專利名稱：滾環(huán)復(fù)制技術(shù)(rca)檢測rna病毒基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是滾環(huán)復(fù)制技術(shù)(RCA方法)及其衍生的酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)用于RNA病毒檢測。用于RNA病毒在各種生物制品、、獻(xiàn)血者、病人血液標(biāo)本等的監(jiān)測。應(yīng)用范圍包括人用，獸用及其它生物防御用。
背景技術(shù)：
滾環(huán)復(fù)制原理即滾環(huán)放大(Rolling Circle Amplification，RCA)是基于這種復(fù)制方式可在同溫下對環(huán)狀單鏈DNA序列進(jìn)行相對無限單鏈擴增的特點，所以被成功運用于單核苷酸多態(tài)性(SNP)、病毒基因的分型、基因表達(dá)圖譜、芯片技術(shù)以及基因測序等一系列研究中。普通的RCA技術(shù)的原理是首先設(shè)計一種探針，這種探針的每個末端包含15-20個可與靶序列互補的核苷酸。當(dāng)這些序列與靶序列結(jié)合后，再通過連接酶將之連接為環(huán)狀，像一把掛鎖“鎖”在檢測基因的靶位上。所以有些研究者也將可環(huán)化探針形象地稱為掛鎖探針或環(huán)形探針[6]。這個環(huán)化后的探針就可通過引物進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制和支鏈擴增(RamificationRolling Circle Amplification)。反之，若靶序列上存在變異或沒有所要檢測的目的基因，探針無法被連接成環(huán)狀，復(fù)制也就無法進(jìn)行。
從RCA的原理和特點不難看出，該方法在RNA病毒的檢測方面應(yīng)該有著傳統(tǒng)基因診斷方法無法比擬的優(yōu)勢，與一些常規(guī)的檢測手段相比，它具有安全、特異、靈敏、便捷的優(yōu)勢。這主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，RCA檢測方法中所擴增的基因并不是病毒的原基因序列而是探針序列，病毒基因只是提供了一個探針環(huán)化的互補支架，保證了擴增的安全性和特異性；第二，該方法省去了RNA向cDNA反轉(zhuǎn)錄的過程，提高了檢測的敏感性。第三，所有的擴增過程都可在同溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求。第四，較RT-PCR縮短了檢測所需的時間。
酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)是一種結(jié)合滾環(huán)復(fù)制原理和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)用于檢測各種病源基因的新型檢測技術(shù)平臺。在此項技術(shù)中原理是探針與靶序列雜交后便可在T4DNA連接酶的作用下形成滾環(huán)復(fù)制中的環(huán)化單鏈分子，該分子在同溫下可被特異性引物滾動復(fù)制和支鏈擴增，形成最終的雙鏈核酸產(chǎn)物。該雙鏈可通過一條引物上預(yù)先用生物素標(biāo)記的生物素與酶標(biāo)板上包被的鏈酶親和素結(jié)合，而在另一條引物上預(yù)先標(biāo)記了地高辛，因此當(dāng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)時地高辛就間接的被固化到酶標(biāo)板上，再通過抗地高辛的酶標(biāo)抗體進(jìn)行顏色反應(yīng)。酶聯(lián)RCA技術(shù)通過在核酸上的標(biāo)記物與該標(biāo)記物的酶聯(lián)抗體有效地將陽性結(jié)果以顏色反應(yīng)的形式呈現(xiàn)出來，并可用酶標(biāo)儀將這種結(jié)果進(jìn)行量化。從而省略了滾環(huán)復(fù)制技術(shù)中核酸電泳的步驟，減小了污染和結(jié)果判斷的難度。

發(fā)明內(nèi)容
1.本發(fā)明是對目前對RNA病毒檢測技術(shù)手段的改進(jìn)和補充，它具有安全、特異、靈敏、便捷的優(yōu)勢。這主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，RCA檢測方法中所擴增的基因并不是病毒的原基因序列而是探針序列，病毒基因只是提供了一個探針環(huán)化的互補支架，保證了擴增的安全性和特異性；第二，該方法省去了RNA向cDNA反轉(zhuǎn)錄的過程，提高了檢測的敏感性。第三，所有的擴增過程都可在同溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求。第四，較RT-PCR縮短了檢測所需的時間。
2.通過Blast程序選擇了SARS病毒、丙型肝炎病毒和禽流感病毒基因的相對保守區(qū)，按照探針設(shè)計的普通原則借助Oligo程序，分別設(shè)計了對應(yīng)于保守區(qū)序列的捕獲探針、環(huán)形探針和相應(yīng)的引物。所有探針、引物和模式DNA分子的具體序列見表1。
3.建立了如下的檢測過程，詳見如下(1)合成探針使用上海生工生物技術(shù)公司合成儀合成。
(2)探針處理5’端進(jìn)行磷酸化或生物素或地高辛標(biāo)記，由上海生工生物技術(shù)公司完成。
(3)將待測標(biāo)本按Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒步驟處理，獲得樣本的RNA。
(4)分子雜交反應(yīng)。
(5)連接和擴增反應(yīng)(6)電泳檢測
具體實施例方式
實施方案1禽流感病毒HA5基因區(qū)的檢測在33μl雜交緩沖液中依次加入5μlRNA樣品、1μl環(huán)形探針(HA-C-probe，1012個分子)、1μl相應(yīng)的捕獲探針(Capture-HA-1、Capture-HA-2，各1012個分子[5，8])，在50℃水浴雜交1小時，緩慢冷卻至室溫。加入40μl鏈霉親和素包被的磁珠(溶于2×結(jié)合緩沖液中)，混勻，室溫放置20分鐘，磁性分離。用1×結(jié)合緩沖液清洗磁珠2次，棄盡洗液，按15μl連接體系分別加入1.5μl 10×連接酶緩沖液、1μl連接酶(400U)、12.5μl水，37℃，1小時。直接加入3μl 10×exo-Bst DNA擴增緩沖液，1μl exo-Bst聚合酶，1μl dNTP(2.5mM)，各1μl引物(HA-P1、HA-P2)，8μl水，65℃水浴，擴增90分鐘。擴增產(chǎn)物行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。同時設(shè)立陰性對照，陰性對照組除用水替代RNA外其它反應(yīng)組份及程序均相同。
實施方案2禽流感病毒NA1基因區(qū)的檢測方法與HA5基因區(qū)的檢測相同，使用的探針和引物分別為捕獲探針Capture-NA-1和Capture-NA-2，環(huán)形探針NA-C-probe，引物NA-P1和NA-P2。
實施方案3丙型肝炎病毒基因的檢測方法與HA5基因區(qū)的檢測相同，使用的探針和引物分別為捕獲探針Capture-HCV-1和Capture-HCV-2，環(huán)形探針HCV-C-probe，引物HCV-P1和HCV-P2。
實施方案4SARS病毒基因的檢測方法與HA5基因區(qū)的檢測相同，使用的探針和引物分別為捕獲探針Capture-SARS-1和Capture-SARS-2，環(huán)形探針SARS-C-probe，引物SARS-P1和SARS-P2。
實施方案5酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)檢測RNA病毒(1)用鏈酶親和素包被酶標(biāo)板以5μg/ml的包被濃度在酶標(biāo)板上包被鏈酶親和素，每孔加入100μl，4℃過夜，排干酶標(biāo)板，待用。
(2)環(huán)形探針和捕捉探針與被測RNA的雜交和連接按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行雜交和連接反應(yīng)

37℃水浴放置1小時，補加35μl水加入酶標(biāo)板，37℃繼續(xù)放置40分鐘。取出酶標(biāo)板，甩盡板中液體，加入擴增反應(yīng)液。
(3)恒溫擴增按照以下反應(yīng)體系進(jìn)行擴增反應(yīng)

65℃放置1小時進(jìn)行連接環(huán)的擴增。同時，標(biāo)記了生物素的引物鏈與酶標(biāo)板上包被的鏈酶親和素結(jié)合。取出酶標(biāo)板，用標(biāo)準(zhǔn)PBST洗液洗板3次，排干酶標(biāo)板。
(4)擴增產(chǎn)物與酶標(biāo)抗地高辛抗體的結(jié)合在酶標(biāo)板中加入100μl過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體(工作濃度由預(yù)實驗確定)，37℃放置40分鐘，洗板3次(洗液同上)，拍盡板中液體。
(5)顯色，讀值在酶標(biāo)板中加入過氧化物酶的顯色底物，37℃放置3至5分鐘，顯色完成后加入終止液(1N硫酸)終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀中檢測顏色信號(波長450nm)，讀值。
實施方案6臨床標(biāo)本的監(jiān)測結(jié)果對收集于病毒病預(yù)防控制所流感室、流行病研究所和武漢協(xié)和醫(yī)院20例病人血清臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，H5N1，HCV和SARS病毒的陽性檢測結(jié)果與常規(guī)RT-PCR方法完全一致，說明檢測的結(jié)果是滿意的。
表1探針和引物序列Table 1 Nucleotide sequences of the probes and primers

權(quán)利要求
1.一種用于RNA病毒檢測的滾環(huán)復(fù)制技術(shù)(RCA方法)及其衍生的酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)，其中包括H5N1、HCV和SARS病毒檢測的寡核苷酸探針和對照探針。
2.權(quán)力要求1所述的RNA病毒檢測RCA方法及其衍生的酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)的探針包括

圖1所列的基因序列及其衍生探針及每種探針的互補探針或變體。
3.權(quán)力要求1所述的RNA病毒檢測RCA方法及其衍生的酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)包括如下病毒及其變異株丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)，人免疫缺陷性病毒(Human Immunodeficiency virus，HIV)和禽流感病毒H5N1及其它的流感病毒亞型等。
4.權(quán)力要求1所述的RNA病毒檢測RCA方法及其衍生的酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)，其介質(zhì)為液相或鏈酶親和素包被的磁珠固相。
5.權(quán)力要求1所述的RNA病毒檢測的滾環(huán)復(fù)制技術(shù)(RCA方法)及其衍生的酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)應(yīng)用范圍包括H5N1、HCV和SARS病毒和其它RNA病毒。
6.權(quán)力要求5所述的本發(fā)明的應(yīng)用范圍包括人用，獸用及其它生物防御用。
7.權(quán)力要求1所述的RNA病毒檢測的滾環(huán)復(fù)制技術(shù)(RCA方法)及其衍生的酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)的反應(yīng)程序和檢測程序。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，涉及人類醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)，包括RNA病毒在各種生物制品、獻(xiàn)血員、病人血液標(biāo)本等的監(jiān)測。具體應(yīng)用滾環(huán)復(fù)制技術(shù)(RCA方法)及其衍生的酶聯(lián)滾環(huán)復(fù)制技術(shù)，通過生物學(xué)計算分析設(shè)計病毒保守和病毒特異性基因序列探針，分子雜交反應(yīng)。連接和擴增反應(yīng)，用電泳或酶標(biāo)抗體進(jìn)行顏色反應(yīng)來檢測，與傳統(tǒng)的RT－PCR方法比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優(yōu)勢。
文檔編號C12Q1/68GK1955308SQ200510114349
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月24日
發(fā)明者馬學(xué)軍, 李啟明, 侯云德 申請人:北京金迪克生物技術(shù)研究所