專利名稱：永生化禽細(xì)胞系的制作方法
永生化禽細(xì)胞系
本發(fā)明涉及永生化禽細(xì)胞系，以及這些細(xì)胞在制備病毒中的用途。本
發(fā)明的細(xì)胞具體可用于制備重組病毒it體，其可用于制備治療動(dòng)物更具體 是人的治療和/或預(yù)防組合物。
真核細(xì)胞系是制備病毒疫苗和許多生物技術(shù)產(chǎn)品的基礎(chǔ)。細(xì)胞培養(yǎng)物 中的生物產(chǎn)品包括酶，激素，免疫生物物質(zhì)(單克隆抗體，白介素，淋巴因 子)，和抗癌劑。盡管許多更簡單的蛋白可利用細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生，更復(fù)雜的糖 基化蛋白質(zhì)目前必須在真核細(xì)胞中制備。
禽細(xì)胞多年來已經(jīng)用于制備病毒載體。例如，用于制備治療痘癥的預(yù)
防組合物的痘苗病毒在雞胚纖維母細(xì)胞(CEF)上培養(yǎng)。禽細(xì)胞非常有用，這 是由于許多用于藥物組合物中的病毒能在其上復(fù)制。更值得注意的是，多 種病毒僅能在禽細(xì)胞上生長。例如哺乳動(dòng)物安卡拉病毒(MVA)，其不能在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞上生長。這種痘病毒通過將痘苗病毒在CEF上傳代500次獲 得，用于17世紀(jì)早期對(duì)免疫缺陷人群進(jìn)行接種以對(duì)抗痘癥。現(xiàn)在MVA主 要用作基因治療目的的載體。例如，MVA用作MUC1基因的載體用于接 種病人對(duì)抗表達(dá)該抗原的腫瘤(Scholl et al., 2003， J Biomed Biotechnol., 2003， 3， 194-201)。攜帶編碼HPV抗原的基因的MVA也用作載體用于治療 禽肉瘤。最近，MAV作為可選載體來制備針對(duì)新出現(xiàn)的疾病或可能的生物 武器諸如西尼羅河病毒和炭疽的預(yù)防性治療。
因此，對(duì)病毒制備的需要不斷增長。目前，最有用的MVA生產(chǎn)方法 包括在CEF上的病毒復(fù)制步驟。但是CEF的應(yīng)用有很多困難。首先，CEF 的制備包括很多必須人工進(jìn)行的步驟。
此外，該病毒制備方法有賴于卵的可用性，在繁殖污染的情況下可能 完全破壞。這個(gè)問題與禽流感播散越來越相關(guān)。
此外，許多CEF具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性(RT)。 RT是逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)制所需的 酶。逆轉(zhuǎn)錄病毒見于許多不同物種。RT在人或動(dòng)物中不是感染性的，并且 不導(dǎo)致人中的任何不良健康影響。利用高度敏感的基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)的測定法，在利用雞胚纖維母細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗中檢測到微量的RT活
6性。該酶的來源很可能是編碼RT的部分病毒基因組，據(jù)信在數(shù)百甚至數(shù) 千年之前整合到雞細(xì)胞中。產(chǎn)生這種酶的禽逆轉(zhuǎn)錄病毒不影響人。雖然人 免疫缺陷病毒(HIV，導(dǎo)致AIDS的病毒)是逆轉(zhuǎn)錄病毒，疫苗中檢測的RT 活性絕對(duì)不是源自HIV的。此外，RT的檢測不能確定逆轉(zhuǎn)錄病毒的存在。 然而，沒有內(nèi)源性RT活性的細(xì)胞系是感興趣的。
為了使得病毒制備過程不受CEF使用的約束，需要允許病毒復(fù)制和產(chǎn) 生的禽細(xì)胞系。永生化細(xì)胞系可在生產(chǎn)位點(diǎn)在不同批次中保持或冷凍，并 總是可用于新的制備過程。此外，它們還局限在生產(chǎn)工廠，不容易收到外 源污染物的污染。它們的使用允許制備過程所需的人工操作明顯減少。所 有這些性質(zhì)導(dǎo)致價(jià)格降低、生產(chǎn)持續(xù)時(shí)間縮短以及潛在污染減少。
最后，細(xì)胞系可充分表征并且由此完全符合良好的實(shí)驗(yàn)室操作以及不 同藥劑的要求。
不同禽細(xì)胞系已經(jīng)被描述。例如DF1 (US5,879，924),是自發(fā)永生化雞 細(xì)胞系，其衍生自10日齡East Lansing Line (ELL-0)卵。所述細(xì)胞可用作病 毒增殖，重組蛋白表達(dá)和重組病毒產(chǎn)生的基質(zhì)。然而，該細(xì)胞系容易被多 種病毒感染，所述病毒諸如Meleagrid皰疹病毒1 (火雞皰疹病毒)，雞痘病 毒，呼腸病毒，禽肉瘤白血病病毒和勞斯肉瘤病毒。
永生禽細(xì)胞也可通過逐步從生長因子和喂養(yǎng)層分開而衍生自胚胎千細(xì) 胞，由此保持生長特征以及模糊的未分化干細(xì)胞的壽命特征。該方法衍生 的唯一的可得禽細(xì)胞系是Ebx雞細(xì)胞系(W02005007840)，其與鼠源喂養(yǎng)層 接觸，導(dǎo)致另外的調(diào)節(jié)問題諸如鼠病毒污染和雞細(xì)胞中內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒序 列的存在。此外，該細(xì)胞系在一些條件下不穩(wěn)定并且易于分化。
鴨胚永久細(xì)胞系，不包含內(nèi)源性禽逆轉(zhuǎn)錄病毒，也被建立。該細(xì)胞系 稱為DEC 99 (Ivanov et al. Experimental Pathology And Parasitology, 4/2000 Bulgarian Academy of Sciences),已經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)超過140代，并且對(duì)于鳥類 而言是非致瘤性的。DEC99細(xì)胞系是研究用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可用于生 物技術(shù)中。該細(xì)胞系是研究細(xì)胞生物學(xué)，病毒需，免疫學(xué)，毒理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn) 模型，并用于制備診斷劑和疫苗。永久鴨胚細(xì)胞系(CL)DEC 99對(duì)胚-適應(yīng) 禽痘病毒(embryo-adapted avian poxvirus) (APV)疫苗株的易感性已經(jīng)被研究 (Ivanov et al. Experimental Pathology. And Parasitology, 4/6 2001 BulgarianAcademy of Sciences)。禽和鵒子來源的FK和Dessau疫苗株已被使用。病 毒株在原代鴨胚細(xì)胞培養(yǎng)物(CC)上連續(xù)傳代(13代)。適應(yīng)的病毒株在DEC 99細(xì)胞系的CC上進(jìn)一步傳代(12代)，觀察到典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。 感染性病毒粒子的產(chǎn)生通過接種11-日齡白色來亨雞胚來檢査，在絨毛尿 囊膜(CAMs)上形成典型的痘增殖。在DEC99細(xì)胞中，F(xiàn)K株導(dǎo)致早期CPE, 與Dessau株形成對(duì)比，并達(dá)到滴度106,25 CCID50/ml。接種2月齡雛雞后， DEC 99-適應(yīng)的病毒株誘導(dǎo)常見的表皮病變("takes")。因此DEC 99作為標(biāo) 準(zhǔn)CC系統(tǒng)適合抗禽痘疫苗的制備。但是這種具體的細(xì)胞系在第40代之后 生長緩慢并不能懸浮生長。 .
人腺病毒5的早期區(qū)域的核酸序列已經(jīng)用于體外轉(zhuǎn)化一些特定的人細(xì) 胞(293和PER. C6細(xì)胞系；Fallaux，F(xiàn). J. etal.， Hum. Gene Ther. 9 : 1909-17 (1998); Graham, F. L. et al.， J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977))。
通常而言，腺病毒基因組由大約36kb的雙鏈線性DNA分子組成，其 中包含編碼超過30個(gè)蛋白的序列。在每個(gè)末端，根據(jù)血清型不同，存在作 為100-150個(gè)核苷酸的短反向序列的ITR(反向末端重復(fù))。ITR參與腺病毒 基因組復(fù)制。大約300個(gè)核苷酸的衣殼化區(qū)域位于基因組5'末端緊接著 5'ITR之后。
早期基因分布在分散于腺病毒基因中的4個(gè)區(qū)域中，稱為El-E4 (E表 示早期)。早期區(qū)域包含至少6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，其具有自己的啟動(dòng)子。早期 基因的表達(dá)是自我調(diào)節(jié)的， 一些基因在其他之前表達(dá)。三個(gè)區(qū)域E1,E2和 E4,對(duì)于病毒復(fù)制必不可少。因此，如果腺病毒的一個(gè)或這些功能有缺陷， 意味著其不能產(chǎn)生至少一種這些區(qū)域之一編碼的蛋白，該蛋白將需要反式 供給該病毒。
El早期區(qū)域位于腺病毒基因組5'末端，含有2個(gè)病毒轉(zhuǎn)錄單元，分別 為E1A和E1B。該區(qū)域編碼非常早地參與病毒循環(huán)并對(duì)于腺病毒的幾乎所 有其他基因的表達(dá)必不可少的蛋白。具體地，E1A轉(zhuǎn)錄單元編碼反式激活 其他病毒基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白，包括自E1B,E2A，E2B和E4區(qū)域的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。
Guilhot et al. (Guilhot, C. et al., Oncogene 8 : 619畫24(1993))顯示，Ad5的
E1A的12S蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致鵪鶉細(xì)胞的永生。但是，WO2005042728公開了不可能在ElA基因通過裸露DNA的轉(zhuǎn)染取代逆轉(zhuǎn) 錄病毒轉(zhuǎn)染而導(dǎo)入時(shí)永生化禽細(xì)胞。WO2005042728中還稱:"經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄 病毒感染的極其有效和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生大到足以容納具有自發(fā)基因組改變 的單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞池，所述改變阻斷了在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤失活時(shí)通常誘導(dǎo) 的凋亡."(第10頁)。
逆轉(zhuǎn)錄病毒序列在Guilhot等所得細(xì)胞中的存在阻礙了所述的細(xì)胞在 制備生物產(chǎn)品更具體為治療性化合物中的用途。
發(fā)明人吃驚地發(fā)現(xiàn)禽細(xì)胞具體是番鴨(cm'n'加mosc/iato)細(xì)胞可有效通 過非病毒載體的E1A轉(zhuǎn)染永生化。
為了解決與CEF使用和/或之前可得細(xì)胞系的使用有關(guān)的不同問題，本 發(fā)明提供了包含E1A核酸序列的永生化禽細(xì)胞，所述細(xì)胞通過包括用非病 毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟的方法獲得，^f述載體包含所述ElA核酸序列，并 且其中所述細(xì)胞不包含E1B核酸序列。
本發(fā)明還涉及永生化禽細(xì)胞的方法，包括用非病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞 的步驟，所述載體包含E1A核酸序列，并且所述方法不包括用E1B核酸序 列轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞的步驟。
永生化細(xì)胞，如本發(fā)明所述，指能在培養(yǎng)中生長超過35代的細(xì)胞。
術(shù)語傳代數(shù)指細(xì)胞群體從培養(yǎng)容器中取出并經(jīng)過傳代培養(yǎng)從而使得細(xì) 胞密度足夠低以刺激進(jìn)一步的生長的次數(shù)。
本發(fā)明中所用術(shù)語"一個(gè)"和"一種"指所述的組分或步驟為"至少 一個(gè)"，"至少第一個(gè)"，"一或多個(gè)"或"多個(gè)"，除非另有明確說明。 例如，術(shù)語"一種細(xì)胞"包括多個(gè)細(xì)胞，包括其混合物。
術(shù)語"和/或"在使用時(shí)包括"和"，"或"，以及"所有或任何其他 與該術(shù)語相關(guān)元素的組合"。
本發(fā)明術(shù)語"包含"意圖指所述產(chǎn)品，組合物和方法包括參考的組分 或步驟，但不排除其他。"基本上由…。.,組成"用于限定產(chǎn)品，組合物和 方法時(shí)，表示排除任何必不可少的其他組分或步驟。因此基本上由所述組 分組成的組合物不排除微量污染物以及可藥用載體。"由......組成"表示
排除超過微量的其他組分或步驟。本發(fā)明術(shù)語"E1A核酸序列"指腺病毒E1A區(qū)域的所有基因產(chǎn)物的核 酸序列，包括編碼兩種主要RNA: qS和12S的核酸序列。
術(shù)語"E1A核酸序列"指下述核酸序列，其包含與SEQIDNO:l具有 至少60%氨基酸序列相同性的核酸序列。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，E1A指 這樣的核酸序列，其包含與SEQIDNO:l具有至少70。/。，優(yōu)選至少80%， 更優(yōu)選至少90%核酸序列相同性的核酸序列。更優(yōu)選的實(shí)施方案中，E1A 指核酸序列SEQ IDNO:l。
本發(fā)明術(shù)語"E1B核酸序列"指腺病毒E1B區(qū)域的所有核酸序列，包 括編碼19 kd和55 kd的三種主要多肽的核酸序列。
本發(fā)明術(shù)語"基本相同的核酸序列"指與參比多核苷酸具有足夠相同 性的核酸分子，從而其將在中度嚴(yán)格雜交條件下與參比核苷酸雜交。 一個(gè) 實(shí)施方案中，核酸分子具有與參照核苷酸序列SEQ ID NO:l基本相同核苷 酸序列。
雜交指核酸互補(bǔ)鏈通過氫鍵相互結(jié)合(即有義反義鏈或探針靶
DNA)，所述的氫鍵類似染色體DNA中天然存在的鍵合。雜交給定探針 與耙DNA的嚴(yán)格程度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員輕易確定。
術(shù)語"嚴(yán)格雜交"指使得多聚核酸雜合子穩(wěn)定的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知，雜合子的穩(wěn)定性受雜合子熔解溫度(Tm)的影響。通常，雜合子 穩(wěn)定性是鈉離子濃度和溫度的函數(shù)。通常，雜合反應(yīng)在低嚴(yán)格條件下進(jìn)行， 然后在可變但較高的嚴(yán)格條件下洗滌。雜合嚴(yán)格度也涉及所述洗滌條件。
本發(fā)明術(shù)語"中度嚴(yán)格雜交"指允許革巴-DNA結(jié)合互補(bǔ)核酸的條件，所 述核酸與靶DNA具有大約60%相同性，優(yōu)選大約75%相同性，更優(yōu)選大 約85%相同性，特別優(yōu)選與耙DNA具有大約90。/。相同性。優(yōu)選的高度嚴(yán) 格條件是等同在50%甲酰胺，5*Denhart's溶液，5*SSPE, 0.2% SDS中，在 42° C雜交，然后在0.2*SSPE， 0.2% SDS，在65° C洗滌的條件。
本發(fā)明術(shù)語"非病毒載體"指質(zhì)粒來源的載體，可選所述載體與一或 多種改善轉(zhuǎn)染效率和/或所述載體穩(wěn)定性和/或針對(duì)宿主生物體免疫系統(tǒng)的 對(duì)所述載體的體內(nèi)保護(hù)的物質(zhì)組合。這些物質(zhì)在本領(lǐng)域已知的文獻(xiàn)中廣泛 記載(見例如Feigner et al.， 1987， Proc, West. Pharmacol. Soc。 32， 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al.，1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654)。作為舉例而非限制，它們可以是多聚物，脂質(zhì)，具體是陽離子脂質(zhì)，脂質(zhì)體，核蛋白或中性脂質(zhì)。這些物質(zhì)可單獨(dú)使用或組合使用。所述化合物的例子具體見于專利申請(qǐng)WO 98/08489， WO 98/17693, WO 98/34910, WO 98/37916, WO 98/53853,EP 890362或WO 99/05183。已知的組合例如質(zhì)粒重組載體與陽離子脂質(zhì)(DOGS， DC-CHOL， spermine-chol, spermidine-chol等)和中性脂質(zhì)(DOPE)的組合。
用于本發(fā)明的質(zhì)粒的選擇很廣泛。它們可以是克隆和/或表達(dá)載體。通常，其為本領(lǐng)域已知的并且多數(shù)是可購得的，但可構(gòu)建它們或通過遺傳工程化技術(shù)修飾它們。例如，衍生自pBR322(GibcoBRL),pUC(GibcoBRL),pBluescript (Stratagene)， pREP4， pCEP4 (Invitrogene)或p Poly (Lathe et al"1987, Gene 57， 193-201)的質(zhì)粒。優(yōu)選，本發(fā)明的質(zhì)粒含有保證在制備細(xì)胞和/或宿主細(xì)胞中復(fù)制開始的復(fù)制起點(diǎn)(例如，ColEl起點(diǎn)可根據(jù)意圖在大腸桿菌中制備的質(zhì)粒選擇，并且如果需要在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中自主復(fù)制可選擇oriP/EBNAl系統(tǒng)，Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5,2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815)，其可包含額外的改善其在給定細(xì)胞中的保持和/或穩(wěn)定性的元件(cer sequence which promotes themonomelic maintenance of a plasmid(Summers and Sherrat, 1984， Cell 36,1097-1103， sequences for integration into the cell genome)。
術(shù)語"非病毒載體"排除了病毒載體，諸如例如來自痘病毒(痘苗病毒，具體是MVA，金絲雀痘等)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、甲病毒、泡沫病毒或腺伴隨病毒的載體。
本發(fā)明還涉及衍生自本發(fā)明細(xì)胞的細(xì)胞。術(shù)語"衍生"指從本發(fā)明的細(xì)胞發(fā)展或分化而來或其祖先為本發(fā)明的細(xì)胞的細(xì)胞。
術(shù)語傳代數(shù)指細(xì)胞群體從培養(yǎng)容器中取出并經(jīng)過傳代培養(yǎng)從而使得細(xì)胞密度足夠低以刺激進(jìn)一步的生長的次數(shù)。
本發(fā)明術(shù)語"轉(zhuǎn)染的"是指本發(fā)明細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染"或"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的"指外來核酸序列導(dǎo)入和整合進(jìn)入轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組。術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染物"具有穩(wěn)定整合入基因組DNA的外來DNA的細(xì)胞。
li根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的禽細(xì)胞源自鴨科或雉科的細(xì)胞。
在鴨科中，優(yōu)選番鴨(Cm'W"^或鴨G4"a^。更優(yōu)選，本發(fā)明的細(xì)胞屬于番鴨(CazW"a附asc/wto」或綠頭甲鳥(j"as /7/a(^/jy"c/zay)。
優(yōu)選，本發(fā)明的細(xì)胞取自胚生物體。允許從存活生物體分離細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，使用實(shí)施例2中公開的方法。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，原代細(xì)胞分離自鴨科的輝胎，其為1-20日齡，優(yōu)選5-15日齡，更優(yōu)選11-14日齡。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，E1A核酸序列插入本發(fā)明細(xì)胞的靶DNA序列。
本發(fā)明術(shù)語"靶DNA序列"是細(xì)胞基因組內(nèi)預(yù)先確定的區(qū)域，其被靶向以通過與載體的同源重組進(jìn)行修飾。靶DNA序列包括結(jié)構(gòu)基因(即在真核細(xì)胞的情況下編碼包含內(nèi)含子和外顯子的編碼多肽的DNA序列)，調(diào)節(jié)序列諸如增強(qiáng)子序列，啟動(dòng)子等以及目的基因組中的其他區(qū)域。靶DNA序列也可為在被載體靶向時(shí)對(duì)于宿主基因組功能沒有影響的序列。
術(shù)語"插入耙DNA序列"廣泛指同源重組過程，其導(dǎo)致永生化基因的插入被引入靶DNA序列的缺失或斷裂中。
為了產(chǎn)生E1A核酸序列被插入靶DNA序列中的永生化禽細(xì)胞，本發(fā)明過程中所用載體還可包含兩個(gè)能與耙DNA序列的區(qū)域同源重組的同源序列，其對(duì)于所述細(xì)胞基因組的基因組而言是天然的。
所述同源序列的存在允許本發(fā)明核酸分子通過同源重組位點(diǎn)特異性插入耙DNA序列中。
術(shù)語"同源重組"指兩個(gè)DNA分子在基本相同的核苷酸序列的位點(diǎn)的DNA片段交換。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，載體內(nèi)包含與靶DNA序列中所含許樂部分同源的序列。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)移載體中的同源序列與靶序列的區(qū)域百分之百同源。然而，可使用較低的序列同源性。因此，可使用低如80%的序列同源性。
轉(zhuǎn)移載體中的同源序列包含至少25bp,優(yōu)選更長的區(qū)域，至少500 bp，更優(yōu)選至少5000 bp。
根據(jù)本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施方案，核酸分子被載體中的同源序列包圍。本發(fā)明中"包圍"指同源序列之一位于本發(fā)明核酸分子上游，并且同 源序列之一位于本發(fā)明核酸分子的下游。本發(fā)明中"包圍的"不一定指兩
個(gè)同源序列直接連于永生化基因的3'或5'末端，所述永生化基因和同源序 列可被非限制數(shù)目的核苷酸分離。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇適當(dāng)?shù)耐葱蛄幸詫⑻囟―NA分子定向于待 永生化細(xì)胞的基因組中。例如， 一個(gè)同源序列可與靶向序列的部分同源， 其中另外的同源序列與位于靶序列上游或下游的DNA序列同源。根據(jù)另一 實(shí)例，同源序列之一與靶DNA序列上游的DNA序列同源，其中另外的同 源序列與位于靶DNA下游的DNA序列同源。另一實(shí)例中，兩條同源序列 均與位于耙DNA序列中的序列同源。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，靶DNA序列是HPRT(次黃嘌呤磷酸核 糖轉(zhuǎn)移酶)基因。
包含HPRT啟動(dòng)子和番鴨HPRT基因的基因組序列示于SEQ ID NO:2。 編碼HPRT的序列起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列的位置8695中的ATG 密碼子，該ATG密碼子上游序列是HPRT啟動(dòng)子序列。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能選擇ElA核酸序列整合入HPRT基因所需的同源序 列。在某一科的各個(gè)成員中，編碼HPRT的基因組序列高度同源，本領(lǐng)域 技術(shù)人員也能涉及將HPRT基因靶向每個(gè)禽細(xì)胞所需的同源序列。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，同源序列經(jīng)定制以將E1A核酸序列插 入細(xì)胞HPRT啟動(dòng)子下游。該具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子可操作 連接于細(xì)胞內(nèi)源HPRT啟動(dòng)子。"可操作連接于"指E1A核酸序列以允許 其在細(xì)胞中表達(dá)的方式連接于所述啟動(dòng)子。
根據(jù)該具體的實(shí)施方案，本發(fā)明核酸分子上游的同源序列優(yōu)選具有這 樣的核酸序列，其與起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列的位置1核苷酸、 終止于位置8694的核酸序列的至少500連續(xù)bp更優(yōu)選至少5000連續(xù)bp 同源，前提是所述同源序列不與起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列的位置 8695核苷酸、終止于位置26916的核酸序列同源。此外，該上游同源序列 優(yōu)選直接連接于EIA核酸序列的起始密碼子。根據(jù)本發(fā)明更加優(yōu)選的實(shí)施 方案，本發(fā)明核酸分子上游的同源序列由起始于SEQ ID NO:2所示核酸序 列的位置1核苷酸、終止于位置8694核苷酸的核酸序列組成。位于EIA核酸序列下游的同源序列，優(yōu)選具有與起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列 的位置10580核苷酸、終止于位置18009核苷酸的核酸序列的至少500連 續(xù)bp同源、更優(yōu)選至少5000連續(xù)bp同源的核酸序列。更優(yōu)選，所述位于 ElA核酸序列下游的同源序列由起始于SEQ ID NO:2所示核酸序列的位置 10580核苷酸、終止于位置18009核苷酸的核酸序列組成。
因此，本發(fā)明還涉及包含E1A核酸序列的禽細(xì)胞，所述細(xì)胞通過包括 用包含所述E1A核酸序列的非病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟的方法獲得，其中 所述細(xì)胞不包含EIB核酸序列并且其中所述EIA核酸序列可操作連接于細(xì) 胞內(nèi)源HPRT啟動(dòng)子。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明方法中所用載體包含第一選擇標(biāo)記，其
中哦咯所述第一選擇標(biāo)記是陽性選擇標(biāo)記并且其中所述第一選擇標(biāo)記被包 今沐^沐載汰中的同姬席別句,鬧。沐i玄方而.，屮孤干所沭裁休和所述細(xì)胞
的基因之間的同源重組過程導(dǎo)致E1A核酸序列和第一選擇標(biāo)記的整合。當(dāng)
轉(zhuǎn)移載體是環(huán)狀時(shí)，"包圍的"意指所述第一選擇標(biāo)記和EIA核酸序列位
于載體的相同部分中，所述部分被同源序列限定。
術(shù)語陽性選擇標(biāo)記意指編碼僅能使攜帶所述基因的細(xì)胞存活和/或在 特定條件下生長的產(chǎn)物的基因。常見選擇標(biāo)記編碼賦予抗生素或其他毒素 例如氨芐西林、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素的抗性，互補(bǔ)營養(yǎng)缺陷型缺陷 或提供復(fù)合培養(yǎng)基不能提供的關(guān)鍵營養(yǎng)的蛋白。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中， 第一選擇標(biāo)記編碼賦予抗生素抗性的蛋白。
第一選擇標(biāo)記的整合允許選擇已經(jīng)摻入E1A核酸序列的細(xì)胞。因此， 部分的方法可進(jìn)一步包含這樣的步驟，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)在僅允許包含所 述第一選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中。例如，在包含抗生素的培養(yǎng)基中。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，載體中的第一選擇標(biāo)記被允許其抑制 的序列包圍。所述允許已知第一選擇標(biāo)記的序列不包圍E1A核酸序列。當(dāng) 載體為環(huán)狀是，允許第一選擇標(biāo)記已知的序列，第一選擇標(biāo)記和EIA核酸 序列位于轉(zhuǎn)移載體的相同部分，所述部分通過同源序列限定。
允許核酸序列片段已知的序列是本領(lǐng)域已知的(Nunes-Duby， S. et al (1998) Nucleic Acids Res. 26:391-406)。這些序列可被一或多個(gè)特異性酶識(shí)別，其誘導(dǎo)包含在所述序列之間的核酸的抑制，這些酶稱為"重組酶"。
例如，三種允許核酸片段抑制的已知S組酶是FLP,ISCEl和Cre重組酶。
常見的位點(diǎn)特異性重組酶是Cre重組酶。Cre是噬菌體Pl的cre (環(huán)化 重組)基因的38-kDa產(chǎn)物，并且是Int家族的位點(diǎn)特異性DNA重組酶。 Sternberg, N. et al. (1986) J. Mol. Biol. 187: 197-212。 Cre識(shí)別Pl基因組上的 稱為loxP的34-bp位點(diǎn)(P1的X-over的基因座)并有效催化loxP位點(diǎn)之間 的相互保守DNA重組。loxP位點(diǎn)由兩個(gè)側(cè)接8-bp非重復(fù)核心區(qū)域的13-bp 倒置重復(fù)組成。兩個(gè)直接重復(fù)loxP位點(diǎn)之間的Cre介導(dǎo)的重組導(dǎo)致它們中 間的DNA作為共價(jià)閉合環(huán)被切除。方向倒置的loxP位點(diǎn)對(duì)之間的Cre-介 導(dǎo)的重組將導(dǎo)致插入DNA的倒轉(zhuǎn)而非切除。DNA的斷裂和連接限制于核 心區(qū)域中的離散位置并且與通過酶的瞬時(shí)磷酸酪氨酸DNA-蛋白連接每次 同時(shí)發(fā)生而進(jìn)行下去。
另一種位點(diǎn)特異性重組酶是I-SceI。其他內(nèi)含子歸巢內(nèi)切核酸酶，例如 I-Tlil， I-Ceul, I-Crel， I-Ppol和PI-PspI,也可替代本發(fā)明方法中的I-Scel。許 多在Belfort and Roberts ((1997) Nucleic Acids Research 25:3379-3388)中列 出。這些內(nèi)切核酸酶中的許多源自細(xì)胞器基因組，其中密碼子使用與標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)胞核密碼子使用不同。為使用所述基因從而對(duì)其內(nèi)切核酸酶進(jìn)行細(xì)胞核 表達(dá)，可能需要改變編碼序列來匹配細(xì)胞核基因的編碼序列。I-Scel是雙鏈 內(nèi)切核酸酶，其在DNA識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行切割。I-Scel產(chǎn)生4 bp交錯(cuò)切割物， 其具有3'OH突出端。
酶I-Scel具有已知的識(shí)別位點(diǎn)。I-Scel的識(shí)別位點(diǎn)是非對(duì)稱序列，長度 超過18 bp。
5' TAGGGATAACAGGGTAAT3'
3' ATCCCTATTGTCCCATTA5'
另一位點(diǎn)特異性重組酶是FLP重組酶。Flp重組酶識(shí)別獨(dú)特的34-bp 最小位點(diǎn)，其僅僅耐受其識(shí)別序列的有限簡并(Jayaram, 1985; Senecoff et al., 1988)。已經(jīng)檢測了Flp重組酶和FRT序列之間的相互作用(Panigrahi et al.， 1992)。變體FRT序列的實(shí)例見于Jayaram (1985) and Senecoff etal. (1988), 不同基質(zhì)上Flp介導(dǎo)的重組的測定見于Sna他etal. (1996)。因此，本發(fā)明的方法還可包括抑制來自所述原代細(xì)胞基因組的第一選 擇標(biāo)記的步驟。為了已知所述第一選擇標(biāo)記，用編碼允許抑制所述第一選 擇標(biāo)記的序列的特異性重組酶的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。能將所述基因轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)
胞的方法和載體是本領(lǐng)域己知的，例如，本發(fā)明實(shí)施例4中公開的方法可 使用。之前描述的載體也可使用。
根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，用于該方法的載體包含第二選擇標(biāo)記，其不被所 述同源序列包圍，其中所述第二選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記。所述第二選擇 標(biāo)記在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的載體是環(huán)形時(shí)尤其有用。所述第二選擇 標(biāo)記的存在允許破壞細(xì)胞，其中同源重組過程導(dǎo)致轉(zhuǎn)移載體中不包含E1A 核酸序列的部分的引入。當(dāng)所述載體是環(huán)形時(shí)，第二選擇載體不被所述同 源序列包圍的事實(shí)意味著所述第二選擇載體和E1A核酸序列不位于所述轉(zhuǎn) 移載體的相同部分中，所述部分被所述同源序列所限定。
因此，本發(fā)明的方法還可包含其中將細(xì)胞培養(yǎng)在僅允許不包含所述第 二選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中的步驟。所述步驟可與將所述原代細(xì)胞 培養(yǎng)在僅允許包含所述第一選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中的步驟同時(shí)或 分開進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述載體包含第三選擇標(biāo)記，其中 所述第三選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記并且其中所述第三選擇標(biāo)記位于允許抑 制所述第一選擇標(biāo)記的序列之間。這表明抑制第一選擇標(biāo)記的步驟將也導(dǎo) 致抑制第三選擇標(biāo)記。第三選擇標(biāo)記的存在允許破壞其中存在第一選擇標(biāo) 記的細(xì)胞。當(dāng)載體是環(huán)形時(shí)，第三選擇標(biāo)記位于允許抑制第一選擇標(biāo)記的 序列之間的事實(shí)意味著所述第三選擇標(biāo)記和第一選擇標(biāo)記位于轉(zhuǎn)移載體的 相同部分，所述部分通過允許抑制第一選擇標(biāo)記的序列限定。
本發(fā)明術(shù)語陰性選擇標(biāo)記意指編碼在一定條件下殺死攜帶該基因的細(xì) 胞的產(chǎn)物的基因。這些基因包含"自殺基因"。這些基因編碼的產(chǎn)物能轉(zhuǎn)
化細(xì)胞毒化合物中的前藥。多種自殺基因/前藥對(duì)是目前已知的。具體如下
-I型單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-1 TK)和阿昔洛韋或更昔洛韋(GCV) (Camso et al., 1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al.， 1997， Nat. Med. 3, 1354-1361);
16-細(xì)胞色素p450和環(huán)磷酰胺(Wei et al.， 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978);
-大腸桿菌(E. coli)嘌呤核苷酸磷酸化酶和6-甲基嘌呤脫氧核糖核苷 (Sorscher et al., 1994， Gene Therapy 1， 233-238);
-大腸桿菌鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和6-硫代黃嘌呤(Mzoz and Moolten， 1993, Human Gene Therapy 4， 589-595)和
-胞嘧啶脫氨酶(CDase)和5-氟胞嘧啶(5FC);
-FCU1和5-氟胞嘧啶(5FC)(W09954481);
-FCU1-8和5-氟胞嘧啶(5FC) (WO2005007857)。
所述第三選擇標(biāo)記允許選擇其中發(fā)生第一選擇標(biāo)記抑制的細(xì)胞。因此， 本發(fā)明的方法還可包含將所述細(xì)胞培養(yǎng)在不允許包含第三選擇標(biāo)記的細(xì)胞 生長的培養(yǎng)基中的步驟。例如，不允許包含作為第三選擇標(biāo)記的FCU1的 細(xì)胞生長的培養(yǎng)基包含5-氟胞嘧啶。
所述第一、第二和第三選擇標(biāo)記可分開使用。例如用于本發(fā)明方法中 的載體可包含所述第一和第三選擇標(biāo)記但不包含第二選擇標(biāo)記，或包含第 二和第三選擇標(biāo)記但不包含第一選擇標(biāo)記。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，E1A核酸序列，第一、第二和/或第三選 擇標(biāo)記在它們的表達(dá)在細(xì)胞中永生化所需的元件的控制下。
表達(dá)所需的元件由一組允許核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為RNA以及mRNA翻譯 成多肽的元件組成，具體是在所述細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子序列和/或調(diào)節(jié)序 列，可選允許分泌到所述多肽的靶細(xì)胞表面或在所述表面表達(dá)的序列。這 些元件可調(diào)節(jié)或?yàn)闃?gòu)成型的。當(dāng)然，所述啟動(dòng)子經(jīng)改造適合選定的載體和 宿主細(xì)胞。例如，下述基因的真核啟動(dòng)子PGK(PhosphoGlycerate Kinase), MT (metallothionein; Mclvor et al" 1987， Mol. Cell Biol. 7， 838-848), oc-l抗胰 蛋白酶，CFTR,下述物質(zhì)的啟動(dòng)子編碼肌肉肌酸激酶的基因，肌動(dòng)蛋白肺 表面活性劑，免疫球蛋白或p-肌動(dòng)蛋白(Tabin et al.， 1982， Mol. Cell Biol. 2， 416-436), SRoc (Takebe et al,, 1988, Mol. Cell. 8， 466-472)， SV40病毒(猿猴病 毒)早期啟動(dòng)子，RSV (勞斯肉瘤病毒)LTR， MPSV啟動(dòng)子，TK-HSV-1啟動(dòng) 子，CMV病毒(巨細(xì)胞病毒)早期啟動(dòng)子。巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子尤其 優(yōu)選。
17本發(fā)明更具體涉及，但不限于永生化細(xì)胞的方法，包括以下步驟 - 將載體轉(zhuǎn)移入禽細(xì)胞中，其中所述載體包含
■ 同源序列包圍的ElA核酸序列，
■ 第一選擇標(biāo)記，其中所述第一選擇標(biāo)記是陽性選擇標(biāo) 記且其中所述第一選擇標(biāo)記被所述同源序列包圍，
■ 允許抑制所述第一選擇標(biāo)記的序列，
■ 第二選擇標(biāo)記，其不被所述同源序列包圍，其中所述選 擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記， .
■ 第三選擇標(biāo)記，其中所述第三選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo) 記和其中所述第三選擇標(biāo)記位于允許抑制所述第一選擇標(biāo)記的序列之 間，
-在僅允許包含第一選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，
-在不允許包含第二選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，
-將所述第一選擇標(biāo)記從所述細(xì)胞的基因組去除，
-在不允許包含第三選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞還可包含允許缺陷病毒增殖的一或多個(gè)核酸序列。"缺 陷病毒"指其中一或多個(gè)復(fù)制必須的病毒基因被缺失或被無功能化的病毒。 術(shù)語"允許缺陷病毒增殖的核酸序列"指反式提供允許缺陷病毒復(fù)制的功 能的核酸序列。換言之，所述核酸序列編碼所述缺陷病毒復(fù)制和衣殼化所 需的蛋白。 '
本發(fā)明的細(xì)胞還可包含編碼目的物質(zhì)的核酸序列。本發(fā)明中目的物質(zhì) 可包括但不限于藥物活性蛋白，例如生長因子，生長調(diào)節(jié)子，抗體，抗原， 其用于免疫或接種的衍生物等，白介素，胰島氣G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF， M-CSF或其組合，干擾素，例如干擾素-(x,干擾素-卩，干擾素-Y，凝血因子， 例如因子VIII,因子IX,或tPA或其組合。"目的物質(zhì)"也指工業(yè)用酶， 例如用于紙漿和紙，紡織品改性，或乙醇制備。最后"目的物質(zhì)"還指蛋 白補(bǔ)充劑或動(dòng)物飼料的增值(value-added)產(chǎn)品。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的細(xì)胞還包含編碼重組端粒酶逆 轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列，更優(yōu)選，所述重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶描述于EP 06 36 0047。2。 EP 06 36 0047.2描述的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)2具有至少70%， 更優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%核酸序歹1|相同性。EP 06 36 0047.2中優(yōu) 選編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列是EP 06 36 0047.2的SEQ ID NO:2。 EP 06 36 0047.2中的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酸序列SEQ ID NO:2對(duì)應(yīng)本發(fā)明的 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酸序列SEQIDNO:3。因此，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方 案，本發(fā)明的細(xì)胞也包含編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列，更優(yōu)選編 碼與SEQ ID NO:3具有至少70%，更優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%核酸 序列相同性的重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列。更優(yōu)選，編碼重組端粒酶逆 轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列是SEQ ID NO:3 (dTERT)。
本發(fā)明的方法獲得的細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)胞和衍生自所述細(xì)胞的細(xì)胞可 用于病毒復(fù)制。所述病毒可為活、減毒、重組或非重組的病毒。更優(yōu)選， 所述細(xì)胞尤其可用于痘病毒(痘苗病毒，具體是MVA，金絲雀痘病毒等)， 腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，皰疹病毒，甲病毒，泡沫病毒或腺伴隨病毒的復(fù)制。
逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染性質(zhì)，在大多數(shù)情況下整合進(jìn)入分裂中的細(xì)胞， 并且在該方面尤其適合用于癌癥相關(guān)用途。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒通常包含LTR 序列，衣殼化區(qū)和本發(fā)明的核苷酸序列，其位于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR或內(nèi)部啟 動(dòng)子諸如下述那些的控制之下。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可包含修飾，具體在 LTR(用真核啟動(dòng)子取代啟動(dòng)子區(qū)域)或衣殼化區(qū)(用異源衣殼化區(qū)域取代， 例如VL30型)中(見法國申請(qǐng)94 08300和97 05203)。
腺病毒載體可缺乏所有或部分復(fù)制必需的至少一個(gè)區(qū)域，其選自El, E2,E4和L1L5區(qū)。El區(qū)的缺失是優(yōu)選的。然而，其可與其他修飾/缺失組 合，具體是所有或部分E2， E4禾卩/或L1 L5區(qū)。例如，El區(qū)的主要部分和 E4轉(zhuǎn)錄單元的缺失非常有利。為了增加克隆能力，腺病毒載體還可缺失所 有或部分非必需E3區(qū)。根據(jù)另一方案，可使用最小腺病毒載體，其保持衣 殼化必需的序列，即5'和3'ITR(反向末端重復(fù))，和衣殼化區(qū)。各種腺病毒 載體，以及制備它們的方法，是已知的(見例如，Graham and Prevect， 1991， in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p 109 128; Ed: E. J. Murey， The Human Press Inc)。
痘病毒科包含Chord(Dpoxvirus和昆蟲痘病毒亞科的病毒。其中，本發(fā) 明的痘病毒優(yōu)選選自以下病毒組成的組正痘病毒，副痘病毒，雞痘病毒，駱鴕痘病毒(capripoxviruses)，兔痘病毒，豬痘病毒(Suipoxviruses),軟疣 痘病毒(Molluscipoxviruses)，亞塔痘病毒(Yatapoxviruses)。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí) 施方案，本發(fā)明的痘病毒是正痘病毒。
正痘病毒優(yōu)選是痘苗病毒并且優(yōu)選是修飾的痘苗病毒安卡拉株 (MVA)，具體是MVA 575 (ECACC V00120707)和MVA-BN (ECACC V00083008)。
術(shù)語"重組病毒"指其基因組中包含插入的外源序列的病毒。本發(fā)明中， 外源序列指不天然存在親代病毒中的核酸。
一個(gè)實(shí)施方案中，外源序列編碼具有直接或間接細(xì)胞毒性功能的分子。 "直接或間接"細(xì)胞毒性意指外源序列編碼的分子自身可具有毒性(例如 蓖麻蛋白，腫瘤壞死因子，白介素-2,干擾素-gamma,核糖核酸酶，脫氧核 糖核酸酶，假單胞菌外毒素A)或其可被代謝形成毒性產(chǎn)物，或其可作用于 其他物質(zhì)形成毒性產(chǎn)物。蓖麻蛋白cDNA序列公開于Lamb et al (Eur. J. Biochem., 1985, 148,265-270)，包含在內(nèi)作為參考。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，外源序列是自殺基因。自殺基因編碼 能將相對(duì)無毒的前藥轉(zhuǎn)化為毒性藥物的蛋白。例如，胞嘧啶脫氨酶將5-氟 胞嘧啶(5FC)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶(5FU)(Mullen et al (1922) PNAS 89， 33);單 純皰疹胸苷激酶使得細(xì)胞對(duì)利用抗病毒劑更昔洛韋(GCV)或阿昔洛韋的治 療敏感(Moolten (1986) Cancer Res. 46, 5276; Ezzedine et al (1991) New Biol 3, 608)。任何生物體例如大腸桿菌或釀酒酵母的胞嘧啶脫氨酶可使用。
因此，本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因編碼具有胞嘧啶脫氨酶活 性的蛋白，更優(yōu)選專利申請(qǐng)WO2005007857和W09954481所述的蛋白。
另一實(shí)施方案中，所述外源基因編碼能裂解靶向RNA或DNA的核酶。 待裂解的耙向RNA或DNA可為對(duì)于細(xì)胞功能必不可少的RNA或DNA并 且其裂解導(dǎo)致細(xì)胞死亡，或待裂解RNA或DNA可為編碼不需要的蛋白的 RNA或DNA，例如癌基因產(chǎn)物，該RNA或DNA的裂解可防止細(xì)胞癌變。
另一實(shí)施方案中，外源基因編碼反義RNA。
"反義RNA"意指這樣的RNA分子，其與與編碼蛋白的mRNA分子 雜交并干擾自所述mRNA分子的表達(dá)，或者其與細(xì)胞內(nèi)的其他RNA分子 諸如前-mRNA或tRNA或rRNA雜交，或與基因雜交并干擾其表達(dá)。
20本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，外源序列取代靶細(xì)胞中缺陷基因的功能。 哺乳動(dòng)物包括人有數(shù)千種遺傳基因病，其由缺陷基因?qū)е?。所述基因疾?br> 的實(shí)例包括囊性纖維化，其已知存在《FTR基因中的突變；Duchenne肌營 養(yǎng)不良癥，其已知在肌營養(yǎng)不良蛋白基因中存在突變；鐮狀細(xì)胞病，其已知 存在HbA基因中的突變。許多類型的癌癥由缺陷基因?qū)е?，具體是原癌基 因，以及經(jīng)歷突變的腫瘤抑制基因。
原癌基因的實(shí)例是ras， src, bcl等；腫瘤抑制基因的實(shí)例是p53和Rb。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，外源序列編碼腫瘤相關(guān)抗原(TAA)。 TAA 指以在腫瘤細(xì)胞中檢出的頻率或密度高于相同組織類型的非腫瘤細(xì)胞中的 情況的分子。TAA的實(shí)例包括但不限于CEA, MART-l, MAGE-1， MAGE-3, GP-100， MUC-l, MUC-2，點(diǎn)突變的ras癌基因，正?；螯c(diǎn)突變的p53,過表 達(dá)的p53, CA-125, PSA， C-erb/B2, BRCA I, BRCA II， PSMA，酪氨酸酶， TRP-l, TRP畫2， NY-ESO-l, TAG72, KSA, HER-2/neu， bcr-abl， pax3-fkhr, ews-fli-l， surviving和LRP。更優(yōu)選的實(shí)施方案中TAA是MUC1 。
重組病毒可包含超過一個(gè)外源序列，每個(gè)外源序列可編碼超過一個(gè)分 子。例如，可在相同的重組痘病毒中將編碼TAA的外源序列與編碼細(xì)胞因 子的外源序列相連。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所述外源基因編碼抗原。"抗原"在這里指 可與抗體結(jié)合的配體；抗原本身不必是免疫原性的。
優(yōu)選抗原來自病毒諸如HIV-1，(諸如gp 120或gp 160),貓免疫缺陷病 毒、人或動(dòng)物皰疹病毒中任一種，諸如gD或其衍生物或立即早期蛋白諸如 ICP27,其來自HSV1或HSV2,巨細(xì)胞病毒(諸如gB或其衍生物)，水痘帶 狀皰疹病毒(諸如gpl, II或III),或來自肝炎病毒諸如乙型肝炎病毒例如乙 型肝炎表面抗原或其衍生物，甲型肝炎病毒，丙型肝炎病毒(優(yōu)選來自基 因型lb株ja的非結(jié)構(gòu)蛋白)和戊型肝炎病毒，或來自其他病毒致病原，諸 如呼吸道合胞病毒，人乳頭瘤病毒(優(yōu)選HPV16株的E6和E7蛋白)或流感 病毒，或來自細(xì)菌致病原諸如沙門菌，奈瑟球菌，疏螺旋體(例如OspA或 OspB或其衍生物)，或衣原體，或博德特菌例如P.69,PT和FHA，或來自寄 生蟲諸如瘧原蟲或弓形蟲。


圖1:包含編碼E1A核酸序列的基因的載體。圖2:E1A核酸序列向HPRT基因中的位點(diǎn)特異性插入的圖示。 圖3:從本發(fā)明方法獲得的永生化細(xì)胞的基因組去除第一和第三選擇 標(biāo)記的圖示。
圖4:包含編碼番鴨端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因和E1A核酸序列的基因的載體。
實(shí)施例
實(shí)施例1:建立包含E1A核酸序列的永生化禽細(xì)胞系
A. 質(zhì)粒構(gòu)建體
A-l.用于隨機(jī)插入的質(zhì)粒構(gòu)建體
A與番鴨基因組無共同特定同源序列的質(zhì)粒(質(zhì)粒E1A)被用于該目的 (圖1).
A-2.用于靶向插入的質(zhì)粒構(gòu)建體
A構(gòu)建質(zhì)粒，其包含包圍E1A核酸序列(SEQ ID NO:l)的與番鴨 HPRT基因同源的兩個(gè)5kb片段和兩個(gè)選擇標(biāo)記。編碼次黃嘌呤鳥嘌呤磷 酸轉(zhuǎn)移酶的HPRT基因被選擇作為組成型表達(dá)E1A核酸序列的合適位點(diǎn)。
所述兩個(gè)選擇標(biāo)記是CMV啟動(dòng)子(Thomsen et al. P.N.A.S. 1984, 81. 3:659-63)控制下的FCU1基因(Erbs et'al, Cancer Res, 2000. 15. 60, :3813-22) 和SV40啟動(dòng)子控制下的新霉素(或嘌呤霉素)抗性基因。新霉素(或嘌呤霉 素)抗性和FCU-1表達(dá)盒被Scel裂解位點(diǎn)包圍，其允許選擇盒從最終細(xì)胞 系的去除。HPRT基因臂之外插入了編碼RSV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HSVTK的選 擇標(biāo)記(圖2)。
B. 從番鴨卵制備CEC批次和亞群的描述
B.l從12日齡番鴨卵制備CEC批次和亞群的描述
25個(gè)受精SPF卵保溫在37.5°C。卵在根據(jù)已知方案保溫12日后打開。
將23個(gè)胚胎切碎，在磷酸緩沖鹽水-Dulbecco(PBS)中洗滌一次，在 TrypLE Select (Invitrogen)中室溫解離5小時(shí)。
低速離心之后，細(xì)胞重懸于基礎(chǔ)Eagle培養(yǎng)基(MBE)，其中補(bǔ)充有10% 胎牛血清(FCS)，慶大霉素0.04g/L,在500cm2triple瓶中接種，37。C5Q/oC02 下保溫。 '24h后，匯合細(xì)胞利用TrypLE Select (5mL/triple瓶)從瓶中取出，部分 細(xì)胞再接種于175ci^瓶中二次傳代。余下細(xì)胞在1(^細(xì)胞/mL在適宜培養(yǎng) 基中濃縮(60。/。BME， 30%FCS禾Q 10%DMSO)，在異丙基醇調(diào)節(jié)的容器 (NALGENE. . "Mr. Frosty" 1。C frezing. Container)中在-80。C冷凍，然后轉(zhuǎn) 移到液氮中長期儲(chǔ)存，形成初始細(xì)胞庫(50x1，5.107細(xì)胞/瓶，44x1.107細(xì)胞/ 瓶)。
培養(yǎng)中保存的細(xì)胞常規(guī)傳代到第18代，前3代中非結(jié)合細(xì)胞通過低速 離心調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基收集，再接種并以相同方式作為初始培養(yǎng)物再傳代。
顯示特征性不同形態(tài)學(xué)特征的亞群在培養(yǎng)基壽命中重復(fù)分離。
B.2.從19日齡番鴨卵制備CEC批次和亞群的描述
得自AFFSSA Ploufragan的29個(gè)受精SPF番鴨卵在潮濕環(huán)境下保溫在 37.5。C。
19日后打開卵并無菌取出胚胎。20個(gè)胚胎經(jīng)去頭、去肢體處理并且肝 用于其他細(xì)胞制備。胚胎軀干部分被切碎，在PBS Dulbecco (Sigma, R6f. D8537, Lot 46K2428)中洗滌一次，在500mL TrypLE Select (Gibco, R6f. 12563, Lots 1319986 and 1339844)中37。C解離2小時(shí)。
5分鐘2000 rpm離心后，細(xì)胞重懸于BME (Basal Medium Eagle, Gibco， R6f。 41010， Lot 8270)，其中補(bǔ)充有10。/。胎牛血清(JRH， Rif. 12003-1OOOM， Lot. 5A0102，CodeTGP4001Q)，慶大霉素0.04 g/L和L-谷氨酰胺4mM。終 體積1.5L (1.9.106細(xì)胞/mL)懸液接種在10個(gè)triple瓶(500cm勺中并在37。C 5%(302保溫。
24h后，匯合細(xì)胞利用TrypLE Select (5mL/triple瓶)從瓶中取出。細(xì)胞 經(jīng)計(jì)數(shù)，在2000 rpm離心4-5分鐘。沉淀物以5.106或107細(xì)胞/mL在適宜 培養(yǎng)基(60。/。BME, 30%FCS和10% DMSO)中濃縮。懸液充滿cryovials (Nunc) 并在-80。C冷凍，同時(shí)在-20。C進(jìn)行2h的步驟，然后轉(zhuǎn)移到液氮中長期儲(chǔ) 存，形成CETC19pl初始細(xì)胞庫(l 10 cryovials, 107細(xì)胞/瓶)(鴨軀干胚細(xì)胞， 19日齡胚胎，第l代)。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，從番鴨卵制備CEC批次根據(jù)備選方案B.2. 進(jìn)行(從19日齡番鴨卵)。
C轉(zhuǎn)染方法
23大量轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域已知的，其引入能指導(dǎo)目的核苷酸序列的表達(dá)
的載體。這些方法的非限制性舉例如下CaP04沉淀，電穿孔，lipofectin轉(zhuǎn) 染發(fā)。給出的實(shí)例基于CaP04沉淀法。
細(xì)胞為大約80-50%匯合。培養(yǎng)基在加入CaP04/DNA之前每2小時(shí)更 換。30 |ig DNA重懸于31 pl2M CaCl2 - 161.3 mM Tris pH 7.6。加入H20使 得終體積為0.5 ml。
隨后，2個(gè)供選方案
a) 每次轉(zhuǎn)染，將0.5 ml 2X HEBS分散在15 ml無菌Falcon管中，將 DNA溶液逐滴加入同時(shí)溫和渦旋或氣泡使得DNA溶液分散開。溶液變?yōu)?乳狀?；旌衔镌谑覝乇３?0-30分鐘。在組織培養(yǎng)箱中用無菌移液管吸取 并放回液體一次從而破壞薄片狀物，逐滴施加于細(xì)胞。細(xì)胞隨后在37。C保 溫6小室到過夜。細(xì)微的沉淀物會(huì)覆蓋細(xì)胞表面。為了完成轉(zhuǎn)染，將甘油 休克溶液升溫至37。C。培養(yǎng)基被吸出，加入5 mlBME洗滌細(xì)胞層，隨后 吸出培養(yǎng)基，加入l ml甘油休克溶液2分鐘或更短。隨后輕柔加入10ml BME稀釋甘油，完全去除BME-甘油。隨后加入IO ml所需培養(yǎng)基，在適 宜溫度保溫板。
或
b) 每次轉(zhuǎn)染，將0.5 ml 2X HEBS分散在15 ml無菌Falcon管中，將
DNA溶液逐滴加入同時(shí)溫和渦旋或氣泡使得DNA溶液分散開。溶液變?yōu)?乳狀?；旌衔镌谑覝乇３?0-30分鐘。在組織培養(yǎng)箱中用無菌移液管吸取 并放回液體一次從而破壞薄片狀物，'逐滴施加于細(xì)胞。細(xì)微的沉淀物會(huì)覆 蓋細(xì)胞表面。細(xì)胞隨后在37。C保溫6小室到過夜。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染(CaP04沉淀)根據(jù)方案b)進(jìn)行。
D。選擇方法
D-L選擇隨機(jī)插入的方法
轉(zhuǎn)染后施加選擇壓力48-72小時(shí)細(xì)胞用TrypLE select解離，低速離 心并再接種于BME，其具有FCS 10%禾卩G418 800嗎/mL,優(yōu)選500jig/mL (并任選更昔洛韋25嗎/mL，優(yōu)選10嗎/mL)。
細(xì)胞連續(xù)傳代指導(dǎo)單獨(dú)生長的克隆可被分離。 D-2.選擇靶向插入的方法轉(zhuǎn)染后施加選擇壓力48-72小時(shí)細(xì)胞用TrypLE select解離，低速離 心并再接種于BME，其具有FCS 10% ，更昔洛韋25pg/mL，優(yōu)選10嗎/mL; 和G418 800嗎/mL，優(yōu)選500pg/mL (或嘌呤霉素0.5|ig/mL)。
細(xì)胞連續(xù)傳代指導(dǎo)單獨(dú)生長的克隆可被分離。
細(xì)胞克隆隨后用大范圍核酸酶I-Scel表達(dá)質(zhì)粒根據(jù)下述方法轉(zhuǎn)染。
為了消除選擇標(biāo)記，轉(zhuǎn)染后施加5-氟胞嘧啶(5-FC)48小時(shí)細(xì)胞用 TrypLE select解離，低速離心并再接種于具有1(T3-1(T7M的5-FC的培養(yǎng)基 中，并保持G418 (或嘌呤霉素)/更昔洛韋選擇(BME with FCS 10%; 5-FC更 昔洛韋25pg/mL,優(yōu)選10pg/mL;和G418 800jig/mL,優(yōu)選500pg/mL (或嘌 呤霉素0.5^g/mL)(圖3)。
實(shí)施例2:建立包含E1A核酸序列和重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核酸序列的 永生化禽細(xì)胞系
A. 質(zhì)粒構(gòu)建體.
A-l.用于隨機(jī)插入的質(zhì)粒構(gòu)建體
A與番鴨基因組無共同特定同源序列的質(zhì)粒被用于該目的 A-2.用于靶向插入的質(zhì)粒構(gòu)建體
A構(gòu)建質(zhì)粒(質(zhì)粒dTERT-ElA)，其包含包圍端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(SEQ ID N0:3)的與番鴨HPRT基因同源的兩個(gè)5kb片段，E1A核酸序列(SEQ ID N0:1)和兩個(gè)選擇標(biāo)記。編碼次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶的HPRT基因被選 擇作為組成型表達(dá)EIA核酸序列的合適位點(diǎn)。
所述兩個(gè)選擇標(biāo)記是CMV啟動(dòng)子(Thomsen et al. P.N.A.S. 1984, 81. 3:659-63)控制下的FCU1基因(Erbs et.al. Cancer Res. 2000. 15. 60, :3813-22) 和SV40啟動(dòng)子控制下的新霉素(或嘌呤霉素)抗性基因。嘌呤霉素抗性和 FCU-1表達(dá)盒被Seel裂解位點(diǎn)包圍，其允許選擇盒從最終細(xì)胞系的去除。 HPRT基因臂之外插入了編碼RSV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HSVTK的選擇標(biāo)記(圖4)。
B. 從19日齡番鴨卵制備CEC批次和亞群的描述
得自AFFSSA Ploufragan的29個(gè)受精SPF番鴨卵在潮濕環(huán)境下保溫在 37.5。C。19日后打開卵并無菌取出胚胎。20個(gè)胚胎經(jīng)去頭、去肢體處理并且肝 用于其他細(xì)胞制備。胚胎軀干部分被切碎，在PBS Dulbecco (Sigma， R6f. D8537， Lot 46K2428)中洗滌一次，在500mL TrypLE Select (Gibco， R6f. 12563， Lots 1319986 and 1339844)中37°C解離2小時(shí)。
5分鐘2000 rpm離心后，細(xì)胞重懸于BME (Basal Medium Eagle, Gibco, Rif. 41010， Lot 8270)，其中補(bǔ)充有10。/。胎牛血清(JRH, R6f. 12003-1000M, Lot. 5A0102，CodeTGP4001Q),慶大霉素0.04 g/L和L-谷氨酰胺4mM。終 體積1.5L (1.9.106細(xì)胞/mL)懸液接種在10個(gè)triple瓶(500cm勺中并在37°C 5%(:02保溫。
24h后，匯合細(xì)胞利用TrypLE Select (5mL/triple瓶)從瓶中取出。細(xì)胞 經(jīng)計(jì)數(shù)，在2000 rpm離心4-5分鐘。沉淀物以5.106或107細(xì)胞/mL在適宜 培養(yǎng)基(60。/。BME, 30%FCS和10% DMSO)中濃縮。懸液充滿cryovials (Nunc) 并在-80。C冷凍，同時(shí)在-20。C進(jìn)行2h的步驟，然后轉(zhuǎn)移到液氮中長期儲(chǔ) 存，形成CETC19pl初始細(xì)胞庫(110'cryovials， 107細(xì)胞/瓶)(鴨軀干胚細(xì)胞， 19日齡胚胎，第l代)。
C. 轉(zhuǎn)染方法
大量轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域已知的，其引入能指導(dǎo)目的核苷酸序列的表達(dá) 的載體。這些方法的非限制性舉例如下CaP04沉淀，電穿孔,lipofectin轉(zhuǎn) 染發(fā)。給出的實(shí)例基于電穿孔。
轉(zhuǎn)染禾U用Amaxa，s Nucleofector裝置禾卩Basic Fibroblast kit (Amaxa， Cat NO VPI-1002)進(jìn)行。細(xì)胞在700rpm (100g)離心10分鐘，重懸于Basic Nucleofector溶液(100(iL per 106cells); 100pL懸液與3-6pg DNA混合并轉(zhuǎn)移 到置于Nucleofector(U-12program)中的樣品池中。電穿孔后，樣品轉(zhuǎn)移到 6cm培養(yǎng)皿，充滿5 mL培養(yǎng)基，在37°C/ 5%C02保溫箱中重平衡。在37°C 5%C02下保溫過夜后，更新培養(yǎng)基繼續(xù)保溫。
D. 選擇方法
D-l.選擇隨機(jī)插入的方法轉(zhuǎn)染后施加選擇壓力48-72小時(shí)細(xì)胞用TrypLE select解離，低速離 心并再接種于BME，其具有FCS 10%;更昔洛韋25pg/mL，優(yōu)選10ng/mL 和G418 800|ig/mL，優(yōu)選500jag/mL。
細(xì)胞連續(xù)傳代指導(dǎo)單獨(dú)生長的克，隆可被分離。
D-2.選擇靶向插入的方法
轉(zhuǎn)染后施加選擇壓力48-72小時(shí)細(xì)胞用TrypLE select解離，低速離 心并再接種于BME，其具有FCS 10% ，更昔洛韋25pg/mL，優(yōu)選lOpg/mL; 和嘌呤霉素0.5|ig/mL。
細(xì)胞連續(xù)傳代指導(dǎo)單獨(dú)生長的克隆可被分離。
細(xì)胞克隆隨后用大范圍核酸酶I-Scel表達(dá)質(zhì)粒根據(jù)下述方法轉(zhuǎn)染。
為了消除選擇標(biāo)記，轉(zhuǎn)染后施加5-氟胞嘧啶(5-FC)48小時(shí)細(xì)胞用 TrypLE select解離，低速離心并再接種具有1(T3-10—7M的5-FC的培養(yǎng)基中， 并保持嘌呤霉素/更昔洛韋選擇(BME，具有FCS 10%; 5-FC更昔洛韋 25jig/mL,優(yōu)選10嗎/mL;和嘌呤霉素0.5ng/mL)。參考文獻(xiàn)
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Thomsen et al, P.N.A.S. 1984. 81. 3:659-6權(quán)利要求
1.包含E1A核酸序列的永生化禽細(xì)胞，其特征在于所述細(xì)胞通過包含用含有所述E1A核酸序列的非病毒載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞的步驟的方法獲得，并且其中所述細(xì)胞不包含E1B核酸序列。
2. 權(quán)利要求1的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列被插入所述禽 細(xì)胞的HPRT基因。
3. 權(quán)利要求2的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列可操作連接于 所述細(xì)胞的內(nèi)源HPRT啟動(dòng)子。
4. 權(quán)利要求1-3之一的永生化細(xì)胞，其中所述細(xì)胞源自屬于鴨科的動(dòng)物。
5. 權(quán)利要求4的永生化細(xì)胞，其中所述動(dòng)物屬于番鴨種。
6. 權(quán)利要求4的永生化細(xì)胞，其中所述動(dòng)物屬于綠頭鴨種。
7. 權(quán)利要求1-6之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列與SEQ IDNO:l具有至少60%核酸序列相同性。
8. 權(quán)利要求1-6之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列與SEQ IDNO:l具有至少70%核酸序列相同性。
9. 權(quán)利要求1-8之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列與SEQ IDNO:l具有至少80%核酸序列相同性。
10. 權(quán)利要求1-6之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列與SEQ IDNO:l具有至少90%核酸序列相同性。
11. 權(quán)利要求l-6之一的永生化細(xì)胞，其中所述E1A核酸序列為SEQ ID NO:l。
12. 權(quán)利要求l-ll之一的永生化細(xì)胞，其中其還包含編碼重組端粒酶 逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列。
13. 權(quán)利要求12的永生化細(xì)胞，其中所述編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 的核酸序列與SEQ ID NO:3具有至少70%,更優(yōu)選至少90%,和更優(yōu)選至 少95%核酸序列相同性。
14. 權(quán)利要求12的永生化細(xì)胞，其中所述編碼重組端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 的核酸序列是SEQ ID NO:3。
15. 權(quán)利要求1-14之一的永生化細(xì)胞，其中其還包含編碼目的物質(zhì)的 核酸序列。
16. 權(quán)利要求1-14之一的永生化細(xì)胞，其中其還包含允許缺陷病毒增 殖的互補(bǔ)盒。
17. 權(quán)利要求l-16之一的永生化細(xì)胞在病毒復(fù)制中的用途。
18. 權(quán)利要求17的用途，其中所述病毒選自下組牛痘病毒，鼠痘病 毒，猴痘病毒，痘苗病毒，天花病毒和MVA。
19. 權(quán)利要求l-16之一的永生化細(xì)胞在制備目的物質(zhì)中的用途。
20. 權(quán)利要求l-16之一的永生化細(xì)胞在制備病毒中的用途。
21. 權(quán)利要求20的用途，其中所述病毒是痘病毒。
22. 權(quán)利要求21的用途，其中所述病毒是痘苗病毒。
23. 權(quán)利要求22的用途，其中所述痘苗病毒是MVA。
24. 權(quán)利要求l-16之一的永生化細(xì)胞在制備重組病毒中的用途。
25. 使禽細(xì)胞永生化的方法，包括用包含E1A核酸序列的非病毒載體 轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞的步驟，其中所述方法不包括用E1B核酸序列轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞 的步驟。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述載體包含與所述細(xì)胞基因組中存 在的序列同源的兩個(gè)序列。 ，
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述EiA核酸序列被所述同源序列包圍。
28. 權(quán)利要求26或27的方法，其中所述載體還包含第一選擇標(biāo)記， 其中所述第一選擇標(biāo)記是陽性選擇標(biāo)記并且其中所述第一選擇標(biāo)記被所述 同源序列包圍。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述第一選擇標(biāo)記被允許抑制該標(biāo)記 的序列包圍。
30. 權(quán)利要求26-28之一的方法，其中所述載體包含不被所述同源序 列包圍的第二選擇標(biāo)記，其中所述選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記。
31. 權(quán)利要求29或30的方法，其中所述載體包含第三選擇標(biāo)記，其 中所述第三選擇標(biāo)記是陰性選擇標(biāo)記并且其中所述第三選擇標(biāo)記位于允許 抑制所述第一選擇標(biāo)記的序列之間。
32. 權(quán)利要求28-31之一的方法，其特征在于其還包括在僅允許包含 第一選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞的步驟。
33. 權(quán)利要求30-32之一的方法，其特征在于其還包括在不允許包含 第二選擇標(biāo)記的細(xì)胞生長的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞的步驟。
34. 權(quán)利要求31-33之一的方法，其中所述方法還包括將第一選擇標(biāo) 記從所述細(xì)胞基因組去除的步驟。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中在將第一選擇標(biāo)記從所述細(xì)胞基因組 去除的步驟之后獲得的細(xì)胞被培養(yǎng)在不允許包含所述第三選擇標(biāo)記的細(xì)胞 生長的培養(yǎng)基中。
36. 權(quán)利要求25-35之一的方法，其中所述細(xì)胞得自屬于鴨科的生物體。
37. 權(quán)利要求36的方法，其中所述生物體屬于番鴨種。
38. 權(quán)利要求36的方法，其中所述生物體屬于綠頭鴨種。
39. 權(quán)利要求25-38之一的方法，其中所述E1A核酸序列被插入所述 細(xì)胞的耙DNA序列。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述靶DNA序列是HPRT基因。
41. 權(quán)利要求25-40之一的方法，其中所述載體還包含編碼重組端粒 酶逆轉(zhuǎn)錄酶的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及永生化禽細(xì)胞，以及這些細(xì)胞制備病毒的用途。本發(fā)明的細(xì)胞具體用于制備重組病毒載體，所述病毒載體可用于制備治療動(dòng)物更具體是人的治療和/或預(yù)防組合物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101688182SQ200880023138
公開日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者M·卡普弗, N·西爾韋斯特雷, P·埃爾布 申請(qǐng)人:特蘭斯吉恩股份有限公司