專利名稱：水稻分蘗調控基因OsTIL1及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域。具體的說，本發(fā)明涉及水稻分蘗調控基因OsTIL1及其應用。
背景技術：
分蘗是單子葉禾本植物的一種特殊的分枝現(xiàn)象，它是決定禾本科作物產量的重要因素之一，更是優(yōu)良株型的重要組成因素。禾本科作物的莖桿每節(jié)都生有芽，芽可發(fā)育形成枝條，枝條基部形成不定根，這類枝條就是分蘗。分蘗的形態(tài)特征與主莖基本相同，分蘗可以與主莖分離而單獨存活。植物的分枝過程可分為兩個階段，腋生分生組織的形成和隨后腋芽的生長。腋芽形成后常處于休眠狀態(tài)，需要內部和外界的信號刺激后才能生長形成分蘗。
遺傳學研究表明分蘗數(shù)目受多基因聯(lián)合調控，分蘗角度也是多基因控制的，基因間的加性作用對分蘗數(shù)目和分蘗角度起主導性作用，而基因間非加性作用與環(huán)境因素的影響占次要地位(Wu等，1999；沈圣泉等，2005；錢前等，2001)。
水稻中已經(jīng)克隆了兩個參與分蘗調控的基因。MOC1控制腋生分生組織的形成，它也影響腋芽的生長，MOC1突變則不能形成分蘗(Li等，2003)。OsTB1是另一個已報道參與分蘗調控的水稻基因，它主要參與正向調控分蘗芽的生長，增強表達抑制分蘗的生長而功能缺失突變則增加分蘗數(shù)(Takeda等，2003)。此外，還通過精細定位報道了兩個分蘗調控突變位點，d3和htd-1，這兩個基因也主要參與調控分蘗芽的生長，它們的擬南芥同源基因MAX2和MAX3也參與調控分蘗芽的生長(Ishikawa等，2005；Zou等，2005)。而目前還沒有克隆分蘗角度調控基因的報道。
NAC基因家族是植物特異的轉錄因子大家族，在擬南芥和水稻中都有100多個成員(Riechmann等，2000)(http//www.tigr.org/)。NAC蛋白的N-末端包含一個高度保守的NAC(NAM，ATAF1、2及CUC2)DNA結合結構域(Aida等，1997)。NAC蛋白的C-末端區(qū)域是假定的轉錄激活域，在不同的NAC蛋白間保守性較差(Duval等，2002；Takada等，2001；Xie等，2000)。NAC家族基因參與不同的調控途徑，它們在植物生長發(fā)育的許多方面起著重要的作用(Olsen等，2005)。包括在胚胎、花和營養(yǎng)發(fā)育中器官邊界的建立(Aida等，1997；Mitsuda等，2005；Souer等，1996；Takada等，2001；Vroemen等，2003)；信號轉導如生長素、脫落酸信號(Aida等，2002；Xie等，2000)；以及參與生物和非生物脅迫反應等(He等，2005；Ren等，2000；Selth等，2005)。目前還沒有研究表明NAC家族基因參與側生分枝過程。水稻中目前還沒有報道NAC基因的功能研究。
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發(fā)明內容
針對現(xiàn)有技術中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種水稻分蘗調控基因OsTIL1及其應用。
本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現(xiàn)的提供一種水稻分蘗調控基因TIL1編碼的蛋白質，其具有Seq ID No2所示的氨基酸序列。
作為本發(fā)明的水稻分蘗調控基因TIL1編碼的蛋白質的一種改進該氨基酸序列還包括在Seq ID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。
本發(fā)明還提供了編碼上述蛋白質的基因，該基因具有Seq ID No1所示的核苷酸序列。
作為本發(fā)明的基因的一種改進核苷酸序列還包括在Seq ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
本發(fā)明還提供了含有上述基因的質粒。
本發(fā)明還提供了上述質粒的植物表達載體。
本發(fā)明還提供了上述核酸的轉基因植物細胞。
本發(fā)明通過激活標簽技術克隆得到一個分蘗調控基因OsTIL1，序列分析表明該基因不同于已經(jīng)報道的分蘗調控基因。并通過轉基因驗證了該基因的功能。該基因屬于NAC家族的轉錄因子。該基因的克隆有助于研究水稻分蘗發(fā)生發(fā)育的分子機制，對生產上培育具有優(yōu)良株型結構的高產水稻品種，或通過轉基因的方法改良其他作物的高產株型結構具有很大的應用潛力。
本發(fā)明闡述了一個新的與水稻分蘗生長發(fā)育有關的基因。TIL1基因屬于NAC家族的轉錄因子，通過從激活標簽插入的水稻日本晴突變體庫中篩選到的多分蘗突變體Ostil1克隆到該基因。其功能經(jīng)Southern印跡和PCR的協(xié)同分離驗證以及增強表達OSTIL1基因和RNA干涉TIL1基因的轉基因實驗確認。該基因位于水稻第四條染色體上。經(jīng)5’RACE與3’RACE克隆出該全長基因。其cDNA編碼的NAC結構域與已報道的其他物種NAC基因具有高度保守性。RT-PCR表明，OSTIL1基因在水稻中組成型表達，在根和根莖結合部表達強于其他組織。
本發(fā)明目的之一是提供一種分離出的DNA分子，它包含如圖5和Seq ID No1所示的DNA序列。它編碼一個與水稻分蘗發(fā)育相關的NAC家族基因。
本發(fā)明目的之二是提供一種能分離出的蛋白質及其等價蛋白，它具有Seq ID No2所示的343個氨基酸序列，或者與其氨基酸序列至少60％同源的蛋白質。
本發(fā)明目的之三是提供一種用OsTIL1基因進行高效的植物轉化的方法，具體地說，本發(fā)明提供了具有Seq ID No1和圖5所示序列的基因或基因部分片段的載體，如圖4所示的pcOV和pcRNAi，該載體可以表達有上述核苷酸序列編碼的多肽或其同源類似物。
本發(fā)明還提供了一種利用上述的植物表達載體對植物細胞進行改造影響單子葉植物分蘗、雙子葉植物分枝的數(shù)目和角度的方法。
實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術步驟如下一、水稻多分蘗突變體Ostil1的分離和遺傳分析通過大量篩選激活標簽插入突變體，本發(fā)明獲得了一個水稻多分蘗突變體Ostil1(Oryzasativa tillering 1)，通過與野生型水稻正反交實驗證明我們獲得了一個符合單基因控制的遺傳規(guī)律的半顯性突變體，如圖1所示。
二、質粒營救克隆控制水稻多分蘗基因OsTIL1以潮霉素為探針進行Southern雜交結果表明Ostil1是由于單拷貝Ds插入引起的(圖2C)，Ostil1突變體表型和潮霉素協(xié)同分離。
用質粒營救方法從多分蘗突變體中拿到Ds插入的旁鄰DNA序列，經(jīng)測序和水稻基因組序列比較，發(fā)現(xiàn)插入于水稻的第4染色體上(圖2B)，將延伸的序列進行功能預測后發(fā)現(xiàn)其下游有一個NAC家族轉錄因子OsTIL1(圖2A)。用野生型和突變體回交的BC1F2群體的驗證表明Ds插入和多分蘗表型是協(xié)同的。Northern印跡分析證明該突變性狀與下游的OsTIL1基因增強表達協(xié)同(圖2D)。
三、OsTIL1基因的功能驗證、分析通過增強表達轉基因技術增強OsTIL1基因在水稻中的表達，獲得了分蘗增多、分蘗角增大的轉基因水稻(圖3D)，而利用RNA干涉將低突變體中OsTIL1基因的表達量則得到分蘗數(shù)和分蘗角度都趨向野生型的轉基因水稻(圖3B，C)。分蘗數(shù)目增多和分蘗角度的擴大與OsTIL1基因的表達量相關，證明OsTIL1基因表達能夠調節(jié)分蘗數(shù)目和角度(圖3)。
我國目前存在耕地面積減少，人口增長的矛盾。迫切需要培育高產優(yōu)質的水稻品種，良好的株型結構是決定水稻產量和質量的基礎，基因工程技術的發(fā)展使得應用OsTIL1基因調控水稻株型結構成為可能。


圖1 水稻多分蘗突變體Ostil1和野生型(WT)的表型；圖2 Ds插入拷貝數(shù)、插入位置及旁側基因的表達分析；其中A，Ds插入位置及Ds元件(DsAT)的結構；B，Ds插入的染色體位置；C，Ostil1突變體中Ds插入拷貝數(shù)分析；D，插入位置旁側基因的Northern表達分析；IR來自Ac轉座元件的反向重復序列；35S35S啟動子；Ampr氨芐抗性基因；Ori大腸桿菌復制起始位點；En44次串聯(lián)重復的增強子元件；Hgmr潮霉素抗性基因；MoaC，MoaC家族基因；R，根；SB，莖基；S，莖；L，葉；P，幼穗；圖3 Ostil1突變表型的回復驗證；其中A-C，Ostil1突變體的RNA干涉轉基因株系表型；A，Ostil1突變體；B、C，RNA干涉轉基因株系1和2(Ri1，Ri2)；D，在野生型中增強表達OsTIL1的轉基因株系表現(xiàn)為突變體表型；左邊苗為野生型，右邊兩株苗為增強表達轉基因株系1和2(OV1，OV2)；E，定量RT-PCR分析結果；Nip，野生型；空白條代表2cm；圖4 pcOV和pcRNAi載體圖譜；圖5 OsTIL1基因的cDNA序列；圖6 OsTIL1基因編碼的氨基酸序列。
具體實施例方式
在激活標簽T-DNA插入構建的日本晴水稻突變體庫中，篩選到一個多分蘗，分蘗角大的突變體材料(圖1)。在正常的生長季節(jié)(4月到8月)大田種植的Ostil1的平均分蘗數(shù)為27.5個，是野生型的2.4倍。分蘗角為41.3度，是野生型的5.6倍。株高為62.8cm，是野生型的65％(圖1)。用質粒營救方法從分蘗突變體的總DNA中分離出Ds插入的旁鄰DNA序列，經(jīng)測序和水稻基因組序列比較，發(fā)現(xiàn)插入于水稻的第4染色體上，根據(jù)插入位點兩側基因組序列設計引物進行協(xié)同分離分析表明突變表型和Ds插入是協(xié)同的。將插入位點兩側基因進行表達分析表明是由于插入位點右側的NAC基因增強表達引起的。經(jīng)5’RACE與3’RACE克隆出該基因全長CDS(Seq ID No1)，共1032個堿基，該cDNA編碼一個343個氨基酸的蛋白質(Seq ID No2)。針對該基因構建了增強表達和RNA干涉轉基因材料，結果發(fā)現(xiàn)在突變體中通過RNA干涉將低OsTIL1表達水平的轉基因材料表現(xiàn)出野生型的表型。而在野生型中增強表達該基因的轉基因材料表現(xiàn)出突變體的表型。從而進一步確定了該基因控制分蘗數(shù)和分蘗角度的功能(圖3)。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例1、1.Ostil1突變體篩選水稻多分蘗突變體是從1000多個激活標簽T-DNA插入突變體庫中篩選得到，根據(jù)分蘗表型命名為Ostil1(Oryza sativa tillering1)。
2.水稻材料的栽培條件水稻種子于35度浸種3天，然后播種于苗床上。4葉期的幼苗移栽到水田中，單株插秧，密度為20×20cm2。
3.協(xié)同分離和OSTIL1的克隆。
原始的T-DNA插入，Ds元件的跳躍和重新插入按照Suzuki等(2001)的方法進行分析，結果表明該突變體是由Ds跳躍后插入引起的。位于Ds元件中的潮霉素抗性基因用來進行突變表型和Ds元件的協(xié)同分離分析。利用PCR和Southern雜交來確定是否有Ds插入。PCR引物為GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA；CGGTCGCGGAGGCTATGGATG。通過質粒營救得到了插入位點旁側序列?？缭讲迦胛稽c的一對引物(ACCTGGTGTCTGCTTCCCTAACAG；ATGGCTGAGATGTGAATACGGTT)及其與35S引物的組合用于驗證存在Ds插入。
通過RT-PCR擴增得到1192bp的cDNA(含OsTIL1開放閱讀框)，所用引物為5’-AGGAGCAGTTAGCCAGGTAAAG-3’和5’-ATTAAGCGAACCTTGGTAGATG-3’。PCR反應條件為94℃ 5min接著是31循環(huán)94℃ 30s、60℃ 1.5min、72℃ 30s。將PCR產物克隆進pUC-T載體，經(jīng)過測序確認后進行后續(xù)工作。
4.質粒營救20μg基因組DNA經(jīng)HindIII酶切后用酚/氯仿純化，1/10體積的3mol/L NaAc和兩倍體積無水乙醇沉淀。沉淀用水溶解后用于自連反應。200μl連接反應體系中用450U T4連接酶(Takara，Japan)16℃反應8h。連接產物用異丙醇沉淀，用75％乙醇洗滌沉淀，晾干，溶解沉淀至終濃度為100μg ml-1。用電擊法將其轉化至E.coli DH5α電擊感受態(tài)細胞中，轉化使用BioRad基因融合儀(電壓2.5kv，電阻200Ω)。在含Amp抗性(50mg/l)的LB固體培養(yǎng)基上篩選抗性克隆，37℃培養(yǎng)16h。挑取陽性克隆經(jīng)PCR檢測后進行測序，用MegaBACETM1000(Amersham Pharmacia，USA)測序。得到的序列與數(shù)據(jù)庫GenBank中所有的水稻序列進行BLAST(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，并在RGP基因組注釋系統(tǒng)中進行基因預測和注釋(http//ricegaas.dna.affrc.go.jp/)。
實施例2、載體構建及植物轉化為了對克隆的基因進行表型驗證，將突變基因在野生型中增強表達或在突變體干涉以觀察表型。對增強表達載體通過農桿菌介導法轉化野生型(日本晴)的愈傷組織(Chen等，2003)，而對干涉載體轉化突變體Ostil1和野生型的愈傷組織。
OsTIL1用PCR方法克隆，所用引物是AGGAGCAGTTAGCCAGGTAAAG；ATTAAGCGAACCTTGGTAGATG。PCR產物長為1192bp。PCR產物回收后連接到T載體上，選反向連接克隆用EcoRV、BamHI酶切連接到pCAMBIA1301-35S，得到增強表達載體為pcOV。
OsTIL1干涉載體(pcRNAi)構建如下用以下引物擴增OSTIL1中的一段(470-804bp，共334bp)，上游引物AGAACGAGTGGGTGTTGT；下游引物CTGCCCGTACTGCGTGAAG，PCR產物長為334bp。PCR產物連接到T載體上命名為NAC2-2-T。構建步驟用NotI、BamHI雙酶切將該片段正向連接在一個亞硝酸還原酶內含子的左側，再用XhoI、EcoRV將該片段反向連接在該片段的右側。最后將包含這3個片段的序列連接到帶35S的pCAMBIA2301載體上得到的載體為pcRNAi。
兩個質粒通過電擊的方法轉入農桿菌株系EHA105中轉化水稻(Chen等，2003)。將Ostil1突變體和野生型種子脫殼滅菌，在誘導愈傷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周后，選擇生長旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷，用作轉化的受體。用含雙元質粒的載體EHA105菌株侵染水稻愈傷，在黑暗處25度培養(yǎng)3天后，在含50mg/L潮霉素(對干涉載體用80mg/L的G418)的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷和轉基因植株。潮霉素或G418抗性苗在陰涼處煉苗，一周后移栽到水田栽培收獲T1代。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
序列表SEQ ID NO1ATGGAGCAGC ATCAGGGCCA GGCAGGCATG GACTTGCCCC CTGGCTTCCG CTTCCACCCG60ACCGACGAGG AGCTGATCAC GCACTACCTC GCCAAGAAGG TCGCCGACGC CCGCTTCGCC120GCCCTCGCCG TCGCCGAGGC CGACCTCAAC AAGTGCGAGC CCTGGGACCT GCCATCTCTG180GCGAAGATGG GGGAGAAGGA GTGGTACTTC TTCTGCCTCA AGGACAGGAA GTACCCGACG240GGGCTGAGGA CGAACAGGGC GACGGAGTCC GGGTACTGGA AGGCCACGGG GAAGGACAAG300GACATCTTCA GACGGAAGGC CCTCGTCGGC ATGAAGAAGA CGCTCGTTTT CTACACGGGG360CGCGCTCCCA AGGGGGAGAA GTCTGGCTGG GTCATGCACG AGTACCGCCT CCACGGCAAG420CTCCACGCCG CCGCCCTCGG CTTCCTCCAC GGCAAGCCCG CGTCGTCCAA GAACGAGTGG480GTGTTGTGCA GGGTGTTCAA GAAGAGCCTC GTGGAGGTGG GCGCGGCGGG AGGGAAGAAG540GCGGCCGTGG TGACGATGGA GATGGCGAGG GGAGGGTCGA CGTCGTCGTC CGTGGCGGAC600GAGATCGCCA TGTCGTCCGT CGTCCTCCCT CCGCTGATGG ACATGTCCGG AGCCGGCGCC660GGCGCCGTCG ACCCGGCGAC GACGGCGCAC GTGACCTGCT TCTCCAACGC GCTGGAGGGC720CAGTTCTTTA ACCCGACGGC AGTACACGGG CACGGCGGCG GCGACTCCTC GCCGTTCATG780GCGAGCTTCA CGCAGTACGG GCAGCTGCAC CACGGCGTGA GCCTGGTGCA ACTCCTGGAG840AGCTGCAACG GCTACGGCGG CCTCGTCGAC ATGGCAGCGT CCGGCAGCCA GCTGCAGCCG900GCGGCGTGCG GCGGCGAGCG GGAGAGGCTT AGCGCGTCGC AGGACACCGG CCTCACCTCC960GACGTGAACC CGGAGATCTC GTCATCCTCC GGCCAAAAAT TCGACCACGA GGCCGCGCTA1020TGGGGCTACT AA1032SEQ ID NO2Met Glu Gln His Gln Gly Gln Ala Gly Met Asp Leu Pro Pro Gly15Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ile Thr His Tyr Leu30Ala Lys Lys Val Ala Asp Ala Arg Phe Ala Ala Leu Ala Val Ala45Glu Ala Asp Leu Asn Lys Cys Glu Pro Trp Asp Leu Pro Ser Leu60Ala Lys Met Gly Glu Lys Glu Trp Tyr Phe Phe Cys Leu Lys Asp75Arg Lys Tyr Pro Thr Gly Leu Arg Thr Asn Arg Ala Thr Glu Ser90Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Lys Asp Lys Asp Ile Phe Arg Arg105Lys Ala Leu Val Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe Tyr Thr Gly120
Arg Ala Pro Lys Gly Glu Lys Ser Gly Trp Val Met His Glu Tyr135Arg Leu His Gly Lys Leu His Ala Ala Ala Leu Gly Phe Leu His150Gly Lys Pro Ala Ser Ser Lys Asn Glu Trp Val Leu Cys Arg Val165Phe Lys Lys Ser Leu Val Glu Val Gly Ala Ala Gly Gly Lys Lys180Ala Ala Val Val Thr Met Glu Met Ala Arg Gly Gly Ser Thr Ser195Ser Ser Val Ala Asp Glu Ile Ala Met Ser Ser Val Val Leu Pro210Pro Leu Met Asp Met Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ala Val Asp Pro225Ala Thr Thr Ala His Val Thr Cys Phe Ser Asn Ala Leu Glu Gly240Gln Phe Phe Asn Pro Thr Ala Val His Gly His Gly Gly Gly Asp255Ser Ser Pro Phe Met Ala Ser Phe Thr Gln Tyr Gly Gln Leu His270His Gly Val Ser Leu Val Gln Leu Leu Glu Ser Cys Asn Gly Tyr285Gly Gly Leu Val Asp Met Ala Ala Ser Gly Ser Gln Leu Gln Pro300Ala Ala Cys Gly Gly Glu Arg Glu Arg Leu Ser Ala Ser Gln Asp3l5Thr Gly Leu Thr Ser Asp Val Asn Pro Glu Ile Ser Ser Ser Ser330Gly Gln Lys Phe Asp His Glu Ala Ala Leu Trp Gly Tyr34權利要求
1.一種水稻分蘗調控基因OsTIL1編碼的蛋白質，其特征在于其具有Seq ID No2所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的水稻分蘗調控基因OsTIL1編碼的蛋白質，其特征在于所述氨基酸序列還包括在Seq ID No2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個氨基酸生成的衍生物。
3.一種編碼權利要求1或2所述蛋白質的基因，其特征在于所述基因具有Seq ID No1所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的編碼權利要求1或2所述蛋白質的基因，其特征在于所述核苷酸序列還包括在Seq ID No1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一個或多個核苷酸生成的突變體、等位基因和衍生物。
5.一種含有權利要求3或4所述的基因的質粒。
6.一種如權利要求5所述質粒的植物表達載體。
7.一種包含權利要求3或4所述核酸的轉基因植物細胞。
8.一種對水稻分蘗進行改造的方法，其特征在于包括用權利要求3所述的基因轉化水稻細胞，再將轉化后的水稻細胞培育成植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻分蘗調控基因OsTIL1編碼的蛋白質，以及編碼上述蛋白質的基因；本發(fā)明還公開了含有上述基因的質粒、該種質粒的植物表達載體、相應的轉基因植物細胞，以及對水稻分蘗進行改造的方法。本發(fā)明基因的克隆有助于研究水稻分蘗發(fā)生發(fā)育的分子機制，對生產上培育具有優(yōu)良株型結構的高產水稻品種，或通過轉基因的方法改良其他作物的高產株型結構具有很大的應用潛力。
文檔編號C12N15/82GK1900280SQ200610052529
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月19日 優(yōu)先權日2006年7月19日
發(fā)明者毛傳澡, 吳平, 丁沃娜, 吳運榮 申請人:浙江大學