專利名稱：：植物miRNA及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)和植物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種植物miRNA，其前體及其用途。
背景技術(shù)：
：raiRNA(microRNA)是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列單鏈RNA，長約22nt。miRNA基因主要單個或成簇地位于基因組的非編碼區(qū)內(nèi)。目前人們已發(fā)現(xiàn)的miRNA約為數(shù)千個，大部分功能未知。據(jù)目前的研究顯示，miRNA執(zhí)行一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制，在蛋白表達(dá)過程中扮演重要角色。miRNA通過不完全堿基互補(bǔ)的方式與mRNA相應(yīng)的區(qū)域結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯；在某些植物中，其還可以降解mRNA。通常一個基因可以被多個raiRNA所調(diào)節(jié)，同時一個miRNA也可以調(diào)節(jié)多個mRNA。miRNA表達(dá)具有高度的保守性、時序性和組織特異性。研究表明miRNA參與了幾乎所有的生命活動，并起著重要作用，在動物中，包括細(xì)胞發(fā)育、造血、脂肪代謝、器官生成、凋亡、細(xì)胞增殖與分化及腫瘤的發(fā)生。此外，在某些病毒中也發(fā)現(xiàn)有miRNA表達(dá)。在植物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄形成的miRNA前體首先折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，然后在DCL1的作用下剪切形成成熟的miRNA。在不同的植物組織、器官和不同的發(fā)育時期，miRNA的表達(dá)譜是不同的，對miRNA表達(dá)譜的研究將對miRNA生物功能的研究起到巨大的推動作用。盡管目前已經(jīng)在生物體中發(fā)現(xiàn)了一些miRNA，然而這些miRNA僅占生物體中存在的miRNA中相當(dāng)少的一部分，并且研究人員對于這些miRNA的功能還了解很少。因此，本領(lǐng)域迫切需要進(jìn)一步地分離miRNA，以研究miRNA的表達(dá)譜以及它們對于生物體的調(diào)節(jié)作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種植物miRNA基因及其用途。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的miRNA，所述的miRNA選自(i)序列如SEQIDNO:1-SEQIDNO:137所示的miRNA;(ii)與SEQIDNO:1—SEQIDNO:137任一所示序列互補(bǔ)的miRNA。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的miRNA分離自禾本科植物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的植物是水稻。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的miRNA在植物細(xì)胞內(nèi)能夠與至少一條mRNA的至少一部分序列互補(bǔ)。在本發(fā)明的第二方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸可被植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可在植物細(xì)胞內(nèi)被剪切且表達(dá)成所述的miRNA。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸含有式I所示的結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>，式I中，Seqm為可在植物細(xì)胞中表達(dá)成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反向為與Seq正向基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；或者，Seq反向為可在植物細(xì)胞中表達(dá)成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq頓為與Seqm基本上互補(bǔ)的核苷酸序列。X為位于Seqm和Seq礎(chǔ)之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq戰(zhàn)和Seq反向7l^卜，式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，形成式II所示的二級結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式II中，Seq^、Seq^和X的定義如上述，II表示在Seq正向和Seq反向之間形成的堿基互補(bǔ)配對關(guān)系。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的miRNA具有SEQIDNO:1-SEQIDNO:137任一所示的序列；或者所述的前體miRNA具有SEQIDNO:138-SEQIDNO:274任一所示的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供一種抑制目的基因表達(dá)的方法，所述的方法包括步驟(1)提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸可被植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA,所述的前體miRNA可被植物細(xì)胞剪切且加工成能夠與該目的基因?qū)?yīng)的mRNA的至少一部分序列互補(bǔ)的miRNA;(2)將(1)中所述的多核苷酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，從而通過剪切目的基因或者抑制基因翻譯的方式來抑制所述目的基因的功能。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的miRNA具有選自SEQIDNO:1-SEQIDNO:137任一所示的序列。在本發(fā)明的第四方面，提供所述的miRNA的用途，用于制備抑制或者調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)的組合物。在本發(fā)明的第五方面，提供一種載體，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸。在本發(fā)明的第六方面，提供一種植物細(xì)胞，它是選自下組(a)用所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；或(b)用所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖l顯示了水稻中花ll品種的種子、葉、根、胚乳、胚中miRNA基因的表達(dá)模式；圖中，比色板指示著miRNA的表達(dá)強(qiáng)度，所示的-2.0(藍(lán)色)一0(黑色)一2.0(黃色)表示miRNA表達(dá)的由弱到強(qiáng)的變化，越靠近2.0表示表達(dá)越強(qiáng)。越靠近-2.0表示表達(dá)越弱。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過長期而廣泛的研究，首次從水稻的不同發(fā)育階段的種子中分離獲得一類新的miRNA，這些miRNA能夠特異性結(jié)合到mRNA的相應(yīng)部位，影響相應(yīng)的mRNA的轉(zhuǎn)錄作用，從而影響相應(yīng)的基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明提供的miRNA可對于植物生長、發(fā)育產(chǎn)生影響?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。如本文所用，所述的"植物(或作物)"包括但不限于禾本科植物(如水稻)、豆科植物等。此外，所述的植物還可包括林業(yè)作物、喬木、花卉植物等。優(yōu)選的，所述的植物是指任何攜帶本發(fā)明所提供的miRNA(其序列如SEQIDNO:1-SEQIDNO:137所示)或攜帶與所述的raiRNA具有較高同源性(如具有80%同源性或更高)的raiRNA，或其mRNA的表達(dá)可被本發(fā)明所提供的miRNA所影響的植物的總稱。本發(fā)明提供了一類從植物中發(fā)現(xiàn)的miRNA，植物miRNA可從前體miRNA加工而來，所述的前體miRNA可折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)，所述的莖環(huán)結(jié)構(gòu)長度一般在60-330bp之間。通常，前體raiRNA可在植物細(xì)胞內(nèi)被剪切成成熟的miRNA分子。本發(fā)明的一個方面提供一種植物的miRNA。如本文所用，所述的"miRNA"是指一種RNA分子，被從可形成miRNA前體的轉(zhuǎn)錄物加工而來。成熟的miRNA通常具有18-26個核苷酸(一般約22個核苷酸)，然而也不排除具有其它數(shù)目核苷酸的miRNA分子。miRNA通?？杀籒orthern印跡檢測到。植物來源的miRNA是在植物細(xì)胞中由前體miRNA加工獲得的miRNA。植物來源的miRNA也可被從植物細(xì)胞中分離。如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。miRNA通常是由前體miRNA加工而來的，因此，本發(fā)明的另一方面關(guān)于可在植物細(xì)胞中被加工產(chǎn)生miRNA的前體miRNA(PrecursormiRNA，Pre-miRNA)。并且，所述的前體miRNA也是可從植物中被分離的。所述的前體miRNA可折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖部兩側(cè)包含基本上互補(bǔ)的兩條序列。所述的前體raiRNA可以是天然的或是人工合成的。前體miRNA可被植物細(xì)胞剪切生成miRNA，所述的miRNA可與編碼基因的mRNA的至少一部分序列基本上互補(bǔ)。如本文所用，"基本上互補(bǔ)"是指核苷酸的序列是足夠互補(bǔ)的，可以以一種可預(yù)見的方式發(fā)生相互作用，如形成二級結(jié)構(gòu)(如莖環(huán)結(jié)構(gòu))。通常，兩條"基本上互補(bǔ)"的核苷酸序列互相之間至少有70%的核苷酸是互補(bǔ)的；優(yōu)選的，至少有80%的核苷酸是互補(bǔ)的；更優(yōu)選的，至少有90%的核苷酸是互補(bǔ)的；進(jìn)一步優(yōu)選的，至少有95%的核苷酸是互補(bǔ)的；如98%、99%或100%。一般地，兩條足夠互補(bǔ)的分子之間可以具有最多40個不匹配的核苷酸；優(yōu)選的，具有最多30個不匹配的核苷酸；更優(yōu)選的，具有最多20個不匹配的核苷酸；進(jìn)一步優(yōu)選的，具有最多10個不匹配的核苷酸，如具有0、1、2、3、4、5、8、9個不匹配的核苷酸。如本文所用，"莖環(huán)"結(jié)構(gòu)也被稱作"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)，是指一種核苷酸分子，其可形成一種包括雙鏈區(qū)域(莖部)的二級結(jié)構(gòu)，所述的雙鏈區(qū)域由該核苷酸分子的兩個區(qū)域(位于同一分子上)形成，兩個區(qū)域分列雙鏈部分的兩側(cè)；其還包括至少一個"環(huán)"結(jié)構(gòu)，包括非互補(bǔ)的核苷酸分子，即單鏈區(qū)域。即使該核苷酸分子的兩個區(qū)域不是完全互補(bǔ)的，核苷酸的雙鏈部分也可保持雙鏈狀態(tài)。例如，插入、缺失、取代等可導(dǎo)致一個小區(qū)域的不互補(bǔ)或該小區(qū)域自身形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或其它形式的二級結(jié)構(gòu)，然而，該兩個區(qū)域仍可基本上互補(bǔ)，并在可預(yù)見的方式中發(fā)生相互作用，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈區(qū)域。莖環(huán)結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，通常在獲得了一條具有一級結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的核酸后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定該核酸是否能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人采用大規(guī)模平行信號測序系統(tǒng)，從水稻不同發(fā)育階段的種子中分離、鑒定出大量新的miRNA。具體而言，本發(fā)明人從野生型水稻中花11的種子中提取總RNA分離出18-26nt的小RNA(smallRNA)，將小RNA克隆入載體后，用MPSS技術(shù)分析得到Signature序列，屏蔽掉可能為接頭來源的序列并將可信性較低的序列過濾掉。接著，本發(fā)明人用BLAST程序(NCBI)把Signature序列定位到水稻染色體上，剔除在基因組上沒有匹配的序列。以Rfam數(shù)據(jù)庫(TIGR)為參考，去除rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等。為了鑒別剩下的序列中的miRNA，以400bp的窗口(window)在基因組上選取包含這些序列的前體序列(前體miRNA)，用RNAfold軟件預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。同時滿足以下幾個標(biāo)準(zhǔn)的為raiRNA:①miRNA定位在前體結(jié)構(gòu)的某一臂上(5'或3')，并且前體結(jié)構(gòu)自由能最低；②以miRNA為中心的25nt中，錯配數(shù)不得大于7;③前體結(jié)構(gòu)中沒有大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這些被鑒定出來的miRNA的序列如SEQIDNO:1-SEQIDNO:137所示。所述的前體miRNA的序列如SEQIDNO:138-SEQIDNO:274所示。對這些miRNAs的表達(dá)模式研究表明，這些miRNA集中在種子中表達(dá)。將miRNA前體基因或者成熟miRNA直接放入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化植物后可在植物體內(nèi)形成有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體，然后被加工修飾形成成熟miRNAs，進(jìn)而抑制或影響基因的表達(dá)，從而達(dá)到對基因進(jìn)行修飾得目標(biāo)。此外，本發(fā)明還提供了在嚴(yán)格條件下能夠與SEQIDNO:1-SEQIDNO:137所限定的序列雜交且具有與植物細(xì)胞內(nèi)至少一種mRNA的至少一部分序列互補(bǔ)功能的miRNA;或者，與SEQIDNO:1-SEQIDNO:137任一所示序列有95%以上同源性且具有與植物細(xì)胞內(nèi)至少一種mRNA的至少一部分序列互補(bǔ)功能的miRNA。根據(jù)本發(fā)明所提供的植物miRNA序列，可設(shè)計出在被導(dǎo)入植物中后可被植物加工成可影響相應(yīng)的m脂A表達(dá)的miRNA的多核苷酸構(gòu)建物。因此，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸(構(gòu)建物)，所述的多核苷酸(構(gòu)建物)可被植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可被植物細(xì)胞裂解且表達(dá)成所述的miRNA。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的多核苷酸構(gòu)建物含有式I所示的結(jié)構(gòu)Seq正向—X—Seq反向《I，式I中，SeqM為可在植物細(xì)胞中表達(dá)成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq頒為與SeqH向基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；或者，Seq^為可在植物細(xì)胞中表達(dá)成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq戰(zhàn)為與Seq^基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；X為位于Seq^和Seq之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq頓和Seq式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，形成式n所示的二級結(jié)構(gòu)Seq正向.Seq反向"^式工工，式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述；II表示在Seqm和Seq反向之間形成的堿基互補(bǔ)配對關(guān)系。本發(fā)明還提供一種抑制目的基因表達(dá)的方法，所述的方法包括步驟(1)提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸可被植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可被植物細(xì)胞剪切且加工成能夠與該目的基因?qū)?yīng)的mRNA的至少一部分序列互補(bǔ)的miRNA;(2)將(1)中所述的多核苷酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，從而抑制所述目的基因的功能。在本發(fā)明中，將所述的多核苷酸構(gòu)建物導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，該多核苷酸構(gòu)建物在體內(nèi)被轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，之后所述的前體miRNA被加工成miRNA，所述的miRNA可與相應(yīng)的mRNA的部分序列相互補(bǔ)，從而抑制該mRNA相應(yīng)的目的基因的表達(dá)。所述植物細(xì)胞再生成植物后，該轉(zhuǎn)基因植物中相應(yīng)的目的基因的表達(dá)與野生型不同。通常，所述的多核苷酸構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括一種載體，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有啟動子、復(fù)制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉素、慶大霉素、潮霉素、氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)基因序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?。在本發(fā)明的方法中，所述的宿主可以是任何適合于攜帶所述表達(dá)載體并能夠?qū)⑺霰磉_(dá)載體傳遞給植物細(xì)胞的宿主。優(yōu)選的，所述的宿主為農(nóng)桿菌。此外，利用本發(fā)明所述的miRNA序列，還可以點(diǎn)制miRNA芯片研究其表達(dá)譜以及miRNAs的調(diào)節(jié)方式，具有很高的應(yīng)用價值。通過利用所述的miRNA制備的miRNA芯片，可分析miRNA基因的表達(dá)模式，可了解植物中相應(yīng)的基因?qū)γ{迫等(比如干旱，高鹽等)的調(diào)節(jié)情況；可設(shè)計相應(yīng)的策略，調(diào)節(jié)和修飾靶基因，來提高對脅迫等環(huán)境的適應(yīng)能力，或者形成具有較好農(nóng)藝性狀的基因修飾作物。此外，利用miRNA芯片還可進(jìn)行作物育種的分子篩選。根據(jù)miRNA芯片的雜交結(jié)果，可有針對性地篩選具有某種表達(dá)模式的植株，并選育成穩(wěn)定品系。提高育種的選擇效率。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于從水稻的不同發(fā)育階段的種子中分離獲得一類新的miRNA，這些miRNA能夠特異性結(jié)合到mRNA的相應(yīng)部位，影響相應(yīng)的mRNA的轉(zhuǎn)錄作用，從而影響相應(yīng)的基因的表達(dá)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1miRNA的獲得1.RNA抽提選用粳稻中花11號，在人工氣候室(光周期為28。C光照12小時與22"C黑暗12小時)中栽培，3個月完成整個生命周期。播種后60天開花，分別在開花后3天、6天、9天、12天采收水稻種子。種子材料液氮中研磨后，用TRIZOL試劑盒，按照TRIZOL試劑盒自帶的說明書提取總RNA。2.smallRNA序列的獲得和篩選用20%PAGE膠回收1826nt的smallRNA，把smallRNA克隆入測序載體TagvectorpMBSI(購自Solexa公司)后，用MPSS技術(shù)湖U序得到Signature序列，屏蔽掉可能為接頭來源的序列部分，所用方法是將全長的Signature序列和測序載體序列比較，序列3'端和載體完全匹配的認(rèn)為是載體序列，并將可信性較低(如測序信號很低等)的序列過濾掉。3.miRNA的鑒定用BLAST程序(NCBI，www.ncbi.nlm.nih.gov)把smallRNASignature序列定位到水稻染色體上(TIGR注釋信息，ww.tigr.org)，剔除在基因組上沒有匹配的序列。以Rfam數(shù)據(jù)庫(TIGR注釋信息，www.tigr.org)為參考，去除rRNA、tRNA、snRNA和sno腿等。在剩下的smallRNA序列中，為了鑒別其中的miRNA，本發(fā)明人用Perl語言(www.perl,com)編寫了一個腳本程序，以400bp的窗口(window)在基因組上選取包含所述smallRNA的前體序列，用RNAfold軟件(www.tbi.univie.ac.at)預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。同時滿足以下幾個標(biāo)準(zhǔn)的sma11RNA被鑒定為miRNA:①miRNA定位在前體結(jié)構(gòu)的某一臂上(5'或3，)，并且前體結(jié)構(gòu)自由能最低；②以miRNA為中心的25nt中，錯配數(shù)不得大于7;③前體結(jié)構(gòu)的莖上沒有大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。4.結(jié)果通過前述篩選，獲得137條新的成熟miRNA，如SEQIDNO:1_SEQIDN0:137(表l)所示。這些miRNA的前體miRNA的序列如SEQIDNO:138-SEQIDNO:274(表2)所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>AAAAAAAUCCAAGA267AACCGGAUGGGAUGUAUCCUAGUACUACGAAUCUGGACAUGCCCUCUGUCUAGAUUCGUAGUGCUAGGAUACGUCCCAUCCGAU268269CCCUCUAAAAAAAACAGACAUCUUUCACCCUCAACUAUCAAACMUUGCUAGUUGAGGAUGMAGAUGUAUGGUUUUCGGGUUUG270UAUGAAUAUGCAAAG271272====S=SS======CGGMGATOUAGACAGCGU273CUUGCAUGGCCAAAAGGUUCAG274表2中各序列的特點(diǎn)是可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，表1中各成熟的miRNA來自表2中相應(yīng)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的莖的其中一側(cè)。并且:的各miRNA是——對應(yīng)的，對應(yīng)關(guān)系如下miRNASEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO123表2中的miRNA的前體與表1中mi脂A前體SEQIDNOSEQIDNOSEQIDNO138139140SEQIDNO:136SEQIDNO:137SEQIDNO:273;SEQIDNO:274。實(shí)施例2miRNA對于植物基因表達(dá)的影響用miRNA基因特異的引物，以基因組DNA為模板，經(jīng)過PCR獲得miRNA基因(即前體miRNA)片段。將上述片段克隆至雙元載體pBIlOl(購自Clontech公司)的多克隆位點(diǎn)上，并通過常規(guī)的根農(nóng)桿菌法將重組載體轉(zhuǎn)化水稻幼胚，誘導(dǎo)幼胚分化成水稻植株。用植物的抗性篩選標(biāo)記潮霉素抗性，篩選轉(zhuǎn)化的植物，檢測轉(zhuǎn)化植株中miRNA對靶基因的修飾作用，并可通過與野生型植株進(jìn)行對比來區(qū)別轉(zhuǎn)化植株的表型變化。實(shí)施例3水稻中花ll的多種組織中的miRNA表達(dá)譜的測定(1)制備miRNA芯片將表l提供的miRNA序列轉(zhuǎn)換成反向互補(bǔ)序列，根據(jù)產(chǎn)生序列的GC比等特征在序列兩端加上10-20nt的連接序列；核心序列不同，連接序列也不同。連接序列可以由程序隨機(jī)產(chǎn)生，連接序列和核心序列形成的探針滿足以下條件1)探針序列中，同一種核苷酸(A、C、G、"的數(shù)量不能超過序列總數(shù)的50%;2)任何連續(xù)的A、T或C、G的數(shù)量不能超過序列總數(shù)的25呢；3)G、(:含量占序列總數(shù)的40%-60%;4)探針序列不能自雜交，即探針序列中互補(bǔ)片段的長度不能超過探針長度的30%。為使合成的探針穩(wěn)定的結(jié)合在玻片上，采用常規(guī)的方法在合成后探針的5'端進(jìn)行糖基修飾。先將玻片的表面進(jìn)行垸基化修飾，以提高結(jié)合能力。采用常規(guī)的芯片點(diǎn)樣方法進(jìn)行點(diǎn)樣，為了檢測雜交試驗的可重復(fù)性，每個探針在玻片上點(diǎn)3-6個雜交點(diǎn)。(2)提取植物組織smallRNATrizol—步法提取組織的總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，用分光光度計定量，甲醛變性凝膠電泳質(zhì)檢總RNA的質(zhì)量。取50-100(ig總RNA用Ambion，smiRNAIsolationKit(Cat#.1560)分離smallRNA。利用常規(guī)標(biāo)記方法(T4RNA連接酶標(biāo)記法)進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記底物是cy3，然后再用無水乙醇沉淀，吹干后用于與芯片雜交。(3)雜交將RNA溶于16(iL雜交液中(15%甲酰胺；0.2%SDS;3xSSC;50XDenhardt's)，于42"雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42。C左右含0.2。/。SDS，2xSSC的液體中洗4min，而后在0.2xSSC液體中室溫洗4min。玻片甩干后即可用于掃描。(4)表達(dá)譜測定A.miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的處理準(zhǔn)備水稻中花ll的多種組織(包括種子、葉、根、胚乳、胚)，采用常規(guī)方法分別分離smallRNA，釆用實(shí)施例2制備的芯片，根據(jù)實(shí)施例3中的方法進(jìn)行芯片雜交，獲得每個組織中的所有miRNA的表達(dá)結(jié)果。各種組織需要生物重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。B.miRNA表達(dá)譜的編制用相關(guān)軟件，將所有數(shù)據(jù)歸一化處理。用整張芯片所有信號中為數(shù)相等的方法規(guī)一化。計算相同組織所有miRNA信號的平均值。用TIGR的MeVv3.l顯示所有miRNA在不同組織中的表達(dá)情況，編制成miRNA表達(dá)譜。結(jié)果如圖l所示。由表達(dá)圖譜結(jié)果顯示，大部分miRNA的表達(dá)具有組織特異性，集中在一到兩個組織中表達(dá)，提示miRNA在特異的組織行使功能。另外，大部分miRNA在胚乳中表達(dá)都很低，和基因mRNA的表達(dá)模式相似。因此可以通過影響miRNA的表達(dá)模式，來很大程度上改變目標(biāo)基因的表達(dá)模式，而起到改變作物農(nóng)藝性狀等的目的。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種分離的miRNA，其特征在于，所述的miRNA選自(i)序列如SEQIDNO1-SEQIDNO137所示的miRNA；或(ii)與SEQIDNO1-SEQIDNO137任一所示序列互補(bǔ)的miRNA。2.如權(quán)利要求l所述的miRNA，其特征在于，所述的miRNA分離自未本科植物。3.如權(quán)利要求l所述的miRNA，其特征在于，所述的植物是水稻。4.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸可被植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可在植物細(xì)胞內(nèi)被剪切且表達(dá)成權(quán)利要求l所述的miRNA。5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有式I所示的結(jié)構(gòu)Seq正向一X—Seq反向《I，式I中，Seq軸為可在植物細(xì)胞中表達(dá)成權(quán)利要求1所述的miRNA的核苷酸序列，Seq反^為與Seq^基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；或者，Seq^為可在植物細(xì)胞中表達(dá)成權(quán)利要求1所述的miRNA的核苷酸序列,Seq自為與Seqm基本上互樸的核苷酸序列。X為位于Seq正*和Seq礎(chǔ)之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq^和Seq反向^;s凈卜，式I所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，形成式II所示的二級結(jié)構(gòu)Seq正向一^-xiiXSeq反向"^式n，式II中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述，II表示在SeqM和SeqM之間形成的堿基互補(bǔ)配對關(guān)系。6.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述的miRNA具有SEQIDNO:1-SEQIDNO:137任一所示的序列；或者所述的前體miRNA具有SEQIDNO:138-SEQIDNO:274任一所示的序列。7.—種抑制目的基因表達(dá)的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸可被植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄成前體miRNA，所述的前體miRNA可在植物細(xì)胞內(nèi)被剪切且加工成能夠與該目的基因?qū)?yīng)的mRNA的至少一部分序列互補(bǔ)的miRNA;(2)將(1)中所述的多核苷酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，從而通過剪切目的基因或者抑制基因翻譯的方式來抑制所述目的基因的功能。8.權(quán)利要求l所述的miRNA的用途，其特征在于，用于制備抑制或者調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)的組合物。9.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求l所述的miRNA，或權(quán)利要求4所述的多核苷酸。10.—種植物細(xì)胞，其特征在于，它是選自下組(a)用權(quán)利要求9所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；或(b)用權(quán)利要求4所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開了一類新的分離自植物的miRNA，所述的miRNA選自序列如SEQIDNO1-SEQIDNO137所示的miRNA或與SEQIDNO1-SEQIDNO137任一所示序列互補(bǔ)的miRNA。本發(fā)明還提供了所述的miRNA的前體以及在植物細(xì)胞內(nèi)可被轉(zhuǎn)錄成前體miRNA的多核苷酸構(gòu)建物。文檔編號C12N15/29GK101225394SQ20071003657公開日2008年7月23日申請日期2007年1月18日優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日發(fā)明者薛紅衛(wèi),薛良交申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院