專利名稱：香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法。
背景技術(shù)：
香蕉鐮刀菌枯萎病又稱香蕉巴拿馬病、黃葉病，是由鐮刀菌侵染引起維管束壞死的土傳性病害，病原菌為尖鐮孢霉古巴專化型[Fusarium oxysporum f.sp.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen](FOC)病原菌從受傷的根莖侵入，通過寄主維管束向莖上發(fā)展，并進(jìn)一步向假葉部蔓延。當(dāng)植株枯死后，病原菌隨殘體遺留在土壤中，隨著水流或帶菌的農(nóng)具在蕉園內(nèi)再進(jìn)行自然傳播，其厚垣孢子可在土壤中存活8～10年。由于該菌存活期長，傳播迅速，尚未有防止該病的特效藥物，因此一旦在香蕉產(chǎn)地發(fā)病，很可能大面積爆發(fā)將造成重大損失。
尖鐮刀菌古巴?；陀?個生理小種，1號小種(race1)感染香蕉的栽培種“大蜜哈”[Grosmichel(AAA)]及龍牙蕉(MusaAAB)，矮蕉[Dwarfcavendish(AAA)]較抗病，該小種呈世界分布，在中國大陸已有記錄；2號小種(race2)在中美洲，僅感染三倍體雜種梭香蕉[Bluggoe(AAB)]，不侵染“大蜜哈”；3號小種(race3)感染野生的羯尾蕉屬(Heliconia)；4號小種(race4)能感染幾乎所有的香蕉種類，如Cevendish、“大蜜哈”、矮香蕉、野蕉(BB)和梭指蕉，毀滅性最大，在全世界范圍內(nèi)尚未找到有效的抵抗4號小種的香蕉品種。
香蕉枯萎病侵染時間長，沒有有效的農(nóng)藥和防治措施，品種抗病性成為一個重要的控病方法。但是，由于對病害的侵染過程缺乏深入的研究，目前未見有關(guān)香蕉枯萎病的致病性研究報道，對病菌的致病因子沒有足夠的認(rèn)識，抗病品種的選取很難取得理想的進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法。該香蕉枯萎病菌致病性內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶在致病過程中有重要作用，是致病的重要因子。
香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶(PG)的提取純化方法包括以下步驟(1)將香蕉枯萎病菌4號生理小種接種于誘導(dǎo)果膠酶液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；于4℃離心除去菌絲，上清液用超濾膜濃縮得粗酶液；(2)粗酶液上樣于Sephacry S-100 16/10凝膠層析柱，預(yù)先用柱平衡緩沖液平衡柱，用柱平衡緩沖液洗脫，收集洗脫液，測酶活性及蛋白含量；(3)收集步驟(2)中混合酶活性大于粗酶活性25％的洗脫液，濃縮脫鹽，測濃縮液酶活性及蛋白含量；濃縮液上樣于Sepharose SP XL式16/10強陽離子交換層析柱，預(yù)先用柱平衡緩沖液平衡柱，用柱平衡緩沖液配置的0.75mol/L NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集梯度洗脫部分，測PG活性及蛋白含量；(4)收集酶活性大于上樣液酶活性25％的洗脫液混合，濃縮脫鹽，測濃縮液的酶活性及蛋白含量后，濃縮液上樣于Sepharose FF CM弱陽離子交換層析柱，用柱平衡緩沖液配置的0.75mol/L NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集梯度洗脫峰，濃縮脫鹽，即為純化的多聚半乳糖醛酸酶PGC1。
所述濃縮脫鹽采用分子量10kDa的超濾離心管。
所述步驟(1)中上清液經(jīng)分子量10kDa的超濾膜濃縮200倍。
所述步驟(2)中柱平衡緩沖液為pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液、內(nèi)含0.15mol/L NaCl；所述步驟(3)和步驟(4)中柱平衡緩沖液為pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液。
步驟(2)中用柱平衡緩沖液洗脫1.5倍柱體積，流速2.5mL/min。
步驟(3)線性梯度洗脫30倍柱體積，流速4mL/min。
步驟(4)線性梯度洗脫30倍柱體積，流速0.5mL/min。
所述步驟(2)中粗酶液上樣量為2mL；步驟(3)中濃縮液上樣量為2mL；步驟(4)中濃縮液上樣量為0.5mL。
所述步驟(4)PGC1蛋白N-末端序列為Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr SerGly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Arg Ile Val。
本發(fā)明純化的多聚半乳糖醛酸酶PGC1是香蕉枯萎病菌4號生理小種的關(guān)鍵致病因子之一，將在香蕉枯萎病的檢疫和防治中產(chǎn)生重要作用。
(1)在香蕉枯萎病檢測中的應(yīng)用由于只有香蕉枯萎病菌的4號小種才能分泌PGC1，因此利用純化的PGC1酶蛋白研制抗體，可對病菌、感病植株、帶菌土壤進(jìn)行血清學(xué)檢測。
(2)在香蕉抗枯萎病菌的育種上的應(yīng)用在香蕉組培過程中，加入純化的PGC1，誘導(dǎo)耐PGC1的愈上組織或篩選出再生植株。對PG1的耐抗性可作為品種抗病性鑒定的一個指標(biāo)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果本發(fā)明提取純化方法從香蕉枯萎病菌中提取致病性內(nèi)切半乳糖醛酸酶，可以作為該病菌的檢疫檢測的新的指標(biāo)，并能應(yīng)用致病性內(nèi)切半乳糖醛酸酶，制備香蕉枯萎病菌抗血清，以及在篩選和培育新的香蕉抗病品種。


圖1為Sephacryl S-100凝膠過濾柱層析圖。
圖2為Sephacryl S-100凝膠過濾柱層析收集各管的PG活性變化曲線。
圖3為Sepharose SP XL 16/10強陽離子交換柱層析圖。
圖4為Sepharose SP XL 16/10強陽離子交換柱層析收集各管的PG活性變化曲線。
圖5為Sepharose CM弱陽離子交換柱層析圖。
圖6為Sepharose CM弱陽離子交換柱層析收集各管的PG活性變化曲線。
圖7為純化PGC1的IEF-PAGE電泳圖譜。
其中71為粗酶液PG同工酶染色；72為經(jīng)Sepharose CM Hitrap收集的PGC1酶染色；73為經(jīng)Sepharose CM Hitrap收集的PGC1酶蛋白銀染；74為標(biāo)準(zhǔn)等電點(pI3.5-9.5)。
圖8為各純化PGC1步驟的SDS-PAGE電泳銀染圖譜。
其中1為Sepharose SP XL 16/10收集酶液；2為Sephacryl S-100 16/10收集酶液；3為粗酶液；4為Sepharose CM Hitrap收集酶液；5為低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
液體培養(yǎng)基NH4HNO3 1.0g、KCl 0.2g、FeSO4 0.01g、KH 2PO 40.2g、ZnSO4 0.01g、蒸餾水1000mL。Sigma公司生產(chǎn)柑桔果膠5g，羧甲基纖維素鈉5g，液體培養(yǎng)基pH值5.0后，于121℃、15磅下滅菌20min。
PG酶活性的測定用pH5.0的0.05mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制0.5％的果膠酸溶液，取1mL果膠酸溶液與0.5mL稀釋100倍的酶液混合，于45℃水浴鍋中反應(yīng)30min，立即加入DNS試劑0.5mL中止反應(yīng)，再加入蒸餾水至5mL。在Bakeman分光光度計520nm波長處測定反應(yīng)混合物的O.D值。測定后，取樣品的O.D值平均值在標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的糖量。對照除加入的PG酶液沸煮10min的失活酶液外，其余操作同上。多聚半乳糖醛酸酶的酶活單位為45℃下每mg酶每分鐘催化低物釋放1μmolD-半乳糖醛酸量(μmol/mg·min)。
酶蛋白濃度測定按Bradforf方法，用考馬斯亮蘭G250顯色，在595nm下比色測定，用牛血蛋白清作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
本發(fā)明香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取純化工藝步驟是-20℃低溫保藏的香蕉枯萎病菌4號生理小種菌株(由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供)活化，接種在加有香石竹葉片的PDA平板上，25℃培養(yǎng)7天，用0.7cm打孔器在菌落邊緣打下菌片，每個250mL三角瓶盛誘導(dǎo)果膠酶液體培養(yǎng)基100mL，加4個菌片，25℃下，110rpm振蕩培養(yǎng)10天。在4℃，16000g下離心20min，取上清液。然后用Millipore公司的Amicon 8400超濾濃縮系統(tǒng)，內(nèi)含10kDa超濾膜，濃縮約200倍，測多聚半乳糖醛酸酶活性和蛋白含量，保存于-20℃冰箱中備用。
采用Amersham Biosciences的全自動蛋白層析系統(tǒng)AKTA purify HPLC，預(yù)先用內(nèi)含0.15mol/L NaCl，pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液，平衡120mL的Sephacry S-100 16/10凝膠柱，上述粗酶液上樣量為2mL，用凝膠柱平衡緩沖液洗脫1.5倍柱體積，流速2.5mL/min，收集4mL/管。檢測洗脫液在OD280的吸光值，可見兩個蛋白峰A和B，如圖1所示。測各管收集液的PG活性表明，15-48收集管中存在PG活性，如圖2所示。合并每次層析收集的酶活性大于粗酶液活性25％洗脫液，用Millipore公司的10kDa超濾離心管濃縮脫鹽，獲得組分BI，測濃縮液酶活性及蛋白含量。
BI每次上樣2mL于20mL的Sepharose SP XL 16/10強陽離子交換層析柱中，預(yù)先用pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液平衡柱，用pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液配置的0.75mol/L NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫30倍體積，流速4mL/min，收集梯度洗脫部分，4mL/管。經(jīng)過Sepharose SP XL 16/10強陽離子交換柱層析后，可見一明顯的蛋白洗脫峰C，如圖3所示。PG活性檢測表明，從60-74收集管存在PG活性，如圖4所示。合并每次層析收集的酶活性大于BI活性25％洗脫液，經(jīng)10kDa超濾離心管濃縮脫鹽，獲得組分CI，測濃縮液酶活性及蛋白含量。
CI每次上樣0.5mL于1mL的Sepharose FF CM弱陽離子交換層析柱，用pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液配置的0.75mol/L NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫30倍柱體積，流速1mL/min，收集0.5mL/管，OD280檢測為一對稱的蛋白洗脫峰D，如圖5所示，39-54收集管的有PG活性，如圖6所示，收集梯度洗脫峰，合并數(shù)次層析的收集洗脫液，經(jīng)10kDa超濾離心管濃縮脫鹽，獲得組分DI，進(jìn)行IEF-PAGE同工酶電泳染色只檢測到PGC1，如圖7所示，SDS-PAGE電泳顯示DI為一條蛋白帶，如圖8所示，即為達(dá)電泳純的多聚半乳糖醛酸酶PGC1。
各純化步驟組分析表明，純化的PGC1酶活性為260.52 Units mg-1.min-1，與培養(yǎng)液相比較純化了51.59倍，見表1。
表1 PGC1純化表

超薄層IEF-PAGE電泳后，以標(biāo)準(zhǔn)等電點電泳遷移率作標(biāo)準(zhǔn)曲線的，從曲線中查出PGC1的等電點約為7.85，如圖7所示。
用SDS-PAGE電泳，以標(biāo)準(zhǔn)分子量對數(shù)為縱坐標(biāo)，遷移率為橫坐標(biāo)作直線回歸圖，以回歸方程y＝3.1554x2-38.239x+131.33(R＝0.997)計算出PGC1的相對分子量為42.3kDa，如圖8所示。
由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院協(xié)助測定的PGC1酶蛋白N-末端序列為Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr ArgIle Val。
香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法.ST25SEQUENCE LISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>香蕉枯萎病菌致病性多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>22<212>PRT<213>Fusarium oxysporum f.sp.cubense<400>1Asp Pro Cys Ser Val Thr Asp Tyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser1 5 10 15Ser Cys Thr Arg Ile Val20
權(quán)利要求
1.一種香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，其提取純化方法包括以下步驟(1)將香蕉枯萎病菌4號生理小種接種于誘導(dǎo)果膠酶液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；于4℃離心除去菌絲，上清液用超濾膜濃縮得粗酶液；(2)粗酶液上樣于Sephacry S-100 16/10凝膠層析柱，預(yù)先用柱平衡緩沖液平衡柱，用柱平衡緩沖液洗脫，收集洗脫液，測酶活性及蛋白含量；(3)收集步驟(2)中混合酶活性大于粗酶活性25％的洗脫液，濃縮脫鹽，測濃縮液酶活性及蛋白含量；濃縮液上樣于Sepharose SP XL 16/10強陽離子交換層析柱，預(yù)先用柱平衡緩沖液平衡柱，用柱平衡緩沖液配置的0.75mol/L NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集梯度洗脫部分，測PG活性及蛋白含量；(4)收集酶活性大于上樣液酶活性25％的洗脫液混合，濃縮脫鹽，測濃縮液的酶活性及蛋白含量后，濃縮液上樣于Sepharose FF CM弱陽離子交換層析柱，用柱平衡緩沖液配置的0.75mol/L NaCl溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，收集梯度洗脫峰，濃縮脫鹽，即為純化的多聚半乳糖醛酸酶PGC1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，其特征在于所述濃縮脫鹽采用分子量10kDa的超濾離心管。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，其特征在于所述步驟(1)上清液經(jīng)分子量10kDa的超濾膜濃縮200倍。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，其特征在于所述步驟(2)中柱平衡緩沖液為pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液、內(nèi)含0.15mol/L NaCl；所述步驟(3)和步驟(4)中柱平衡緩沖液為pH4.5的0.02mol/L醋酸鈉緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，其特征在于步驟(2)中用柱平衡緩沖液洗脫1.5倍柱體積，流速2.5mL/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，其特征在于步驟(3)線性梯度洗脫30倍柱體積，流速4mL/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，其特征在于步驟(4)線性梯度洗脫30倍柱體積，流速0.5mL/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，其特征在于所述步驟(2)中粗酶液上樣量為2mL；步驟(3)中濃縮液上樣量為2mL；步驟(4)中濃縮液上樣量為0.5mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，其特征在于所述步驟(4)PGC1蛋白N-末端序列為Asp Pro Cys Ser Val Thr AspTyr Ser Gly Leu Ala Thr Ala Val Ser Ser Cys Thr Arg Ile Val。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種香蕉枯萎病菌多聚半乳糖醛酸酶的提取純化方法，將粗酶液上樣于Sephacry S－10016/10凝膠層析柱，用柱平衡緩沖液洗脫，收集混合酶活性大于粗酶活性25％的洗脫液，濃縮脫鹽，濃縮液上樣于Sepharose SP XL16/10強陽離子交換層析柱，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集梯度洗脫部分，將酶活性大于上樣液酶活性25％的洗脫液混合，濃縮脫鹽，濃縮液上樣于Sepharose FF CM弱陽離子交換層析柱，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集梯度洗脫峰，濃縮脫鹽。本發(fā)明提取純化方法從香蕉枯萎病菌中提取致病性內(nèi)切半乳糖醛酸酶，可以作為該病菌的檢疫檢測的新的指標(biāo)，并能應(yīng)用致病性內(nèi)切半乳糖醛酸酶，制備香蕉枯萎病菌抗血清及在篩選和培育新的香蕉抗病品種。
文檔編號C12N9/24GK1673366SQ20051003329
公開日2005年9月28日 申請日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日
發(fā)明者王振中, 王琪 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)