專利名稱：應(yīng)用dna條形編碼鑒定雞品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用DNA條形編碼鑒定雞品種的方法，具體的說應(yīng)用DNA測序技術(shù)測定線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase I COI)基因序列，利用COI這一特定基因的特定區(qū)段作為DNA條形碼鑒定雞品種，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于我國家禽品種市場還欠規(guī)范，培育的品種良莠不齊，假冒偽劣、以次充好的現(xiàn)象時有發(fā)生，目前對家禽品種的鑒定主要是以形態(tài)學(xué)標(biāo)記為依據(jù)來審查育種檔案和進(jìn)行生產(chǎn)性能測定，隨著育種水平的不斷提高，親本與雜交后代的外貌特征有較大的相似性，比如以地方雞種為父本、與隱性白羽雞母本進(jìn)行雜交，其雜交子一代與地方雞種就特別相似，很難從外貌特征進(jìn)行區(qū)分?，F(xiàn)代的專門化品系主要注重生產(chǎn)性能，品系的外貌特征并不一定完全一致，比如國外引進(jìn)的高產(chǎn)蛋雞，通過羽色鑒別的商品代母雞背部條紋有多種表現(xiàn)型，因此其品系間的鑒定不能簡單地通過外貌來進(jìn)行區(qū)分，所以利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記來進(jìn)行家禽品種(品系)鑒定就不夠科學(xué)。如果進(jìn)行生產(chǎn)性能測定，不僅要花費較長時間(蛋雞及種雞約72周，肉種雞約66周，肉雞商品代約14周)，而且成本也很高，測定的結(jié)果還要受飼養(yǎng)各個環(huán)節(jié)因素的影響，難以準(zhǔn)確反映各品系的種質(zhì)特性。而用同工酶和蛋白質(zhì)標(biāo)記鑒定只能間接反映品種的極少部分DNA的多態(tài)性。因此，上述這些方法不能科學(xué)、準(zhǔn)確地進(jìn)行家禽品種的鑒定，而且鑒定時間長，成本也很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要克服傳統(tǒng)的品種鑒定方法存在的準(zhǔn)確性差、成本高以及鑒定時間長等方面的缺陷，發(fā)明一種科學(xué)、準(zhǔn)確的雞品種鑒定方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的應(yīng)用DNA條形編碼鑒定雞品種的方法，其特征是利用DNA測序技術(shù)測定受測雞群體與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase I COI)基因序列，根據(jù)測序的COI序列中的突變位點、單倍型、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)、品種間雙參數(shù)模型遺傳距離、品種間核苷酸分歧度、各品種的特異位點及品種的DNA分類圖進(jìn)行雞品種鑒定，其步驟是(1)對受測雞品種與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品隨機抽取血樣，用酚-氯仿法提取基因組DNA；(2)按照中國紅色原雞mt DNA COI中的保守區(qū)設(shè)計引物；(3)利用設(shè)計的引物對所鑒定雞群的mt DNACOI進(jìn)行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收，并在ABI 3730測序儀上進(jìn)行雙向測序；(4)對測序結(jié)果進(jìn)行序列讀取和比對；(5)統(tǒng)計單倍型、平均核苷酸差異和核苷酸多樣度、核苷酸分歧度、凈遺傳距離和核苷酸變異位點，確定是品種間變異還是品種內(nèi)變異；(6)根據(jù)mtDNA COI序列按照UPGMA法進(jìn)行聚類，確定是否屬于同一品種或同一群體。
所述的隨機抽取血樣的受測雞種與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品雞種中樣品數(shù)量為12只個體，母雞與公雞的比例為1∶1。
由于線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶COI基因在同一物種中具有相對的保守性，又有足夠的變異可區(qū)分不同的品種，它揭示的是遺傳物質(zhì)DNA的差異，與應(yīng)用表型性狀、生產(chǎn)性能、生化標(biāo)記和其他遺傳標(biāo)記等方法相比，更能真實的反映品種間的差異。利用DNA條形編碼鑒定雞品種的方法，其結(jié)果可作為鑒定雞品種真?zhèn)蔚目茖W(xué)依據(jù)。
具體實施例方式
(1)對受測雞品種與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品中隨機抽取6只公雞，6只母雞，翅靜脈采血，血樣用酚-氯仿法提取基因組DNA；(2)按照Gen Bank上發(fā)表的中國紅色原雞mt DNA COI(序列號)中的保守區(qū)設(shè)計3對引物；(3)利用3對引物對所鑒定雞群的mt DNA COI進(jìn)行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收和在ABI 3730測序儀上進(jìn)行雙向測序；(4)測序通過Chromas軟件讀取，并對每個測序結(jié)果進(jìn)行人工逐個堿基讀取和反復(fù)校對，并通過雙向重復(fù)測序進(jìn)行校正，所獲序列用CLUSTALW軟件進(jìn)行比對，并且與GenBank雞(Gallus Gallus)屬線粒體COI基因序列進(jìn)行比較，用MEGA3.0軟件中的Kimura雙參數(shù)法計算遺傳距離。應(yīng)用鄰接法(NJ)構(gòu)建進(jìn)化系統(tǒng)樹。應(yīng)用DNAsp 4.10統(tǒng)計單倍型、平均核苷酸差異和核苷酸多樣度、核苷酸分歧度、凈遺傳距離和核苷酸變異位點等；(5)根據(jù)受測雞種和標(biāo)準(zhǔn)對照雞品種COI基因序列的單倍型、平均核苷酸差異和核苷酸多樣度、核苷酸分歧度和凈遺傳距離，確定雞品種內(nèi)及品種間COI基因序列變異程度。如果平均變異小于2％，則為同一品種，大于2％則為不同品種；(6)根據(jù)兩者的COI基因序列的特異位點的差異，判定是否為同一雞種；(7)用Mega3.0軟件，根據(jù)mtDNA COI序列按照UPGMA法進(jìn)行聚類，若受測定雞中與標(biāo)準(zhǔn)對照雞種聚為一類則為同一品種，否則為不同品種。
權(quán)利要求
1.應(yīng)用DNA條形編碼鑒定雞品種的方法，其特征是利用DNA測序技術(shù)測定受測雞群體與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase I COI)基因序列，根據(jù)測序的COI序列中的突變位點、單倍型、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)、品種間雙參數(shù)模型遺傳距離、品種間核苷酸分歧度、各品種的特異位點及品種的DNA分類圖進(jìn)行雞品種鑒定，其步驟是(1)對受測雞品種與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品隨機抽取血樣，用酚-氯仿法提取基因組DNA；(2)按照中國紅色原雞mt DNA COI中的保守區(qū)設(shè)計引物；(3)利用設(shè)計的引物對所鑒定雞群的mt DNACOI進(jìn)行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收，并在ABI 3730測序儀上進(jìn)行雙向測序；(4)對測序結(jié)果進(jìn)行序列讀取和比對；(5)統(tǒng)計單倍型、平均核苷酸差異和核苷酸多樣度、核苷酸分歧度、凈遺傳距離和核苷酸變異位點，確定是品種間變異還是品種內(nèi)變異；(6)根據(jù)mtDNA COI序列按照UPGMA法進(jìn)行聚類，確定是否屬于同一品種或同一群體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用DNA條形編碼鑒定雞品種的方法，其特征是所述的隨機抽取血樣的受測雞種與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品雞種中樣品數(shù)量為12只個體，母雞與公雞的比例為1∶1。
全文摘要
應(yīng)用DNA條形編碼鑒定雞品種的方法屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的利用DNA測序技術(shù)測定受測雞群體與標(biāo)準(zhǔn)對照樣品的線粒體細(xì)胞色素C氧化酶I(cytochrome C oxidase I COI)基因序列，根據(jù)測序的COI序列中的突變位點、單倍型、單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)、品種間雙參數(shù)模型遺傳距離、品種間核苷酸分歧度、各品種的特異位點及品種的DNA分類圖進(jìn)行雞品種鑒定。與應(yīng)用表型性狀、生產(chǎn)性能、生化標(biāo)記和其他遺傳標(biāo)記等方法相比，本發(fā)明更能真實的反映品種間的差異。其結(jié)果可作為鑒定雞品種真?zhèn)蔚目茖W(xué)依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK101016565SQ20071002005
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月9日
發(fā)明者高玉時, 屠云潔, 鄒劍敏, 王克華, 童海兵, 顧榮 申請人:江蘇省家禽科學(xué)研究所