烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟：他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備、投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料、熱休克處理、雌激素抑制劑溶液的配制、用雌激素抑制劑溶液均勻噴霧等。通過此方法，可獲得100%的烏龜雄性四倍體純系，不僅有效地育成烏龜?shù)乃谋扼w，而且提高了四倍體的育成率與出苗率；為生產(chǎn)三倍體不育烏龜?shù)於藞詫?shí)的基礎(chǔ)。
【專利說明】
烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及烏龜?shù)亩啾扼w繁育方法，具體涉及一種烏龜雄性四倍體純系高效育成 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 烏龜隸屬爬行綱、龜鱉目、龜科，是現(xiàn)存古老的爬行動物，常見的為二倍體，身上長 有非常堅固的甲殼，雌龜生長速度為一領(lǐng)齡龜體重在15克左右，二齡龜50克，三齡龜100克， 四齡龜200克，無齡龜250克，雄龜生長慢，性成熟最大個體一般為250克以下。因三倍體的不 育特征，使烏龜在生長速度、抗病性、肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢?，F(xiàn)有技術(shù)中，要獲 得三倍體不育烏龜，最快捷有效的方式是通過四倍體烏龜與二倍體烏龜倍間雜交獲得，那 么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度極高的四倍體烏龜體系。但在烏龜?shù)倪z傳育種中，目前為止還 未見烏龜雄性四倍體高效育成的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種方法穩(wěn)定、種群純度高 達(dá)1 〇〇%的烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法。
[0004] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規(guī)飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為10~16g/500g喂養(yǎng)料，待用； (2) 投喂:在母龜產(chǎn)蛋前5~10天，按常規(guī)飼料投喂方法對母本進(jìn)行投喂他莫昔芬喂養(yǎng) 料，每天兩次，早上8:00每100g烏龜投喂20~30g，下午6:00每100g烏龜投喂10~15g，直至 產(chǎn)蛋； (3 )熱休克處理:把步驟(2 )的受精蛋放入溫度為27~34 °C、濕度為50~90%的恒溫孵化 器中，在一次卵裂前2~3min，把溫度快速升至39~42°C，保持3~5min;然后溫度降至29~ 33。。； (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為180~250mg/l，睪 酮的濃度為100~150mg/l; (5) 用步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟(3)處理后的受精蛋 進(jìn)行均勻噴霧，用量每100只受精蛋為10~20ml，保持孵化器的溫度29~33°C、濕度50~ 90%，進(jìn)行孵化;從而獲得100%烏龜雄性四倍體純系。
[0005] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明中對母本進(jìn)行添加他莫昔芬飼料投喂，起到抑制DNA分裂 和促雄性的雙重作用的同時，將受精蛋第一次卵裂的時間推遲了 3~5min，并提高所有受精 蛋第一次卵裂的同步程度(可達(dá)99%)，為操作下一步提供時間保障和奠定染色體加倍基礎(chǔ)； 2、采用熱休克短時間處理受精蛋，不僅有效減少對受精卵的不良影響，提高受精卵的成活 率;而且進(jìn)一步加強(qiáng)了四倍體的形成機(jī)率;3、雌激素抑制劑溶液噴灑，再一次強(qiáng)化與保證其 雄性的轉(zhuǎn)化率。因而通過此方法，可獲得100%的烏龜雄性四倍體純系。此方法，不僅有效地 育成烏龜?shù)乃谋扼w，而且提高了四倍體的育成率與出苗率;為生產(chǎn)三倍體不育烏龜?shù)於?堅實(shí)的基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0006] 現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0007] 實(shí)施例一 烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規(guī)飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為16g/500g喂養(yǎng)料，待用； (2) 投喂:在母龜產(chǎn)蛋前5天，按常規(guī)飼料投喂方法對母本進(jìn)行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每 天兩次，早上8:00每100g烏龜投喂30g喂養(yǎng)料，下午6:00每100g烏龜投喂15g喂養(yǎng)料，直至產(chǎn) 蛋； (3) 熱休克處理:把步驟(2)的受精蛋放入溫度為27°C、濕度為80%的恒溫孵化器中，在 一次卵裂前3min，把溫度快速升至39°C，保持5min;然后溫度降至29°C ; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為180mg/l，睪酮的濃度為 100mg/l； (5) 用步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟(3)中的受精蛋進(jìn)行 均勻噴霧，用量每100只受精蛋為15ml，保持孵化器的溫度29°C、濕度80%，進(jìn)行孵化;從而獲 得1 〇〇%烏龜雄性四倍體純系。
[0008] 實(shí)施例二 烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規(guī)飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為16g/500g喂養(yǎng)料，待用； (2) 投喂:在母龜產(chǎn)蛋前10天，按常規(guī)飼料投喂方法對母本進(jìn)行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料， 每天兩次，早上8:00每100g烏龜投喂25g，下午6:00每100g烏龜投喂15g，直至產(chǎn)蛋； (3) 熱休克處理:把步驟(2)的受精蛋放入溫度為34°C、濕度為70%的恒溫孵化器中，在 一次卵裂前2min，把溫度快速升至40°C，保持3min，然后溫度降至33°C ; (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為230mg/l，睪酮的濃度為 140mg/l； (5) 用步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟(3)中的受精蛋進(jìn)行 均勻噴霧，用量每100只受精蛋為20ml，保持孵化器的溫度33°C、濕度70%，進(jìn)行孵化;從而獲 得1 〇〇%烏龜雄性四倍體純系。
[0009] 上述兩個實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，任 意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式 及結(jié)果統(tǒng)計。
[0010]附:烏龜雄性四倍體育成結(jié)果統(tǒng)計
注：上述結(jié)果是母龜產(chǎn)蛋前10天投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，一次卵裂前2min熱休克保持 3min所取得的結(jié)果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.烏龜雄性四倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規(guī)飼養(yǎng) 飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為10~16g/500g喂養(yǎng)料，待用； (2) 投喂：在母龜產(chǎn)蛋前5~10天，按常規(guī)飼料投喂方法對母本進(jìn)行投喂他莫昔芬喂養(yǎng) 料，每天兩次，早上8:00每100g烏龜投喂20~30g，下午6:00每100g烏龜投喂10~15g，直至 產(chǎn)蛋； (3) 熱休克處理:把步驟(2)的受精蛋放入溫度為27~34°C、濕度為50~90%的恒溫孵化 器中，在一次卵裂前2~3min，把溫度快速升至39~42°C，保持3~5min;然后溫度降至29~ 33。。； (4) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為180~250mg/l，睪 酮的濃度為100~150mg/l; (5) 用步驟(4)所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟(3)處理后的受精蛋 進(jìn)行均勻噴霧，用量每100只受精蛋為10~20ml，保持孵化器的溫度29~33°C、濕度50~ 90%，進(jìn)行孵化;從而獲得100%烏龜雄性四倍體純系。
【文檔編號】A01K67/027GK106035234SQ201610499224
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】楊品紅, 韓慶, 黃春紅
【申請人】湖南文理學(xué)院