專利名稱：利用細(xì)胞行為調(diào)控獲取纖維堆囊菌液體發(fā)酵菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及粘細(xì)菌液體發(fā)酵菌種改造的工藝方法，具體地說(shuō)涉及一種利用細(xì)胞行為 調(diào)控技術(shù)獲取粘細(xì)菌纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株的方法。(二) 背景技術(shù)粘細(xì)菌(myxobacteria)是一類可滑動(dòng)的單細(xì)胞革蘭氏陰性細(xì)菌，在其整個(gè)生活史 中表現(xiàn)出復(fù)雜的多細(xì)胞行為特征，如細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴于細(xì)胞的密度(cell-density d印endent growth),細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)同時(shí)存在個(gè)體運(yùn)動(dòng)(adventurous motility)禾口群體 運(yùn)動(dòng)(social motility)方式，細(xì)胞菌落按節(jié)律方式擴(kuò)展，以及在固體介質(zhì)表面營(yíng)養(yǎng) 饑餓的高密度細(xì)胞聚集并分化發(fā)育形成復(fù)雜的多細(xì)胞休眠性子實(shí)體(fruiting body) 結(jié)構(gòu)等。粘細(xì)菌是典型的化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)菌，嚴(yán)格好氧，其生長(zhǎng)發(fā)育一般分為兩個(gè)階段第一 個(gè)階段是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)期，細(xì)胞在適宜生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏期后能夠以指數(shù)形 式生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率極慢，代時(shí)一般為4 12小時(shí)，而其中最具應(yīng)用價(jià)值的纖維堆囊菌的 代時(shí)可以長(zhǎng)達(dá)16小時(shí)。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)停止后進(jìn)入生活周期的第二階段，即細(xì)胞發(fā)育 期。在生長(zhǎng)過(guò)程中，粘細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)依賴于細(xì)胞的密度，即在利用蛋白質(zhì)等大分子底 物生長(zhǎng)時(shí)，粘細(xì)菌的初始細(xì)胞濃度必須達(dá)到一定的閾值，否則細(xì)胞不能生長(zhǎng)，這與粘細(xì) 菌通過(guò)子實(shí)體由大量的由粘孢子生成的細(xì)胞開(kāi)始一個(gè)新生活循環(huán)的特征相對(duì)應(yīng)。比從單 個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)和形成孢子從進(jìn)化上是一個(gè)更好的生存選擇，對(duì)種群的延續(xù)也更為有利。作為最高等的原核生物，粘細(xì)菌特殊的社會(huì)性細(xì)胞行為和多細(xì)胞形態(tài)發(fā)生在進(jìn)化上 不僅高于一般原核生物，而且與真核生物有著極大的相似性，被認(rèn)為是原核生物和真核 生物間界面上的微生物類群，是研究生物進(jìn)化和細(xì)胞自組織的重要材料。近年來(lái)，粘細(xì)菌尤其是其中的纖維堆囊菌(&r3nw'咖ceJJ^os咖:)由于豐富多樣 的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生能力而引起醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。在原核生物中按已發(fā)現(xiàn) 生物活性物質(zhì)的數(shù)量，粘細(xì)菌僅排在放線菌和芽孢桿菌之后，盡管粘細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物 的研究歷史比它們短的多。目前，已從粘細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)100多種的基本結(jié)構(gòu)和600多種結(jié) 構(gòu)衍生物。粘細(xì)菌中分離的天然產(chǎn)物大多數(shù)來(lái)源于纖維堆囊菌屬，粘球菌屬，軟骨霉?fàn)?菌屬和標(biāo)樁菌屬；而小囊菌屬和珊瑚球菌屬中能檢測(cè)到的天然產(chǎn)物非常有限。其中來(lái)源 于纖維堆囊菌的天然產(chǎn)物幾乎占了所檢測(cè)的粘細(xì)菌來(lái)源的天然產(chǎn)物的一半，并且?guī)缀?100%的纖維堆囊菌菌株都能夠產(chǎn)生生物學(xué)活性次級(jí)代謝產(chǎn)物，其代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和 生物活性作用機(jī)制的多樣性甚至可以與著名的鏈霉菌類群相比擬。促微管聚合類化合物紫杉醇(Paclitaxel， Taxol )及其類似物Docetaxel (Taxotere )是目前臨床上最為成功的抗腫瘤化療藥物，被用于卵巢癌、胸腺癌、結(jié) 腸癌、肺癌和肝癌等實(shí)體癌的治療，是美國(guó)FDA認(rèn)定的實(shí)體瘤化療的首選藥物。在與紫 杉醇具有相同或相似生物學(xué)功能的五種天然化合物中，只有埃博霉素(Epothilones)來(lái)源于微生物纖維堆囊菌的發(fā)酵產(chǎn)物，并被認(rèn)為是紫杉醇的更新?lián)Q代產(chǎn)品，是更好的抗 癌藥物。目前，已有多個(gè)埃博霉素類化合物進(jìn)入了不同階段的臨床試驗(yàn)。因此，關(guān)于粘細(xì)菌尤其是纖維堆囊菌工業(yè)化液體發(fā)酵的相關(guān)研究和技術(shù)具備了很好 的應(yīng)用前景和意義。但是，作為細(xì)菌中的特例，纖維堆囊菌的細(xì)胞行為特性使得利用其 進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)次級(jí)代謝物，仍面臨著許多亟待解決的問(wèn)題。纖維堆囊菌的代時(shí)通常 遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于普通細(xì)菌，因此發(fā)酵周期較長(zhǎng)，在液態(tài)培養(yǎng)時(shí)容易造成染菌，例如埃博霉素發(fā) 酵的周期通常在14天左右；野生纖維堆囊菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量比較低；纖維堆囊菌 具有的細(xì)胞密度依賴性和大量分泌胞外粘液的特性使其在液體表面形成菌膜或沿著器 具內(nèi)壁蔓延，在液體內(nèi)部易形成團(tuán)塊和面條狀菌團(tuán)，難以分散生長(zhǎng)；菌團(tuán)內(nèi)外的細(xì)胞狀 態(tài)不一致，導(dǎo)致總體性發(fā)酵調(diào)控十分困難；而且，纖維堆囊菌次級(jí)代謝產(chǎn)物有時(shí)只有在 發(fā)酵過(guò)程中施加限制條件才能產(chǎn)生。為了實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌優(yōu)良液體發(fā)酵菌株的選育，采取細(xì)胞行為調(diào)控的方法，馴化菌 株，調(diào)控發(fā)酵過(guò)程顯得合理和可行。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)和專利的檢索，國(guó)內(nèi)外針對(duì)上述問(wèn)題的相 關(guān)技術(shù)和方法至今未見(jiàn)文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述粘細(xì)菌纖維堆囊菌液體發(fā)酵生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物過(guò)程中，發(fā)酵菌株表現(xiàn)出的 不足，本發(fā)明的主要目的是提供一種以細(xì)胞行為調(diào)控技術(shù)為基礎(chǔ)的發(fā)酵菌株選育和改造 流程，它可以有效地克服現(xiàn)有工藝的缺陷，更加高效和針對(duì)性地獲得優(yōu)良的纖維堆囊菌 液體發(fā)酵菌株。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，具體步驟順序如下-(1) 纖維堆囊菌發(fā)酵菌株的選擇粘細(xì)菌中唯一能夠降解纖維素的菌株——纖維堆囊菌(5b層w'"歷cej楊扁)， 例如ATCC15384， ATCC25531和ATCC25569菌株。該類菌株均為野生型表型(圖l)，能 夠滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)并形成典型的子實(shí)體結(jié)構(gòu)，生長(zhǎng)有細(xì)胞密度依賴性，在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌大量 多糖類胞外粘液，在液體培養(yǎng)時(shí)，菌體成團(tuán)生長(zhǎng)。(2) 纖維堆囊菌發(fā)酵培養(yǎng)的基本條件進(jìn)行固體培養(yǎng)時(shí)，菌株要被接種在含有大豆蛋白胨，馬鈴薯淀粉等的固體斜面MMS 培養(yǎng)基上，3CTC培養(yǎng)。其中MMS固體培養(yǎng)基成分為大豆蛋白胨5 15g/L，馬鈴薯淀 粉15 25g/L， CaCl2 2H20 0 . 8 1. 5 g/L， MgS04 7H20 0. 7 1. 4 g/L， Fe-EDTA 5 10 mg/L，瓊脂粉13 17 g/L。進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)，菌株要被接種在含有地瓜淀粉，水解乳蛋白等的液體MML培養(yǎng)基 中，3(TC ， 120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)。其中MML液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為地瓜淀粉15 35 g/L， 水解乳蛋白8 20 g/L， CaCl2 2H20 0. 8 1. 5 g/L， MgS04 7H20 0. 7 1. 4 g/L， Fe-EDTA 5 10 mg/L。(3) 纖維堆囊菌菌株胞外多糖分泌的減少或去除除了配合以傳統(tǒng)的誘變策略，在菌株的連續(xù)液體傳代培養(yǎng)時(shí)，通過(guò)在基本培養(yǎng)基中添加各種非離子表面活性劑等成分，減少或去除纖維堆囊菌胞外多糖的分泌。在液體基本培養(yǎng)基中添加TritonX-100， Span-20, Span-60， Span-40, Span-80 (失水山梨醇單 月桂酸酯類)，Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80 (聚環(huán)氧乙烷失水山梨醇單 月桂酸酯類)等非離子型表面活性劑中的一種，濃度從0. 05%依次遞增到0. 5%，每次增 加O. 15%，在一個(gè)濃度條件下進(jìn)行兩次或者以上的傳代培養(yǎng)，最終實(shí)現(xiàn)菌體液體培養(yǎng)時(shí) 胞外粘液類物質(zhì)的減少，從而增加菌體分散生長(zhǎng)的趨勢(shì)(圖2-A,B)。具體做法是，首 先將菌體在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中3(TC， 120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)5-7天。培養(yǎng)基的成分為地 瓜淀粉15 35g/L，水解乳蛋白8 20 g/L，CaCL* 2H20 0. 8 1. 5 g/L， MgSO, 7H20 0 . 7 1.4 g/L， Fe-EDTA 5 10 mg/L和0. 05%的非離子型表面活性劑。然后，將收集到的菌 體在同樣條件再傳代培養(yǎng)一次。接著，將培養(yǎng)基中的非離子表面活性劑濃度提高為0. 2%， 其它條件不變，將上一次培養(yǎng)收集到的菌體作為接種物，按照1:10的體積比例接種， 培養(yǎng)2-5次。將培養(yǎng)基中的非離子表面活性劑濃度提高為0.35%，其它條件不變，將上 一次培養(yǎng)收集到的菌體作為接種物，按照1:10的體積比例接種，培養(yǎng)2-5次。最后， 將培養(yǎng)基中的非離子表面活性劑濃度提高為0.5%,其它條件不變，將上一次培養(yǎng)收集 到的菌體作為接種物，按照1:10的體積比例接種，培養(yǎng)2-5次。最終實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌 菌體液體培養(yǎng)時(shí)胞外粘液類物質(zhì)的減少或去除。在這一過(guò)程中，使用萃取的方法評(píng)價(jià)菌株胞外多糖的數(shù)量。將菌體及其胞外粘液溶 到去離子水中，旋渦混合儀振蕩3-5分鐘，8000-12000g離心25-35min，上清液過(guò)0. 45 Pm濾膜完全去除菌體，加入1.5-4倍體積的冷乙醇，4。C放置24小時(shí)。撈取漂浮在液 面上的白色產(chǎn)物，用乙醇洗兩次后60'C干燥。產(chǎn)物重溶于雙蒸水中，氯仿與異戊醇混 合液(5:1, v/v)多次抽提去蛋白。4'C透析48小時(shí)，冷凍干燥后對(duì)于胞外多糖進(jìn)行稱 重。(4)纖維堆囊菌社會(huì)性細(xì)胞行為特征的去除本部分主要是通過(guò)在"非社會(huì)性"培養(yǎng)條件下的連續(xù)傳代，使菌株喪失某些甚至大 部分社會(huì)性行為特征，并且在后續(xù)的液體發(fā)酵過(guò)程中維持一定的壓力脅迫，從而去除其生長(zhǎng)過(guò)程的社會(huì)性細(xì)胞行為特征。具體做法是將第(3)步獲得的胞外多糖產(chǎn)生能力顯著降低的菌株接種于10-20ml液體CDM培養(yǎng)基中，3(TC， 120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期 前期，然后加入100-200ml新鮮CDM培養(yǎng)基稀釋菌體，取出10-20ml混合液繼續(xù)30°C ， 120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)，每?jī)商爝M(jìn)行一次同樣的稀釋和再培養(yǎng)，重復(fù)50-IOO次，即可獲得 社會(huì)性細(xì)胞行為特征去除的纖維堆囊菌。(圖2-C，D，E)。其中所述CDM培養(yǎng)基的成分 為脫脂奶粉0. 05-0. 1%,酵母粉0. 05-0. 1%，馬鈴薯淀粉0.5-1.0%，甘油0. 1-0. 2%， CaCl2 2H20 0. 05-0. 15% ， MgS04 7H20 0. 05-0. 15% ， Fe-EDTA 6-10mg/L ， HEPES 30-60mmol/L， pH 7.0-7. 3。在操作過(guò)程中，采用以下的方法評(píng)價(jià)纖維堆囊菌菌株生長(zhǎng)的社會(huì)性細(xì)胞行為特征。 以MML培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基3(TC培養(yǎng)，3-4天收集營(yíng)養(yǎng)菌體。打勻，離心洗滌收集的菌體, 重懸于無(wú)菌水中，計(jì)數(shù)，進(jìn)行系列稀釋。取相應(yīng)的菌體濃度為lx108， lx107, lx106, lxl(T, lx103， lxl02和10細(xì)胞/ml稀釋液1 ml，接種于100 ml MMS培養(yǎng)基液體搖瓶， 另外取0.2 ml涂布一個(gè)MMS培養(yǎng)基固體平板，3(TC培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)狀況，分析運(yùn)動(dòng)，子實(shí)體形成以及細(xì)胞濃度的對(duì)生長(zhǎng)的限制等社會(huì)性細(xì)胞行為特征。(5) 纖維堆囊菌液體分散生長(zhǎng)的實(shí)現(xiàn)將第(4)步獲得的社會(huì)性細(xì)胞行為特征去除的菌體接種MMS固體平板活化，30°C 加濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用接種鏟挑取邊緣的擴(kuò)展菌膜再次接種于MMS的固體平板上，并將其 碾開(kāi)，培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。將菌體用接種鏟轉(zhuǎn)入液體MML培養(yǎng)基搖瓶中，并在瓶壁上碾 碎，3(TC， 200rpm搖床培養(yǎng)至指數(shù)期；倒棄大部分(2/3 9/10量)培養(yǎng)液，并用殘留 的液體沖刷菌體球，合并于滅菌的含玻璃珠及攪拌子的三角瓶?jī)?nèi)，置磁力攪拌器上打勻 菌體(2-3min)，按照1:10的體積比例接種于新鮮的液體MML培養(yǎng)基中30°C 200rpm搖 床培養(yǎng)至指數(shù)期。重復(fù)這一過(guò)程，直至纖維堆囊菌菌株實(shí)現(xiàn)液體分散生長(zhǎng)(圖2-F)。上述過(guò)程中，使用以下的方法評(píng)價(jià)菌株分散生長(zhǎng)的能力。取30ml細(xì)胞液離心 (3000-5000g， 5-10min)除去培養(yǎng)基，加入30ml重蒸水，劇烈振蕩1-2分鐘后，靜止 2分鐘。取上層菌液顯微鏡計(jì)數(shù)。上層菌液中游離細(xì)胞的數(shù)目越多說(shuō)明培養(yǎng)液具有更高 的細(xì)胞分散程度。(6) 生長(zhǎng)迅速、代時(shí)減少的纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株的獲得通過(guò)前面(3-5)步的操作，可以獲得無(wú)社會(huì)性細(xì)胞行為特征并且在液體中分散生 長(zhǎng)的纖維堆囊菌菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，尋找此類菌株的適合培養(yǎng)條件，篩得優(yōu) 化的液體培養(yǎng)基，進(jìn)而獲得生長(zhǎng)迅速、代時(shí)減少的纖維堆囊菌菌株，即為液體發(fā)酵的優(yōu) 良菌株。經(jīng)測(cè)定，獲得的液體發(fā)酵菌株在液體培養(yǎng)時(shí)能夠分散生長(zhǎng)，代時(shí)能由野生型的12-16 小時(shí)縮短到4-5小時(shí)。(7) 優(yōu)良液體發(fā)酵纖維堆囊菌菌株的評(píng)價(jià)對(duì)采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的優(yōu)良菌株，測(cè)定其發(fā)酵過(guò)程的各類參數(shù)(圖3)，包 括代時(shí)，生長(zhǎng)曲線，細(xì)胞分散程度，產(chǎn)物產(chǎn)量等，最終獲得可用于規(guī)?；后w發(fā)酵的優(yōu) 良纖維堆囊菌菌株。本項(xiàng)技術(shù)的創(chuàng)造性在于1)利用細(xì)胞行為調(diào)控技術(shù)，獲取粘細(xì)菌纖維堆囊菌液體 發(fā)酵優(yōu)良菌株；2)通過(guò)在液體培養(yǎng)基中添加非離子型表面活性劑的方法減少和去除了 纖維堆囊菌菌株胞外多糖的分泌；3)通過(guò)連續(xù)液體稀釋培養(yǎng)，去除了纖維堆囊菌生長(zhǎng) 的社會(huì)性細(xì)胞行為特征；4)通過(guò)連續(xù)液體打散細(xì)胞傳代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌液體培 養(yǎng)的分散生長(zhǎng)；5)通過(guò)該流程的操作，可以獲得生長(zhǎng)迅速，代時(shí)減少的纖維堆囊菌菌 株，其代時(shí)可由野生型的12-16小時(shí)縮短到4-5小時(shí)；6)最終改造和篩選獲得的菌株 具有代時(shí)短，生長(zhǎng)迅速，液體分散生長(zhǎng)，細(xì)胞密度高等優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)規(guī) 模的液體發(fā)酵。本發(fā)明開(kāi)創(chuàng)了高效而經(jīng)濟(jì)的粘細(xì)菌纖維堆囊菌優(yōu)良液體發(fā)酵菌株的改造和篩選技 術(shù)，改造和篩選獲得的菌株具有代時(shí)短，生長(zhǎng)迅速，并且在液體培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)分散生長(zhǎng)狀 態(tài)，可以進(jìn)一步應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模的液體發(fā)酵，為通過(guò)液體規(guī)?；l(fā)酵纖維堆囊菌生產(chǎn)各 種代謝產(chǎn)物提供了堅(jiān)實(shí)的理論支持和技術(shù)保障。能夠大大降低利用纖維堆囊菌工業(yè)化發(fā)酵制備各種發(fā)酵產(chǎn)物的成本，提高了效率，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益。(四)


圖l 一株纖維堆囊菌的野生型培養(yǎng)形態(tài)特征圖中所示，A圖為菌株的平板菌落形態(tài)；C圖和F圖為菌株的液體培養(yǎng)生長(zhǎng)形態(tài)；B 圖為菌株固體培養(yǎng)基上菌膜擴(kuò)展形態(tài)；D圖為菌株形成的子實(shí)體形態(tài)；E圖為菌株的細(xì)胞形態(tài)。A圖，C圖和F圖中標(biāo)尺為lcm， B圖和D圖中標(biāo)尺為lmm， E圖中標(biāo)尺為5um。圖2細(xì)胞行為調(diào)控后纖維堆囊菌菌株呈現(xiàn)出的培養(yǎng)特征圖中所示，A圖為多糖合成能力解除菌株；B圖為野生型菌株；C圖為社會(huì)性細(xì)胞行 為特征喪失菌株；D圖顯示改造后菌株液體培養(yǎng)細(xì)胞堆團(tuán)明顯變??；E圖顯示改造后菌 膜擴(kuò)展能力增強(qiáng)，子實(shí)體形成能力喪失；F圖為液體分散生長(zhǎng)菌株和野生菌株的細(xì)胞分 散程度比較。圖3改造后獲得的一株優(yōu)良液體發(fā)酵纖維堆囊菌菌株發(fā)酵產(chǎn)生埃博霉素能力評(píng)價(jià)圖中所示，A圖為野生型液體發(fā)酵產(chǎn)生埃博霉素的時(shí)間曲線；B圖為野生型液體發(fā) 酵埃博霉素產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)色譜圖；C圖為改造后獲得的優(yōu)良液體發(fā)酵菌株產(chǎn)生埃博霉 素的時(shí)間曲線;D圖為改造后獲得的優(yōu)良液體發(fā)酵菌株發(fā)酵埃博霉素產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)色譜圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l本實(shí)施例是解釋如何減少和去除纖維堆囊菌菌株胞外多糖分泌，也就是通過(guò)在液體培養(yǎng)基中添加非離子型表面活性劑的方法減少和去除纖維堆囊菌菌株胞外多糖的分泌 的方法。具體步驟如下1) 取纖維堆囊菌(So環(huán)ffj'"譜爆o，) ATCC25531分散細(xì)胞懸液用20%甘油水溶液 稀釋到5X108cells/ml濃度作為UV照射的出發(fā)菌液。用致死率大于95%的UV誘變 劑量照射菌液。誘變過(guò)程中用磁力攪拌器緩慢攪拌菌液。誘變菌液涂布國(guó)S平板， 3(TC避光培養(yǎng)5-7天。國(guó)S培養(yǎng)基成分為大豆蛋白胨12g/L，馬鈴薯淀粉10g/L， CaCl2 2H20 1.0 g/L， MgS04 7H20 0. 9 g/L， Fe-EDTA 7 mg/L，瓊脂粉15 g/L。2) 挑取單克隆菌落用于檢測(cè)其胞外多糖產(chǎn)生能力。將菌體及其胞外粘液溶到去離子水 中，旋渦混合儀振蕩3分鐘，10000g離心30min，上清液過(guò)0. 45 y m濾膜完全去除 菌體，加入3倍體積的冷乙醇，4'C放置24小時(shí)。撈取漂浮在液面上的白色產(chǎn)物， 用乙醇洗兩次后6(TC千燥。產(chǎn)物重溶于雙蒸水中，氯仿與異戊醇混合液(5:1， v/v) 多次抽提去蛋白。4X:透析48小時(shí)，冷凍干燥后對(duì)于胞外多糖進(jìn)行稱重。3) 將獲得的胞外多糖初步減少的菌株進(jìn)行連續(xù)液體傳代培養(yǎng)。首先將菌體在MML液體 發(fā)酵培養(yǎng)基(MML液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為地瓜淀粉20g/L,水解乳蛋白10g/L， CaCl2 2H20 1. 0 g/L， MgS(X 7H20 1. 2 g/L， Fe-EDTA 10 mg/L和0. 05%的Tween-60。) 中3(TC， 120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)5天。然后，將收集到的菌體在同樣條件再傳代培養(yǎng)一-60濃度提高為0.2%,其它條件不變，將上一次培 養(yǎng)收集到的菌體作為接種物，按照體積比1:10的體積比例接種，培養(yǎng)2次。將培養(yǎng) 基中的Tween-60濃度提高為0.35W，其它條件不變，將上一次培養(yǎng)收集到的菌體作 為接種物，按照體積比1:10的體積比例接種，培養(yǎng)2次。最后，將培養(yǎng)基中的非離 子表面活性劑濃度提高為0. 5%，其它條件不變，將上一次培養(yǎng)收集到的菌體作為接 種物，按照體積比1:10的體積比例接種，培養(yǎng)3次。4)在培養(yǎng)過(guò)程中，使用步驟2)的方法測(cè)定胞外多糖的產(chǎn)量，對(duì)獲得的所有菌株進(jìn)行 評(píng)價(jià)和篩選。最終實(shí)現(xiàn)通過(guò)在液體培養(yǎng)基中添加非離子型表面活性劑的方法減少或 去除纖維堆囊菌菌株胞外多糖的分泌，進(jìn)而增加菌體分散生長(zhǎng)的趨勢(shì)。實(shí)施例2本實(shí)施例是解釋如何去除纖維堆囊菌生長(zhǎng)的社會(huì)性細(xì)胞行為特征，也就是通過(guò)連續(xù)液體稀釋培養(yǎng)，去除纖維堆囊菌社會(huì)性細(xì)胞行為特征的方法。具體步驟如下1) 取纖維堆囊菌(5br,i鵬ce""7o扁)ATCC15384接種于10ml液體CDM培養(yǎng)基中， 30°C ， 120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期前期。其中CDM培養(yǎng)基的成分以重量百分比計(jì)為 脫脂奶粉0.05%，酵母粉0.05%，馬鈴薯淀粉-1.0%,甘油0.2%， CaCl2 2H20 0. 15%， MgS04 7H20 0. 15%, Fe-EDTA 10mg/L， HEPES 50鵬ol/L， pH 7. 2。2) 然后加入100ml新鮮CDM培養(yǎng)基稀釋菌體，震蕩混勻。取出10ml混合液繼續(xù)30"C， 120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)48小時(shí)。3) 再加入100ml新鮮CDM培養(yǎng)基稀釋菌體，震蕩混勻。取出10ml混合液繼續(xù)30°C， 120 轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)48小時(shí)。4) 重復(fù)此稀釋培養(yǎng)過(guò)程50次，歷時(shí)100天，獲得纖維堆囊菌菌株。5) 評(píng)價(jià)菌株生長(zhǎng)的細(xì)胞密度依賴性。以MML培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基3(TC培養(yǎng)，3天收集營(yíng) 養(yǎng)菌體。打勻，離心洗漆收集的菌體，重懸于無(wú)菌水中，計(jì)數(shù)，進(jìn)行系列稀釋。取 相應(yīng)的菌體濃度為lx108， lx107, lx106, lx105, lx104， lxlO'， lx102和10細(xì)胞 /ml稀釋液1 ml，接種于100 ml MMS培養(yǎng)基液體搖瓶，另外取0.2 ral涂布一個(gè) MMS培養(yǎng)基固體平板，3(TC培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)狀況，分析細(xì)胞濃度的對(duì)生長(zhǎng)的限制。6) 最終可獲得生長(zhǎng)細(xì)胞密度依賴性解除的纖維堆囊菌。 實(shí)施例3本實(shí)施例是解釋如何實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌液體培養(yǎng)的分散生長(zhǎng)，也就是通過(guò)連續(xù)液體打散細(xì)胞培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌液體培養(yǎng)的分散生長(zhǎng)的方法。具體步驟如下1) 取實(shí)施例2所獲得的生長(zhǎng)密度依賴性喪失的菌體接種固體平板活化，30'C加濕培養(yǎng) 箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為大豆蛋白胨10g/L，馬鈴薯淀粉15g/L， CaCl2'2H20 1.0 g/L， MgS04'7H20 1.0 g/L， Fe-EDTA 10 mg/L，瓊脂粉15 g/L。2) 用接種鏟挑取邊緣的擴(kuò)展菌膜再次接種于同樣的固體平板上，并將其碾開(kāi)，培養(yǎng)至9指數(shù)生長(zhǎng)期。3) 將菌體用接種伊轉(zhuǎn)入100ml液體培養(yǎng)基搖瓶中，并在瓶壁上碾碎，30°C 200rpm搖 床培養(yǎng)至指數(shù)期。液體培養(yǎng)基成分為地瓜淀粉25 g/L，水解乳蛋白10 g/L， CaCl2 2H20 1. 5 g/L, MgS04 7H20 1.4 g/L， Fe-EDTA 7 mg/L。4) 倒棄大部分培養(yǎng)液，剩下約10ml菌液，并用殘留的液體沖刷菌體球，合并于滅菌的 含玻璃珠及攪拌子的三角瓶?jī)?nèi)，置磁力攪拌器上打勻菌體(2min)，接種于新鮮的 100ml液體培養(yǎng)基30°C 200rpm搖床培養(yǎng)至指數(shù)期。5) 重復(fù)這一過(guò)程10次，菌株實(shí)現(xiàn)液體分散生長(zhǎng)。6) 菌株分散生長(zhǎng)的能力是這樣評(píng)價(jià)的取30ml細(xì)胞液離心(5000g, 10min)除去培 養(yǎng)基，加入30ml重蒸水，劇烈振蕩2分鐘后，靜止2分鐘。取上層菌液顯微鏡計(jì)數(shù)。 上層菌液中游離細(xì)胞的數(shù)目可以達(dá)到1.9x107，說(shuō)明菌株已基本實(shí)現(xiàn)液體培養(yǎng)的細(xì) 胞分散生長(zhǎng)。實(shí)施例4本實(shí)施例是解釋如何獲得生長(zhǎng)迅速，代時(shí)減少的纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株的方法。具體步驟如下1) 通過(guò)實(shí)施例l-3步的操作，可以獲得無(wú)生長(zhǎng)密度依賴性并且在液體中分散生長(zhǎng)的纖 維堆囊菌菌株。2) 將菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)基(KN030.05%, Na2HPOi 0. 025%， MgS0,7H20 0. 1%， FeCL 0. 001%， 微量元素液lml/L,瓊脂1.5%， pH7.2。滅菌后倒平板，待冷卻凝固后貼放4張直 徑為3cm的無(wú)菌濾紙片)活化，30'C恒溫培養(yǎng)4天。轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基(Baker' s 酵母0.5%; CaCl2*2H20 0.1%; 維生素B12 0.5ug/ml; pH7.2)擴(kuò)大培養(yǎng)， 30。C搖瓶培養(yǎng)3天，300 mL錐形瓶裝液量為50 mL,搖床轉(zhuǎn)速120 rpm。按接種量 10%接種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基上，3(TC搖瓶培養(yǎng)7天，300 mL錐形瓶裝液量為50 mL， 搖床轉(zhuǎn)速120 rpm。3) 按照文獻(xiàn)報(bào)道的適合纖維堆囊菌次級(jí)代謝的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，配制液體培養(yǎng)基， 300 mL的搖瓶中裝液量為50 mL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)3個(gè)平行對(duì)照。進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu) 化，尋找此類菌株適合的液體培養(yǎng)基。4) 例如獲得的一個(gè)優(yōu)良培養(yǎng)基配方是土豆淀粉0.2%，葡萄糖0.2%，蛋白胨0.2%， 脫脂奶粉0. 1%， MgS04 7H20 0. 1%， CaCl2 2H20 0. 1%， EDTA-Fe3+ lml/L，微量元素 lml/L， VB12 0. 5mg/L， pH7. 2。5) 經(jīng)過(guò)測(cè)定，在上述培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，可以獲得生長(zhǎng)迅速，代時(shí)減少的纖維堆囊菌 菌株，其代時(shí)可由野生型的14小時(shí)縮短到4.5小時(shí)。實(shí)施例5本實(shí)施例是解釋評(píng)價(jià)優(yōu)良液體發(fā)酵纖維堆囊菌菌株的方法。具體步驟如下 1)例如，能夠產(chǎn)生埃博霉素的纖維堆囊菌(5b，ffj-"歷ce"W。遍)菌株ATCC25569經(jīng)過(guò)實(shí)施例l-4獲得的優(yōu)良發(fā)酵菌株的評(píng)價(jià)。2) 將菌株用液體培養(yǎng)基(Baker' s酵母0.5%; CaCl2 2H20 0.1%;維生素B12 0.5" g/ml; pH7.2)擴(kuò)大培養(yǎng)，收獲的菌體用玻璃珠分散后接種發(fā)酵培養(yǎng)基(土豆淀粉 0.2%，葡萄糖O. 2%，蛋白胨0.2%，脫脂奶粉O. 1%, MgS04 7H20 0. 1%， CaCl2 2H20 0.1%， EDTA-Fe lml/L，微量元素lml/L， VB12 0. 5mg/L， pH7.2)。接種量每50ml發(fā) 酵培養(yǎng)基接種2X108個(gè)細(xì)胞。3) 發(fā)酵體系300ml三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50tnl，加lml吸附樹(shù)脂XAD-16。4) 發(fā)酵培養(yǎng)條件是120rpm往復(fù)搖床，30°C培養(yǎng)5天。5) 發(fā)酵結(jié)束后，過(guò)濾收集樹(shù)脂，樹(shù)脂用3倍體積蒸餾水洗漆三次，自然干燥。發(fā)酵樹(shù) 脂用IO倍體積甲醇振蕩浸提。浸提結(jié)束后，棄樹(shù)脂，甲醇浸提液定容。6) 取200y 1上述甲醇浸提液用0. 22u m的微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后作為HPLC分析的樣品。7) HPLC分析條件:色譜柱為Shim-pack VP-ODS， 4.6X250隱,4. 60+/-0. 3 u m;上樣 量為10ul;流動(dòng)相為甲醇和0.2%乙酸水溶液(65:35， v:v);流速為1. 0 ml/min; 柱溫為28°C;檢測(cè)波長(zhǎng)為249nm 。定性方式為滯留時(shí)間(Rt)和UV譜圖(PDA)。 埃博霉素A的滯留時(shí)間為12. 6分鐘，埃博霉素B的流出時(shí)間為15. 2分鐘。8) 經(jīng)檢測(cè)(圖3)，改良后的菌株5天發(fā)酵產(chǎn)生埃博霉素A和B的產(chǎn)量可達(dá)150mg/L， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出野生型菌株15天的發(fā)酵產(chǎn)量(1.6mg/L)。
權(quán)利要求
1.一種利用細(xì)胞行為調(diào)控技術(shù)獲取纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株的方法，包括(1)纖維堆囊菌菌株胞外多糖分泌的減少或去除，(2)纖維堆囊菌社會(huì)性細(xì)胞行為特征的去除，(3)纖維堆囊菌液體分散生長(zhǎng)的實(shí)現(xiàn)，(4)生長(zhǎng)迅速、代時(shí)減少的纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株的獲得；其特征是步驟(1)所述的纖維堆囊菌菌株胞外多糖分泌的減少或去除是指進(jìn)行纖維堆囊菌菌株連續(xù)液體傳代培養(yǎng)時(shí)，在MML液體培養(yǎng)基中添加非離子型表面活性劑，濃度從0.05％依次遞增到0.5％，每級(jí)梯度增加0.15％，在一個(gè)濃度條件下進(jìn)行兩次或兩次以上的傳代培養(yǎng)，逐級(jí)進(jìn)行，最終實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌菌體液體培養(yǎng)時(shí)胞外粘液類物質(zhì)的減少或去除；步驟(2)所述的纖維堆囊菌社會(huì)性細(xì)胞行為特征的去除是指將獲得的胞外多糖產(chǎn)生能力顯著降低的菌株接種于10-20ml液體CDM培養(yǎng)基中，30℃，120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)至穩(wěn)定期前期，然后加入100-200ml新鮮CDM培養(yǎng)基稀釋菌體，取出10-20ml混合液繼續(xù)30℃，120轉(zhuǎn)/分搖床培養(yǎng)，每?jī)商爝M(jìn)行一次同樣的稀釋和再培養(yǎng)，重復(fù)50-100次，即獲得社會(huì)性細(xì)胞行為特征去除的纖維堆囊菌；步驟(3)所述的纖維堆囊菌液體分散生長(zhǎng)的實(shí)現(xiàn)足指將獲得的社會(huì)性細(xì)胞行為特征去除的菌體轉(zhuǎn)入MML液體培養(yǎng)基搖瓶中，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)至指數(shù)期，倒棄2/3～9/10的培養(yǎng)液，并用殘留的液體沖刷菌體球，合并于滅菌的含玻璃珠及攪拌子的三角瓶?jī)?nèi)，置磁力攪拌器上打勻菌體，以1∶10的體積比例接種于新鮮的MML液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)至指數(shù)期；重復(fù)這一過(guò)程，直至纖維堆囊菌菌株實(shí)現(xiàn)液體分散生長(zhǎng)；步驟(4)所述的生長(zhǎng)迅速、代時(shí)減少的纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株的獲得是指通過(guò)步驟(1)至(3)的操作，獲得無(wú)社會(huì)性細(xì)胞行為特征并且在液體中分散生長(zhǎng)的纖維堆囊菌菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，尋找此類菌株的適合培養(yǎng)條件，篩得優(yōu)化的液體培養(yǎng)基，進(jìn)而獲得生長(zhǎng)迅速、代時(shí)減少的纖維堆囊菌菌株，即為液體發(fā)酵的優(yōu)良菌株。
2. 如權(quán)利要求1所述利用細(xì)胞行為調(diào)控技術(shù)獲取纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株的方法， 其特征在于步驟(1)所述在液體培養(yǎng)基中添加非離子型表面活性劑是TritonX-100， 或失水山梨醇單月桂酸酯類Span-20, Span-60, Span-40， Span-80，或聚環(huán)氧乙烷失 水山梨醇單月桂酸酯類Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80中的一種，濃度以 重量百分比計(jì)從0.05%依次遞增到0.5%，每級(jí)梯度增加0.15%，在一個(gè)濃度條件下進(jìn)行 兩次或兩次以上的傳代培養(yǎng)，逐級(jí)進(jìn)行，最終實(shí)現(xiàn)減少或去除纖維堆囊菌菌株胞外多糖的分泌。
3. 如權(quán)利要求1所述利用細(xì)胞行為調(diào)控技術(shù)獲取纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株的方法， 其特征在于步驟(2)所述CDM培養(yǎng)基的成分以重量百分比計(jì)為脫脂奶粉0.05-0. 1%， 酵母粉0. 05-0.1%，馬鈴薯淀粉O. 5-1.0%,甘油0.1-0.2%, CaCl2'2H20 0.05-0.15%， MgS(WH20 0.05-0.15%， Fe-EDTA 6-10mg/L， HEPES 30-60腿ol/L， pH 7.0-7.3。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)胞行為調(diào)控技術(shù)獲取纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株 的方法，其特征在于步驟(1)或(3)所述醒L液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為地瓜淀粉 15 35 g/L，水解乳蛋白8 20 g/L, CaCl2 2H20 0 . 8 1.5 g/L， MgS(WH20 0 . 7 1.4 g/L， Fe-EDTA 5 10 mg/L。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)胞行為調(diào)控技術(shù)獲取纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株 的方法，其特征在于步驟(4)所述獲得的液體發(fā)酵菌株在液體培養(yǎng)時(shí)能夠分散生長(zhǎng)， 代時(shí)能由野生型的12-16小時(shí)縮短到4-5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用細(xì)胞行為調(diào)控技術(shù)獲取纖維堆囊菌液體發(fā)酵優(yōu)良菌株的方法，主要是采取細(xì)胞行為調(diào)控的方法，減少和去除纖維堆囊菌菌株胞外多糖的分泌，去除菌體生長(zhǎng)的社會(huì)性細(xì)胞行為特征，并且實(shí)現(xiàn)纖維堆囊菌的液體分散生長(zhǎng)。改造和篩選獲得的纖維堆囊菌液體發(fā)酵菌株具有代時(shí)短，生長(zhǎng)迅速，液體分散生長(zhǎng)，細(xì)胞密度高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的工藝方法能夠大大降低利用纖維堆囊菌工業(yè)化發(fā)酵制備各種發(fā)酵產(chǎn)物的成本，提高了效率，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101220341SQ20071011561
公開(kāi)日2008年7月16日 申請(qǐng)日期2007年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月17日
發(fā)明者李越中, 瑋 胡 申請(qǐng)人:山東大學(xué)