專利名稱：D－丙氨酸微生物制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以消旋的丙氨酸為原料，利用微生物分解其中的L-丙氨酸，生產(chǎn)D-丙氨酸的方法。
背景技術(shù)：
D-丙氨酸是一種重要的手性有機(jī)化合物，主要應(yīng)用于手性藥物、藥物中間體、食品添加劑等領(lǐng)域，在制藥、食品行業(yè)作為手性合成的手性原料。作為一種結(jié)構(gòu)最簡單的具有光學(xué)活性的氨基酸，在某些手性化合物的不對稱合成過程中具有不可替代的作用，目前主要用于生產(chǎn)新型廣譜抗生素、D-丙氨醇、多肽、新型甜味劑阿力甜(Alitame)，其中合成新型甜昧劑阿力甜(Alitame)為該產(chǎn)品提供了巨大的市場空間。
已知的制取D-丙氨酸的技術(shù)方法主要有“生物發(fā)酵法”、“不對稱化學(xué)合成法”、“氨基酸?；覆鸱址ā薄Ｆ渲小鞍l(fā)酵法”生產(chǎn)周期長，設(shè)備投資大，有副反應(yīng)，分離較復(fù)雜、污染大成本高；“不對稱化學(xué)合成法”反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜，工藝過程長；需要純手性試劑或貴金屬絡(luò)合物作催化劑，生產(chǎn)成本極高，以上兩種方法不具備工業(yè)化應(yīng)用價值，目前國內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)D-丙氨酸普遍采用“氨基酸酰化酶拆分法”，該法利用的氨基酸價格昂貴，生產(chǎn)成本仍然較高，只能用于小規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
由于D-丙氨酸的生理作用被不斷發(fā)現(xiàn)，其應(yīng)用越來越廣泛，需要研究開發(fā)一種適合大規(guī)模工業(yè)工業(yè)化、能顯著降低生產(chǎn)成本的技術(shù)。依據(jù)生物的不對稱降解或同化作用機(jī)理，研究生產(chǎn)手性氨基酸的方法，是一個重要的方向。本發(fā)明也是基于此原理。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)過程簡單，條件溫和，能夠大幅度降低生產(chǎn)成本的D-丙氨酸微生物制造方法。
其技術(shù)方案是一種D-丙氨酸微生物制造方法，具體步驟和特征如下1、含酶細(xì)胞懸液的制作采用搖瓶或發(fā)酵罐通風(fēng)培養(yǎng)。搖瓶旋轉(zhuǎn)速度為40-200轉(zhuǎn)/分鐘，1000毫升三角燒瓶裝液量100-400毫升，培養(yǎng)時間12-48小時，培養(yǎng)溫度25℃-40℃。發(fā)酵培養(yǎng)通風(fēng)比1∶0.05V-1∶0.4V(液體體積∶每分鐘通入的空氣體積)，培養(yǎng)時間12-48小時，培養(yǎng)溫度25℃-40℃。
培養(yǎng)基可以使用通常的碳水化合物作為碳源，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、麥芽汁、糖蜜等；作為氮源可以單獨或混合使用各種動物植物蛋白胨、豆餅水解液、硫酸銨、酵母提取物、玉米漿等；無機(jī)鹽可以單獨或混合使用氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等多種無機(jī)鹽。此外培養(yǎng)基中加入大豆油、各種消泡劑，避免滅菌或培養(yǎng)過程中的起泡現(xiàn)象。培養(yǎng)基配制后用酸或堿調(diào)節(jié)PH值到4-7.5。然后用蒸汽110-121℃滅菌10--30分鐘。
其中碳源的濃度為0-100g/L；氮源的濃度為0.5-50g/L；無機(jī)鹽的濃度為0.1-10g/L。誘導(dǎo)物L(fēng)-丙氨酸的濃度為0.1-200g/L。
本發(fā)明所篩選使用的微生物主要有假絲酵母和其他各種絲狀真菌，也包括細(xì)菌中的大腸桿菌屬、變形桿菌屬和綠膿桿菌屬等革蘭氏陰性細(xì)菌，上述這些微生物都是好氧型的。利用的微生物酶主要有氨基酸氧化酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等。其中主要的酶氨基酸氧化酶活力最高可以達(dá)到每小時每克濕細(xì)胞催化分解2800μmolL-丙氨酸。這些酶可以單獨提取出來使用，本發(fā)明主要是利用含有能夠分解L-丙氨酸的酶系的全細(xì)胞培養(yǎng)液(發(fā)酵液)。當(dāng)然，具有上述能夠分解L-丙氨酸能力的微生物細(xì)胞也可以從發(fā)酵液中分離出來，用聚合膠包埋等方式固定化使用。
2、酶催化不對稱降解反應(yīng)將培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液(發(fā)酵液)維持一定溫度30-58℃，通入空氣，通風(fēng)比為1∶0.05V-1∶2V(液體體積∶每分鐘通入的空氣體積)。向液體中流加底物DL-丙氨酸，流加的DL-丙氨酸兩種異構(gòu)體的比例可以是任意的。反應(yīng)體系中的氨基酸氧化酶特異性的氧化分解L-丙氨酸，并放出氨氣，其中的D-丙氨酸很少或基本不參與反應(yīng)。隨著底物流加量的不斷增加，反應(yīng)液體的PH值會增加，影響反應(yīng)的進(jìn)行，可以通過加大通風(fēng)量或加入硫酸等手段降低溶液PH值，維持最適宜的PH值在4.5-8.0。
3、產(chǎn)物提取分離反應(yīng)過程D-丙氨酸的濃度不斷增加，積累到一定程度，D-丙氨酸從反應(yīng)體系中結(jié)晶出來，通過離心分離得到粗品，這是本發(fā)明的又一項重要創(chuàng)新。離心后的酶反應(yīng)液可以回收反復(fù)套用多次，直到酶活力降低到?jīng)]有利用價值。喪失酶活力的酶反應(yīng)液中含有一定濃度的D-丙氨酸，這部分產(chǎn)品可以通過濃縮的方式結(jié)晶出來。每升上述發(fā)酵液可以生產(chǎn)D丙氨酸100-1500克。
4、D-丙氨酸的精制可以通過公知的活性炭脫色、過濾、重結(jié)晶等簡單工藝進(jìn)行。活性碳脫色溫度60-80℃，脫色濃度8％-16％。脫色液透光率98.8％以上。脫色液用真空濃縮的方法減少水分，從而使D-丙氨酸結(jié)晶出來。離心或抽濾得到成品。
其技術(shù)效果是利用微生物產(chǎn)生的氨基酸氧化酶，不對稱催化氧化分解底物DL-丙氨酸中的L-丙氨酸，而D-丙氨酸則很少或基本不參與反應(yīng)，最終作為目標(biāo)產(chǎn)物被提取出來。產(chǎn)品光學(xué)純度高達(dá)99.8％、化學(xué)純度高達(dá)99.7％；生產(chǎn)過程簡單，條件溫和，生產(chǎn)成本低。
實施例以下，用實施例對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。實施例中使用的原料是旋光度為零的DL-丙氨酸。
實施例1配制含有蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，氯化鈉5g/L，玉米漿干粉18g/LL-丙氨酸5g/L，硫酸鎂0.2g/L，磷酸二氫鉀1g/L的培養(yǎng)基1升，用氨水或硫酸調(diào)整PH值到7左右，分裝入1000毫升三角燒瓶中，每瓶裝液量250毫升。將上述培養(yǎng)基121℃高壓滅菌15分鐘。冷卻到30℃，將保存在斜面上的假絲酵母用ф1mm接種環(huán)挑取一環(huán)接入上述培養(yǎng)基中。使用旋轉(zhuǎn)震蕩器，在30℃、110rpm下培養(yǎng)24小時。
合并上述細(xì)胞培養(yǎng)液1升，水浴升溫至45℃，每分鐘通入空氣0.5升，流加DL-丙氨酸，用PH試紙檢測氨氣釋放強(qiáng)度，反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行40小時，累計加入DL-丙氨酸600g，停止加料，繼續(xù)反應(yīng)1小時。冷卻至15℃，用抽濾的方法分離結(jié)晶出的D-丙氨酸粗品180g，抽濾液真空濃縮得D-丙氨酸粗品80g，合并粗品260g。粗品溶解于2升蒸餾水中，加熱到80℃，加入6g活性碳脫色30分鐘，抽濾。用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器真空濃縮結(jié)晶，得D-丙氨酸精制品230g，25℃母液190毫升。產(chǎn)品光學(xué)純度99.5％，化學(xué)純度99.6％。
實施例2配制含有蛋白胨20g/L，酵母膏20g/L，葡萄糖10g/L，氯化鈉5g/L，玉米漿干粉18g/L，硫酸鎂0.2g/L，磷酸二氫鉀1g/L的一級培養(yǎng)基150毫升，用氨水或硫酸調(diào)整PH值到7左右，分裝入500毫升三角燒瓶中，每瓶裝液量150毫升。將上述培養(yǎng)基121℃高壓滅菌15分鐘。冷卻到37℃，將保存在斜面上的假絲酵母用ф1mm接種環(huán)挑去一環(huán)接入上述培養(yǎng)基中。使用旋轉(zhuǎn)震蕩器，在30℃，110rpm下培養(yǎng)16小時，得到一級種子細(xì)胞懸液400毫升。
配制含豆餅水解液20g/L(折干)，麥芽粉20g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉5g/L，玉米漿干粉5g/L，硫酸鎂0.2g/L，磷酸二氫鉀1g/L、L-丙氨酸5g/L的發(fā)酵液10升，調(diào)整整PH值7左右，將上述培養(yǎng)基加到有效容積10升的發(fā)酵罐中，115℃高壓滅菌15-20分鐘。冷卻至30℃，接入上述一級種子細(xì)胞懸液400毫升。每分鐘通入無菌空氣2升，培養(yǎng)24小時。
將上述發(fā)酵液體水浴升溫至50℃，每分鐘通入空氣5升，流加DL-丙氨酸，反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行48小時，累計加入DL-丙氨酸8000g，停止加料，繼續(xù)反應(yīng)1小時。冷卻至15℃，用100目滌綸濾布過濾得D-丙氨酸粗品2400g。
濾液再加熱至50℃，按上述方法繼續(xù)流加DL-丙氨酸，隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)速度降低，繼續(xù)反應(yīng)50小時，氨氣析出量很少，用HPLC測量液體中的L-丙氨酸殘留量低于0.5％時停止反應(yīng)。第二次累計加入DL丙氨酸6000g，分離得D-丙氨酸粗品2900g。
第二次分離后的反應(yīng)液真空濃縮得D-丙氨酸粗品900g，合并上述D-丙氨酸粗6200g，用實施例1的方法精制，得光學(xué)純度99.8％、化學(xué)純度99.7％的D-丙氨酸5952g。
權(quán)利要求
1.一種D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于1)分解L-丙氨酸的微生物細(xì)胞懸液的制作將碳源、氮源、無機(jī)鹽、水和誘導(dǎo)物按比例配制培養(yǎng)基，用酸或堿將其PH值調(diào)節(jié)到4-7.5；然后，接入經(jīng)篩選出來的能夠產(chǎn)生分解L-丙氨酸酶的微生物，用旋轉(zhuǎn)震蕩器或發(fā)酵罐通風(fēng)培養(yǎng)12-48小時，培養(yǎng)溫度為25℃-40℃。2)酶催化不對稱降解反應(yīng)向培養(yǎng)好的細(xì)胞懸液液體中不斷流加底物DL-丙氨酸，使反應(yīng)體系中的氨基酸氧化酶特異性的氧化分解L-丙氨酸，并放出氨氣，通過加大通風(fēng)量或加入硫酸等手段降低溶液PH值，使溶液中的PH值維持在4.5-8.0；反應(yīng)溫度28-68℃。3)產(chǎn)物提取分離通過向轉(zhuǎn)化體系中不斷加入DL-丙氨酸，增加D-丙氨酸的濃度，使D-丙氨酸從反應(yīng)體系中結(jié)晶出來，通過離心分離得到粗品；4)D-丙氨酸的精制粗品通過活性炭脫色、過濾、重結(jié)晶，即得精制的D-丙氨酸成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于所述培養(yǎng)基中的碳源為單獨或混合使用的碳水化合物中的葡萄糖、蔗糖、淀粉、糊精、麥芽汁和糖蜜；氮源為單獨或混合使用的各種動物植物蛋白胨、豆餅水解液、硫酸銨、酵母提取物和玉米漿；無機(jī)鹽為單獨或混合使用的氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀；所述的誘導(dǎo)物為L-丙氨酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于所述碳源的濃度為0-100g/L；氮源的濃度為0.5-50g/L；無機(jī)鹽的濃度為0.1-10g/L；誘導(dǎo)物L(fēng)-丙氨酸的濃度為0.1-200g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于所述能夠產(chǎn)生分解L-丙氨酸酶的微生物為假絲酵母和其他各種絲狀真菌，也包括細(xì)菌中的大腸桿菌屬、變形桿菌屬和綠膿桿菌屬等革蘭氏陰性細(xì)菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種D-丙氨酸微生物制造方法，其特征在于所用原料DL-丙氨酸中的兩種旋光異構(gòu)體的比例可以是任意的；DL-丙氨酸是作為酶催化分解的底物，而不是培養(yǎng)基的成分；利用的是微生物全細(xì)胞進(jìn)行催化分解反應(yīng)。
全文摘要
D－丙氨酸微生物制造方法屬生物技術(shù)領(lǐng)域。其所要解決的技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)過程簡單、能夠降低生產(chǎn)成本的D－丙氨酸微生物制造方法。其技術(shù)要點在特定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物如假絲酵母，產(chǎn)生對L－丙氨酸具有強(qiáng)氧化能力的氨基酸氧化酶；以DL－丙氨酸為底物，流加進(jìn)培養(yǎng)好的含有氨基酸氧化酶、L－丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的細(xì)胞懸液中，通入空氣，特異性地降解DL－丙氨酸中的L－丙氨酸脫去氨基分解；而D－丙氨酸則完全不參與反應(yīng)，作為目標(biāo)產(chǎn)物提取出來；通過不斷流加底物，產(chǎn)物濃度增高，使D－丙氨酸在酶液中形成結(jié)晶體，直接分離，經(jīng)過脫色、過濾、重結(jié)晶就可以達(dá)到精制提純的目的。產(chǎn)品化學(xué)純度和光學(xué)純度高，制造成本低。
文檔編號C12P41/00GK1884565SQ20061004068
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月29日
發(fā)明者黃建坡, 陳武軍, 尹若春 申請人:安徽華恒生物工程有限公司