄層細(xì)胞保存液內(nèi)Na+、K+濃度以保持細(xì)胞固定時(shí)細(xì)胞內(nèi)外合理的滲透壓，同時(shí)形成中性的緩沖體系，能固定正常和病變后的宮頸脫落細(xì)胞形態(tài)和大小，提高細(xì)胞保存的完整性和可靠性，其次，通過(guò)乙二醇和異丙醇組成的滲透性防凍劑，在細(xì)胞低溫保存時(shí)防止液基細(xì)胞保存液內(nèi)的水分結(jié)冰，最后，通過(guò)采用較低濃度的甲醛，在固定細(xì)胞的同時(shí)與EDTA?2Na聯(lián)合提高液基薄層細(xì)胞保存液的殺菌性能，提高安全性。
【專利說(shuō)明】
一種液基薄層細(xì)胞保存液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及宮頸細(xì)胞病理檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種液基薄層細(xì)胞保存液及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 液基細(xì)胞保存液是液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要耗材。液基薄層細(xì)胞制片檢查系統(tǒng)處 理技術(shù)誕生于1991年，率先應(yīng)用于婦科細(xì)胞學(xué)檢查，國(guó)內(nèi)從2001年開(kāi)始作液基細(xì)胞學(xué)篩查 宮頸癌的研究，使該項(xiàng)技術(shù)得到迅速發(fā)展。液基細(xì)胞保存液在婦科細(xì)胞學(xué)檢查中，一般采用 將樣品細(xì)胞固定在溶液中，即終止任何正在進(jìn)行的生化反應(yīng)，增加樣品的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定 性，盡可能以接近生物材料的天然狀態(tài)來(lái)保存樣品，用于檢驗(yàn)或者分析。
[0003] 公開(kāi)號(hào)為CN105409925A的中國(guó)專利《一種液基細(xì)胞保存液》公開(kāi)了一種液基細(xì)胞 保存液，涉及一種病理檢驗(yàn)，尤其是對(duì)人體的子宮頸粘液、痰液、尿液、漿膜腔積液、氣管粘 液等細(xì)胞病理檢驗(yàn)時(shí)使用的液基細(xì)胞保存液。該液基細(xì)胞保存液是由醇類(lèi)、磷酸鈉緩沖液、 乙二胺四乙酸二鈉、氯化鈉0.08 % -0.12 %、氯化鉀、甲醛、二硫蘇糖醇、醋酸鈣、醋酸鎂等配 制而成。
[0004] 但是該液基細(xì)胞保存液存在以下缺點(diǎn)：磷酸鈉緩沖液與醋酸鈣、醋酸鎂發(fā)生化學(xué) 反應(yīng)后生成磷酸鎂磷酸鈣沉淀和醋酸鈉、醋酸，磷酸鈉緩沖液形成的中性緩沖系統(tǒng)被破壞， 化學(xué)反應(yīng)后形成的醋酸和醋酸鈉組成新的酸性的緩沖系統(tǒng)，醋酸具有腐蝕性，使細(xì)胞病理 檢測(cè)中的子宮頸粘液等樣品中的紅細(xì)胞在酸性和腐蝕性的環(huán)境下破裂，破裂的紅細(xì)胞釋放 內(nèi)容物如血紅蛋白等，會(huì)對(duì)后續(xù)的分析和檢測(cè)產(chǎn)生不良影響，例如血紅蛋白沉積后會(huì)妨礙 梅格吉染色、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)等等

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種液基薄層細(xì)胞保存液，具有穩(wěn)定溶液緩沖體系，細(xì)胞形 態(tài)完整性好的效果。
[0006] 本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：一種液基薄層細(xì)胞保存 液，以質(zhì)量百分比計(jì)，所述液基薄層細(xì)胞保存液由以下成分組成 KC1 1%-3%.; ΚΗ,ΡΟ, 1%-3%; Na,HP〇4 0. ΕΓ/ΓΑ-2Na 0.01%-0.1%;. 乙二醇 5%-10%; dd Η,Ο 70%-77. 79%;; 異丙醇 15%-20%; 甲醛 0. 1%-1%。
[0008]細(xì)胞，是能進(jìn)行獨(dú)立繁殖的有膜包圍的生物體的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，其一般由 質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和核（或擬核）構(gòu)成。細(xì)胞內(nèi)的主要陽(yáng)離子是Κ+和Na+，當(dāng)將細(xì)胞置于外環(huán)境中 時(shí)，細(xì)胞內(nèi)、外的K+和Na+的存在一定的濃度差，這將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)、外的壓力不平衡，使得細(xì)胞 內(nèi)的水分外流或細(xì)胞外的溶液進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，這兩種情況均會(huì)造成細(xì)胞膜破裂且細(xì)胞無(wú)法保 持其原始狀態(tài)，影響檢測(cè)結(jié)果。本申請(qǐng)采用KC1、KH 2P〇4和Na2HP〇4混合體系來(lái)調(diào)節(jié)，本申請(qǐng)的 一種液基細(xì)胞保存液中的K+和Na+濃度，平衡細(xì)胞內(nèi)外的K+和Na+濃度，從而平衡細(xì)胞內(nèi)外的 壓力。首先，通過(guò)KC1和KH 2P〇4對(duì)本申請(qǐng)的一種液基細(xì)胞保存液中的可溶性K+進(jìn)行補(bǔ)充，以增 加細(xì)胞外的K+濃度來(lái)與細(xì)胞內(nèi)主要陽(yáng)離子K+平衡;其次，KH 2P〇4和Na2HP〇4組成的緩沖系統(tǒng)， 可用于調(diào)節(jié)本申請(qǐng)的一種液基細(xì)胞保存液的PH，有利于穩(wěn)定平衡細(xì)胞內(nèi)、外的壓力，其中本 申請(qǐng)的緩沖系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)理為：當(dāng)本申請(qǐng)的一種液基細(xì)胞保存液固定細(xì)胞時(shí)，pH值過(guò)高時(shí)， 多余的堿就會(huì)與磷酸二氫根離子形成磷酸氫根離子，降低溶液的pH值；當(dāng)pH值過(guò)低時(shí)，磷酸 氫根離子就會(huì)與酸中的氫離子形成磷酸二氫根離子，提高溶液的pH值，有助于保持溶液恒 定的pH值，使細(xì)胞不會(huì)在細(xì)胞固定中因 pH變化而破裂;綜上，通過(guò)KC1、KH2P〇4和Na2HP〇4的組 合作用，將細(xì)胞置于本申請(qǐng)中的一種液基細(xì)胞保存液后，細(xì)胞處于合理的滲透性狀態(tài)，既不 會(huì)大量吸水而破裂，也不會(huì)失去水分而收縮，能避免滲透壓造成細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核 膜的破裂，從而避免細(xì)胞破裂，保持細(xì)胞的正常形態(tài)，進(jìn)一步提高細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
[0009] 檢測(cè)用細(xì)胞保持完整是細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果可靠性的前提，本申請(qǐng)通過(guò)乙二醇、異丙醇 和甲醛的聯(lián)合作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的固定，其作用過(guò)程為：當(dāng)樣品細(xì)胞剛放入液基細(xì)胞保存 液，在細(xì)胞未失活前，乙二醇、異丙醇和甲醛與樣品細(xì)胞接觸，首先，甲醛與細(xì)胞膜上蛋白質(zhì) 的氨基發(fā)生反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞大小形態(tài)進(jìn)行固定，使得后期作用時(shí)細(xì)胞大小不會(huì)發(fā)生收縮(如醇 作用于細(xì)胞后細(xì)胞存在收縮）的情況，保持細(xì)胞完整性;其次，乙二醇和異丙醇擴(kuò)散到細(xì)胞 質(zhì)液內(nèi)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，使細(xì)胞失活固定時(shí)保持在正常的狀態(tài);綜上，通過(guò)乙二醇、異丙醇 和甲醛的組合作用，細(xì)胞得到固定且固定后的細(xì)胞完整；另外，甲醛可以與抗凝聚機(jī)EDTA-2Na相聯(lián)合，在固定細(xì)胞的同時(shí)防止細(xì)胞發(fā)生凝聚，進(jìn)一步提高細(xì)胞檢測(cè)的操作可行性和結(jié) 果可靠性。
[0010] 本申請(qǐng)的一種液基細(xì)胞保存液還具有較好的抑菌效果：本申請(qǐng)采用O.lwt%-lwt%的甲醛，甲醛兼具有良好的抗菌性能，可以減少外加抗菌劑的使用;革蘭氏陰性菌的 肽聚糖層位于細(xì)胞內(nèi)壁層，其外覆蓋大量的脂多糖，EDTA-2Na與甲醛聯(lián)合作用后，EDTA-2Na 與細(xì)胞表面的脂多糖之間鹽橋二價(jià)陽(yáng)離子鰲合，使細(xì)菌的細(xì)胞膜失去穩(wěn)定性，達(dá)到增強(qiáng)液 基細(xì)胞保存液殺菌性能的作用，可以提尚安全性。
[0011] 本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述液基薄層細(xì)胞保存液中Κ Η 2 P 0 4的質(zhì)量百分比為 lwt%_l .5wt%，Na2HP〇4的質(zhì)量百分比為0.8wt%_lwt%。
[0012]宮頸粘液中正常的pH為7.0-8.2，偏弱堿性，但是病變后的宮頸粘液pH降低，變成 酸性。在用本申請(qǐng)的一種液基薄層細(xì)胞保存液對(duì)宮頸粘液內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行保存時(shí)，KH2P〇4溶于 水后電離出K+和H2PO4-，Na 2HP04溶于水后電離出NA+和HP〇42-，KH2P〇4的質(zhì)量百分比高于 Na2HP〇4的質(zhì)量百分比，使本申請(qǐng)的液基薄層保存液pH在6-7之間，偏弱酸性，病變后酸性的 宮頸粘液內(nèi)脫落細(xì)胞進(jìn)入弱酸性的液基薄層保存液中時(shí)，脫落細(xì)胞所處的環(huán)境pH不會(huì)變化 較大，不會(huì)從酸性環(huán)境直接過(guò)渡到堿性環(huán)境，避免細(xì)胞在固定時(shí)pH發(fā)生較大變化而破裂，進(jìn) 一步提尚細(xì)胞固定的完整性和可靠性。
[0013]本發(fā)明的進(jìn)一步設(shè)置為：所述液基薄層細(xì)胞保存液內(nèi)甲醛的質(zhì)量百分比為 0. lwt%-〇.8wt% 〇
[0014] 甲醛是易揮發(fā)的刺激性氣體，具有毒性、致突變性、生殖毒性和致癌性，人對(duì)甲醛 的嗅覺(jué)閾通常是0.06-0.07mg/m3,長(zhǎng)期、低濃度接觸甲醛會(huì)引起頭痛、頭暈、乏力、感覺(jué)障 礙、免疫力降低，并可出現(xiàn)瞌睡、記憶力減退或神經(jīng)衰弱、精神抑郁，本申請(qǐng)的一種液基薄層 細(xì)胞保存液采用較低濃度的甲醛含量，質(zhì)量百分比為〇. lwt %-0.8wt %，使本申請(qǐng)的液基薄 層細(xì)胞保存液內(nèi)的甲醛僅具有刺激性，不會(huì)對(duì)人員健康產(chǎn)生影響，進(jìn)一步提高安全性。
[0015] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種液基薄層細(xì)胞保存液的制備方法，包括如下步 驟：
[0016] a)將配方量的Na2HP〇4、KH2P〇4、KCl、EDTA-2Na溶解于dd H20中形成溶液a;
[0017] b)將步驟a)獲得的溶液a攪拌均勻，得到溶液b;
[0018] c)向步驟b)獲得的溶液b中加入配方量的乙二醇、異丙醇，攪拌均勻，得到溶液c;
[0019] d)向步驟c)獲得的溶液中加入配方量的甲醛，攪拌均勾；
[0020] 以上各步驟都是在常溫，濕度<90%RH下進(jìn)行。
[0021] 綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果:采用KC1、KH2P〇4和Na2HP〇4混合體系，調(diào)節(jié)液 基薄層細(xì)胞保存液內(nèi)Na+、K+濃度以保持細(xì)胞固定時(shí)細(xì)胞內(nèi)外合理的滲透壓，同時(shí)形成中性 的緩沖體系，既能固定處于弱堿性環(huán)境下的正常宮頸脫落細(xì)胞形態(tài)和大小，又能固定病變 后處于酸性環(huán)境下的宮頸脫落細(xì)胞形態(tài)和大小，其次，通過(guò)乙二醇和異丙醇組成的滲透性 防凍劑，在細(xì)胞低溫保存時(shí)防止液基細(xì)胞保存液內(nèi)的水分結(jié)冰，最后，通過(guò)采用較低濃度的 甲醛，在固定細(xì)胞的同時(shí)與EDTA-2Na聯(lián)合提高液基薄層細(xì)胞保存液的殺菌性能，提高安全 性。
【具體實(shí)施方式】
[0022]具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的解釋，其并不是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員 在閱讀完本說(shuō)明書(shū)后可以根據(jù)需要對(duì)本實(shí)施例做出沒(méi)有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)的修改，但只要在本發(fā) 明的權(quán)利要求范圍內(nèi)都受到專利法的保護(hù)。
[0023]實(shí)施例1: 一種液基薄層細(xì)胞保存液，其由如下方法制備得到：
[0024] 在常溫（25°C )，濕度彡90%RH下，按質(zhì)量份稱取1份KH2P〇4、1份Na2HP〇4、1份KC1、1 份EDTA-2Na放入電攪拌桶內(nèi)，再用量筒量取75.9份dd H20加入電攪拌桶內(nèi)，開(kāi)啟電源以 1500rpm攪拌2小時(shí);再用量筒配合移液器量取5份乙二醇、15份異丙醇加入電攪拌桶內(nèi)，攪 拌30分鐘;再用量筒配合移液器量取0.1份甲醛加入溶液內(nèi)，蓋上筒蓋、攪拌30分鐘。
[0025] 實(shí)施例2: -種液基薄層細(xì)胞保存液，與實(shí)施例1的不同之處在于，按質(zhì)量份，組分 含量為KC13份;KH2P〇43份;Na 2HP〇4〇. 1份;EDTA-2Na0.0 1份；乙二醇 10份；dd H20 62.89份；異 丙醇20份；甲醛1份。
[0026] 實(shí)施例3: -種液基薄層細(xì)胞保存液，與實(shí)施例1的不同之處在于，按質(zhì)量份，組分 含量為KC12份;KH2POU . 2份;Na2HP〇4〇. 9份;EDTA-2NaO. 1份；乙二醇5份;dd H2075.3份;異丙 醇15份；甲醛0.5份。
[0027]實(shí)施例4: 一種液基薄層細(xì)胞保存液，與實(shí)施例3的不同之處在于，按質(zhì)量份，EDTA-2他的份數(shù)為1份，(1(1!120 74.4份。
[0028]對(duì)比例1:與實(shí)施例1的不同之處在于，KH2P〇4更換為醋酸，Na2HP〇4更換為醋酸鈉。 [0029] 對(duì)比例2:與實(shí)施例1的不同之處在于，按質(zhì)量份，甲醛為0份，dd H20 76份。
[0030] 對(duì)比例3:與實(shí)施例3的不同之處在于，按質(zhì)量份，EDTA-2Na含量為0份，dd H20 76.2份。
[0031] 采集一份宮頸分泌物樣品，均等分為7份，每份lg，分別浸入實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí) 施例3、對(duì)比例1、對(duì)比例2、對(duì)比例3、對(duì)比例4所述的15ml的液基薄層細(xì)胞保存液內(nèi)進(jìn)行處 理，再將獲得的液體制備成細(xì)胞懸液，將制備的細(xì)胞懸液進(jìn)行過(guò)濾離心，再將過(guò)濾離心后的 液體分成兩份，一份用作細(xì)胞完整性實(shí)驗(yàn)，另一份進(jìn)行抗菌性實(shí)驗(yàn)。
[0032]試驗(yàn)1細(xì)胞形態(tài)完整性測(cè)試試驗(yàn)
[0033]試驗(yàn)儀器:實(shí)驗(yàn)儀器:復(fù)式雙筒顯微鏡（帶油鏡）、Motic數(shù)碼互動(dòng)系統(tǒng)、擦鏡紙、蓋 玻片、載玻片、鑷子、記號(hào)筆、小片濾紙、吸頭。
[0034] 其他材料:Motic校準(zhǔn)片。
[0035]試驗(yàn)材料:過(guò)濾離心處理后的宮頸細(xì)胞懸液lml。
[0036]試驗(yàn)步驟：1)在一干凈的載玻片上滴10微升宮頸細(xì)胞懸液，涂布開(kāi)，加蓋玻片，用 同樣方法制備10塊待檢玻片。
[0037] 2)將motic校準(zhǔn)片置于載物臺(tái)上，以0.15mm黑點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)通光孔，物鏡調(diào)至40倍鏡下， 調(diào)節(jié)旋鈕至電腦屏幕上出現(xiàn)邊緣清晰的黑色圓點(diǎn)。
[0038] 3)點(diǎn)擊工具欄上"動(dòng)態(tài)測(cè)量"，在屏幕左側(cè)出現(xiàn)工作框。在"校準(zhǔn)"下選擇圓直徑 600，物鏡倍數(shù)40 X，然后點(diǎn)擊"校準(zhǔn)"框。
[0039] 4)取下校準(zhǔn)片，換上待測(cè)標(biāo)本。在40倍鏡下調(diào)節(jié)清楚后，觀察細(xì)胞形態(tài)，是否破損、 凝集等。
[0040] 5)在40倍鏡下調(diào)節(jié)清楚后，以動(dòng)態(tài)測(cè)量工具中選擇適當(dāng)?shù)墓ぞ?，在屏幕上點(diǎn)擊，便 可測(cè)定細(xì)胞的直徑或面積等數(shù)據(jù)。
[0041 ] 在表1中列出試驗(yàn)結(jié)果。
[0042] 表 1
[0043]
[0044] 試驗(yàn)2抗菌性能測(cè)試試驗(yàn)
[0045] 1)用吸管吸取5ml宮頸細(xì)胞懸液于試管內(nèi)，再加入45ml滅菌生理鹽水，形成稀釋 液。
[0046] 2)向5個(gè)滅菌的平皿內(nèi)加入lml稀釋液，再將涼至46°C營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約 15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，混合均勻。
[0047] 3)待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1°C溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，取出計(jì)算平板內(nèi)菌落 數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每毫升樣品所含菌落總數(shù)。
[0048] 在表2中列出試驗(yàn)結(jié)果。
[0049] 表 2
[0050]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種液基薄層細(xì)胞保存液，其特征在于：以質(zhì)量百分比計(jì)，所述液基薄層細(xì)胞保存液 由以下成分組成 KCl 1%-3%; KH2PO4 1%-3%; Na5HPO4 0. EDTA-2Na 0.01%-0.1%; 乙二醇 5%-10%; CldH2O 70%-77. 79%; 異丙醇 15%-20%; 甲醛 0. 1%-H2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液基薄層細(xì)胞保存液，其特征在于:所述液基薄層細(xì)胞保 存液中KH2PO4的質(zhì)量百分比為Iwt %-1 · 5wt %，Na2HP〇4的質(zhì)量百分比為0 · 8wt %-Iwt %。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種液基薄層細(xì)胞保存液，其特征在于:所述液基薄層細(xì)胞保 存液內(nèi)甲醛的質(zhì)量百分比為0.1 wt %-0.8wt %。4. 一種如權(quán)利要求1所述的液基薄層細(xì)胞緩沖液的制備方法，其特征在于： a) 將配方量的Na2HPO4、KH2P〇4、KCl、EDTA-2Na溶解于dd H2O中形成溶液a; b) 將步驟a)獲得的溶液a攪拌均勻，得到溶液b; c) 向步驟b)獲得的溶液b中加入配方量的乙二醇、異丙醇，攪拌均勻，得到溶液c; d) 向步驟c)獲得的溶液c中加入配方量的甲醛，攪拌均勻； 以上各步驟都是在常溫，濕度<90 % RH下進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】A01N1/02GK105994252SQ201610466138
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】王云皓, 吳屹豪
【申請(qǐng)人】杭州海世嘉生物科技有限公司