專利名稱：一種水稻分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)中的分子標(biāo)記方法。
分子標(biāo)記是一種DNA分子水平上的識(shí)別記號(hào)，用于識(shí)別特定基因和DNA片段的有無及所在位置等?，F(xiàn)在廣泛使用的分子標(biāo)記方法中，與本發(fā)明較接近的方法有兩種Ⅰ．隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomAmplified Polymorphic DNA)，簡(jiǎn)稱RAPD，該技術(shù)也稱為隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增(Arbitrary Primed PCR)，簡(jiǎn)稱AP-PCR；Ⅱ．DNA擴(kuò)增指紋分析(DNA Amplified Fingerprinting)，簡(jiǎn)稱DAF。這兩種方法的基本原理相似，均以隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，即所用引物是任意的，引物的設(shè)計(jì)不需要預(yù)先知道DNA的序列，可以任意設(shè)計(jì)。兩種方法的主要差別在于所用引物的長(zhǎng)度上。RAPD使用的引物長(zhǎng)度為10個(gè)核昔酸；DAF的引物為5～8個(gè)核苷酸。它們的共同優(yōu)點(diǎn)是引物設(shè)計(jì)容易、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用成本低。共同缺點(diǎn)是擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性較差，在一些生物材料中，如水稻，擴(kuò)增帶的多態(tài)性(即有差異的擴(kuò)增帶)較低。與RAPD相比較，DAF擴(kuò)增帶的多態(tài)性高一些，但穩(wěn)定性最差，因此現(xiàn)已很少使用。RAPD擴(kuò)增帶的多態(tài)性雖然比DAF低一些，但穩(wěn)定性高一些，加之引物設(shè)計(jì)容易，操作簡(jiǎn)單、使用成本低等優(yōu)點(diǎn)，所以至今仍是所有分子標(biāo)記方法中使用得最廣泛的方法。
在基于PCR擴(kuò)增的分子標(biāo)記方法中，引物的長(zhǎng)度越長(zhǎng)，所能承受的復(fù)性溫度就越高，其擴(kuò)增的結(jié)果也就越穩(wěn)定。而上述RAPD等方法所使用的引物長(zhǎng)度都較短，均在10個(gè)或10個(gè)核苷酸以下，需要較低的復(fù)性溫度(35℃左右或更低)來維持配對(duì)，這不僅會(huì)增加非特異性擴(kuò)增的機(jī)會(huì)，對(duì)溫度的變化也較為敏感，因而很容易產(chǎn)生出不穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物。這就是導(dǎo)致上述方法結(jié)果不穩(wěn)定的主要原因。因此，增加引物的長(zhǎng)度，提高復(fù)性溫度就是解決問題最簡(jiǎn)捷的方法。
本發(fā)明的目的是保留上述RAPD等方法的優(yōu)點(diǎn)，克服其缺點(diǎn)，提供一種主要適合于水稻的，并又同時(shí)具有穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、應(yīng)用成本低等優(yōu)點(diǎn)的分子標(biāo)記新方法，用于水稻的遺傳圖譜、基因定位及水稻的新品種選育研究。
本發(fā)明可以通過以下方式得以實(shí)現(xiàn)本分子標(biāo)記方法由引物設(shè)計(jì)、引物合成、DNA提取、DNA擴(kuò)增和擴(kuò)增結(jié)果的電泳等步驟組成。在引物的設(shè)計(jì)中，將10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的引物增加到14～18個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。引物的核苷酸組成和排列順序按照隨機(jī)的方式設(shè)計(jì)，但引物中G、C堿基的含量占較高的比例，為60～80％，最佳是65～70％。設(shè)計(jì)引物時(shí)要避免如CCCC、AAAA等連續(xù)4個(gè)及以上相同堿基序列的出現(xiàn)。引物中最好不含有限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，如CCGG、AAGCTT等。引物設(shè)計(jì)完成后，按照設(shè)計(jì)的引物序列合成引物，合成引物后，即可進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。首先提取待測(cè)樣品的DNA，現(xiàn)已報(bào)道的DNA提取方法很多，可任意選擇一種。然后在0.2ml的PCR擴(kuò)增專用薄壁管中，依次加入10～40ng待測(cè)樣品DNA,20ng引物，2mM MgCl2,4種dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各100μM及1個(gè)單位的taq聚合酶，反應(yīng)總體積為25μl。除待測(cè)樣品DNA和引物外，各試劑(dNTP、tap酶等)及實(shí)驗(yàn)用品(薄壁管、吸管、吸頭等)均在專業(yè)公司購(gòu)買。將加好樣的薄壁管放入PCR循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為95℃下變性45秒；在45～60℃下復(fù)性60秒；72℃延伸45秒；循環(huán)30次。擴(kuò)增結(jié)束后，取3μl擴(kuò)增產(chǎn)物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上，60V下恒壓電泳2小時(shí)。用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色，以顯示擴(kuò)增帶。
本發(fā)明與RAPD等方法相比較，不僅提高了擴(kuò)增帶的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，而且提高了擴(kuò)增帶的多態(tài)性。并且，還保留了RAPD等方法操作簡(jiǎn)單，運(yùn)行成本低的優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例1．引物的設(shè)計(jì)與合成本發(fā)明最佳引物長(zhǎng)度為16個(gè)核苷酸，其中G和C堿基占11個(gè)，A和T堿基占5個(gè)，堿基的順序按照隨機(jī)的方式排列。引物中要避免如CCCC、AAAA等連續(xù)4個(gè)及以上相同堿基序列的出現(xiàn)，并且最好不含有限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，如CCGG、AAGCTT等。設(shè)計(jì)好的引物由專業(yè)的DNA合成公司合成。本發(fā)明的引物由賽百盛公司合成。
2．DNA的提取本發(fā)明以水稻為材料提取DNA,DNA的提取按照盧揚(yáng)江等(中國(guó)水稻科學(xué)，1992,6:47～48)報(bào)道的水稻DNA提取方法進(jìn)行。
3．DNA的擴(kuò)增在0.2ml的PCR擴(kuò)增專用薄壁管中，加入20ng的水稻DNA,20ng引物，2mM MgCl2,4種dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各100μM及1個(gè)單位的taq聚合酶，反應(yīng)總體積為25μl。除水稻DNA和引物外，本發(fā)明使用的各種試劑(dNTP、tap酶等)及實(shí)驗(yàn)用品(薄壁管、吸管、吸頭等)均購(gòu)自華美生物工程公司。
DNA的擴(kuò)增在Biometra公司的UNO Ⅱ熱循環(huán)儀上進(jìn)行。擴(kuò)增條件為95℃下變性45秒；52℃復(fù)性60秒；72℃延伸45秒；4．?dāng)U增結(jié)果的電泳取3μl擴(kuò)增產(chǎn)物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上，60V下恒壓電泳2小時(shí)。用銀染法對(duì)凝膠進(jìn)行染色顯帶。銀染按照Caetano-Anollés等(Bio/Technology,1991,9:553～557)報(bào)道的方法進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種由引物設(shè)計(jì)、引物合成、DNA提取、DNA擴(kuò)增和擴(kuò)增結(jié)果的電泳等步驟組成的分子標(biāo)記方法，其特征是引物長(zhǎng)度為14～18個(gè)核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記方法，其特征是引物長(zhǎng)度最佳為16個(gè)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記方法，其特征是引物中G、C堿基的含量為60～80％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記方法，其特征是引物中G、C堿基的最佳含量為65～70％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的分子標(biāo)記方法，主要應(yīng)用在水稻遺傳研究方面。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻分子標(biāo)記方法,針對(duì)目前所采用的方法中擴(kuò)增帶的穩(wěn)定性、重復(fù)性和多態(tài)性不高,通過改變引物核苷酸長(zhǎng)度,達(dá)到不僅提高了擴(kuò)增帶的穩(wěn)定性和可重復(fù)性,而且提高了擴(kuò)增帶的多態(tài)性的目的,同時(shí),還具有操作簡(jiǎn)單,運(yùn)行成本低的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1308134SQ0110704
公開日2001年8月15日 申請(qǐng)日期2001年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月16日
發(fā)明者羅科 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所