專利名稱：一種魯棒有序的mRNA差異顯示的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學及遺傳學的全基因表達圖譜技術(shù)領(lǐng)域。更具體涉及一 種魯棒有序的mRNA差異顯示的方法，它適用于所有真核物同一組織細胞在不同 發(fā)育時期、不同的生理病理條件下的mRNA差異比較研究，或者不同組織細胞 在相同的發(fā)育時期或相同的生理病理條件下的mRNA差異比較研究。
背景技術(shù)：
全基因組表達圖譜技術(shù)是現(xiàn)代生命科學研究領(lǐng)域的核心技術(shù)之一。目前已經(jīng) 有一些重要的模式真核生物如酵母、果蠅、線蟲、人類、鼠、擬南芥、水稻和高 粱等的全基因組序列已經(jīng)發(fā)表，但尚有大量生物物種的基因組是未知的，而且從 這些發(fā)表的結(jié)果到基因組序列完全完成尚有很大的距離。即使我們在后基因組時 代中得到了完美的基因組序列，由于真核生物在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控復 雜性，仍然要依靠不斷完成基因和轉(zhuǎn)錄本的"百科全書"才能最終真正解讀基因 組密碼。其核心問題就是揭示細胞在特定時空背景特定條件下的全基因表達圖 譜。
現(xiàn)今的全基因表達圖譜技術(shù)可依據(jù)各自的策略分為三大類基于測序的策 略、基于雜交的策略和基于凝膠電泳的策略。其中，測序策略可以為各種生物樣 本提供具有最大廣度和深度的序列信息及相應豐度信息。但是要對整個轉(zhuǎn)錄組或
全長cDNA進行測序，目前成熟可靠的技術(shù)是Sanger法，其成本極其昂貴。新一 代測序技術(shù)大大降低了成本，但目前僅適用于重測序，成本仍然很高。為了進一 步降低成本， 一些部分測序長標簽技術(shù)如表達序列標簽技術(shù)(EST) ， 3'-非翻譯 區(qū)(UTR)測序技術(shù)和短標簽測序技術(shù)如基因表達的系列分析技術(shù)(SAGE)，基因表 達的5' —帽端分析技術(shù)(CAGE)及3'和5'-端的雙標簽技術(shù)(Di-tag)被開發(fā)出來 并投入應用。但是長標簽技術(shù)的成本仍然很高。短標簽技術(shù)(尤其是在結(jié)合新一 代測序技術(shù)后)極大程度地降低了成本，但是往往因為序列太短而不能準確定位 到特定的基因。
cDNA微陣列技術(shù)是基于雜交策略中的主流技術(shù)。自發(fā)明以來，它一直在全 基因表達譜技術(shù)中占據(jù)優(yōu)勢地位。該技術(shù)利用樣本及對照的raRNA池與固定在芯片上的數(shù)以萬計根據(jù)已知基因序列設計的探針雜交，以高通量的方式確定各 mRNA的種類和豐度。雖然該技術(shù)獲得廣泛的利用，但長期以來一直倍受爭議。 例如， 一些由于雜交原理本身內(nèi)在的問題，包括它需要大量的RNA，缺乏多種樣 本平行比較方式，探針與相似的轉(zhuǎn)錄本間的交叉雜交，需要大量驗證努力等等。 此外由于要設計探針，參考基因組序列信息是必不可少的，所以該技術(shù)具有"封 閉性"，僅適用于基因組序列測定已經(jīng)完成的少數(shù)物種。特別是最近，大量關(guān)于 其可靠性、重復性、性價比和數(shù)據(jù)及噪點處理問題的質(zhì)疑呈爆發(fā)式地增加。cDNA 微陣列技術(shù)似乎已不再是全基因表達譜技術(shù)的理想選擇。
基于凝膠電泳的策略是全基因表達譜策略中性價比最高和最為直觀可行的 策略。它充分利用了包括PCR 、 DNA測序膠電泳、克隆和測序在內(nèi)的常規(guī)分子生 物學技術(shù)的簡單性和高效性。其所需儀器和試劑都是常規(guī)分子生物學實驗室常備 的。兩個或多個樣本的多態(tài)可在同一凝膠相鄰泳道中直觀地顯示出來并用于比較 分析。RNA的投入量可少至20皮克。通過有限數(shù)目引物組合進行PCR，即可以實 現(xiàn)高通量要求。差異條件被回收、重擴增和克隆測序后，可用于后續(xù)實驗和分析， 如BLAST分析和轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥取；谀z電泳的策略是"開放"的，它優(yōu)于cDNA 微陣列技術(shù)，既適用于具有己知參照基因組序列的物種，也適用于基因組序列未 知的物種；既可用于檢測已知基因或轉(zhuǎn)錄本表達差異，也可用于發(fā)現(xiàn)未知的基因 或轉(zhuǎn)錄本的檢測。
mRNA差異顯示和cDNA-AFLP是最重要的兩種基于凝膠電泳策略的技術(shù)。在 基于凝膠電泳的技術(shù)中，mRNA差異顯示技術(shù)是最簡單和最經(jīng)濟的。傳統(tǒng)的差異 顯示實驗方案利用由mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用由17個堿基組成的帶有 5'-歷'/wHI識別序列后跟的錨定多聚胸腺嘧啶引物(記為HT11V，H代表〃i/7dl1 識別序列，V代表堿基A、 C或G)和由13個堿基組成的5' — 識別序列 后跟的任意七堿基引物(H-AP， AP即arbitrary primer隨機引物)進行PCR。 PCR 產(chǎn)物跨越了 mRNA的多聚腺苷酸尾[poly(A) tail]和距其最近的與H-AP引物配對 區(qū)間，可能包括了部分或者全部的3'-UTR，還可能包括部分編碼區(qū)。3'-UTR相 對mRNA的其它區(qū)域更適于全基因表達圖譜分析，因為它更具可靠性和多態(tài)性。 通過不同樣本PCR產(chǎn)物片段長度多態(tài)性比較，可以提示不同樣本轉(zhuǎn)錄本的差異， 甚至可以區(qū)別出極其相似的轉(zhuǎn)錄本差異，這有效地克服了 cDNA微陣列技術(shù)中的 交叉雜交問題。此外，錨定的多聚胸腺嘧啶[poly(T)]引物保證了mRNA的3'-端 100%的覆蓋率。然而，差異顯示技術(shù)的局限也是很明顯的。poly(T)引物和任意 引物的使用會導致PCR的退火溫度低，非特異性擴增多。而且會存在大量無序的 錯配和引物對模板的競爭。各種因素導致PCR效率和結(jié)果的可靠性、重復性及靈 敏度低下，假陽性高。此外，還會存在低覆蓋率與大量覆蓋冗余的矛盾。cDNA-AFLP技術(shù)通過引入雙鏈cDNA合成、酶切(通常利用高頻位點/低頻位 點限制酶組合進行雙酶切)和連接接頭等幾個步驟克服了 raRNA差異顯示技術(shù)的 大多數(shù)缺點。借助接頭特異性引物，PCR可以在高嚴謹條件下進行。通過引入基 于磁珠的DNA片段分離技術(shù)，冗余現(xiàn)象可以避免而實現(xiàn)一片段一轉(zhuǎn)錄本的理念。 這樣cDNA-AFLP實現(xiàn)了從無序到有序的轉(zhuǎn)變。然而覆蓋率對其來說卻是一個棘手 的問題，它依賴于兩種酶切位點尤其是低頻酶切位點在各cDNA的分布情況。超 過十多種方法曾被勝于攻克這一難題，但收效甚微。因此，有必要建立一種既發(fā) 揮以上技術(shù)的優(yōu)點也克服以上技術(shù)的不足的新技術(shù)方法，來檢測基因組或轉(zhuǎn)錄本 mRNA的表達差異。 一種魯棒有序的mRNA差異顯示方法就是在這種研究背景中產(chǎn) 生的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種魯棒有序的mRNA差異顯示的方法，它將常 規(guī)的mRNA差異顯示與cDNA—AFLP方法有機地結(jié)合起來，從而具有高覆蓋率、 低冗余、高靈敏度、高重復性和高性價比。本方法普遍適于常規(guī)分子生物學實驗 室進行各種差異表達研究，尤其是在植物、動物及人類疾病的分子生物學診斷等 領(lǐng)域中具有潛在而廣泛的應用價值。
為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方法措施
利用設計的帶5'-端生物素標記和^cmI酶切位點的bmaT16V引物進行反轉(zhuǎn) 錄，使所有的cDNA上都實現(xiàn)了灰mI酶切位點100%覆蓋；利用酶切，可 以保證較高的覆蓋率和合適的擴增片段長度；反轉(zhuǎn)錄引物的生物素標記結(jié)合磁珠 法可專一性地分離每一 cDNA的僅帶poly(T/A)尾的唯一酶切片段，并去除冗余 片段；通過^c"I切除poly(T/A)尾，再連接假接頭，從而實現(xiàn)poly(T/A)置換。這 樣，傳統(tǒng)的差異顯示技術(shù)被徹底轉(zhuǎn)化成了 cDNA-AFLP技術(shù)方法。
魯棒有序的mRNA差異顯示的方法(Robust ordered differential display, RoDD)包括以下6個步驟(具體步驟見說明書附1):
(1) 、雙鏈cDNA的合成。以樣本純化后的總RNA為模板，利用設計的帶 5'-端生物素標記和Zod酶切位點的bmaT16V引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈(以 樣本水稻日本晴葉片和對照水稻日本晴根純化后的總RNA為模板，利用本發(fā)明 自主設計的bmaT16V引物(本實驗所有設計的接頭序列和引物序列皆由 invitrogen公司合成)合成cDNA第一鏈},再利用切口平移法合成cDNA第二鏈。 bmaT16V引物序列為5'-bio-GAGTCTGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'(其中bio 代表生物素標記，V代表堿基A、 G或C)。
(2) 、第一次酶切與連接。將cDNA純化回收，利用il/spl (本實驗所有內(nèi)接酶(購自promega公司)連接 My; I接頭。My戶I接頭序列為M-F 5'-GATGATGAGTCCTGAG-3'和M-R 5'-TACTCAGGACTCAT-3' o
(3) 、第一次分離。利用鏈霉親和素包被的磁珠與生物素雜交結(jié)合各cDNA 分子經(jīng)Afe/ I酶切并加上My; I接頭后帶生物素的片段，再利用磁力架吸附磁珠， 洗脫非吸附的冗余片段。
(4) 、第二次酶切、分離與連接，即poly(T/A)置換。利用Ar"I對結(jié)合在磁 珠上的片段進行再次酶切，然后利用磁力架吸附磁珠以留住其中帶生物素的片 段，取上清(含目的片段)并將其等分為I、 II兩部分，再利用T4連接酶連接 各自對應的假接頭，置換掉擴增效率低的poly(T/A)尾。連接產(chǎn)物加適量雙蒸水 稀釋即獲得預擴增的模板。第I部分連接的假接頭序列為PseudoI-F-
5'國CTCGTAGACTGCGAACCTT-3'和Pseudo I -R: 5'-GGTTCGCAGTC隱3'; 第II部分連接的假接頭序列為 Pseudo II -F : 5'-CTCGTAGACTGCGAACCTTNN-3'和Pseudo II -R
5'-AAGGTTCGC AGTC隱3'。
(5) 、預擴增和選擇性擴增。第i、 n部分連接產(chǎn)物的預擴增引物序列同為
M+0 : 5'-GATGATGAGTCCTGAACGG-3' 和Pseudo+0 : 5'
-CTCGTAGACTGCGAACCTT-3';而兩部分的選擴引物有區(qū)別，第I部分的選 擴引物序列為PI+2:
5' -GTAGACTGCGAACCTTVN-3'和MI+2: 5'陽GATGAGTCCTGAACGGNN-3'， 共192 個組合；第II部分選擴引物序列為 P II +2: 5'-GTAGACTGCGAACCTTNN隱3'(除去5'陽GTAGACTGCGAACCTTTT-3')和Mil +2: 5'-GATGAGTCCTGAACGGNN-3'，共240個組合；
(6) 、 DNA測序膠電泳分離及差異顯示。利用4% (質(zhì)量體積比)尿素變性 PAGE凝膠和DNA測序電泳儀(Thermo Fisher Scientific Inc.,美國)80W恒功率電 泳1.5 2小時分離步驟5中的選擇性擴增片段。銀(硝酸銀)染顯色(或者采取 熒光、放射性等替代顯示技術(shù))，通過比較顯色結(jié)果獲取差異片段。
含差異片段的PAGE膠塊可被切下并加以回收，利用原引物及原選擇性擴增 的條件重擴，克隆測序供進一步分析。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果
1、適用范圍廣。本發(fā)明適用于基因組序列已知和未知的所有真核生物物種， 適用于已知轉(zhuǎn)錄本的檢測和未知轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)；本方法發(fā)明適用于任何普通分子
生物學實驗室采用。2、 性價比高。本發(fā)明利用常規(guī)儀器和試劑去探索基因差異表達，操作成本 經(jīng)濟，實驗結(jié)果理想。
3、 結(jié)果可靠性高、實驗可重復性好，靈敏度高。本發(fā)明將mRNA差異顯示 徹底轉(zhuǎn)化為cDNA-AFLP形式，利用接頭特異性引物使得PCR在高嚴謹條件下 進行，有效地解決了常規(guī)差異顯示非特異擴增、引物競爭和高假陽性等問題，從 而使結(jié)果可信，重復性好，而且靈敏度高。
4、 覆蓋率高，而且冗余少。本發(fā)明利用poly(T/A)置換法將其置換為人工接 頭序列，確保了帶poly(A+)mRNA100W的覆蓋率。而另一端依賴于高頻酶切位 點在所有mRNA上的分布情況，預期可達93%以上。由于磁珠法的引入，去除 了絕大多數(shù)的非目的片段，因而將冗余降到了最低程度。


圖1魯棒有序的mRNA差異顯示方法(RoDD)流程圖
RoDD方法主要包括六個步驟(1).利用5'-端帶生物素標記和iWy/、 ^cm/ 酶切位點的bmaT16V引物進行反轉(zhuǎn)錄，將mRNA轉(zhuǎn)化為雙鏈cDNA。 (2).利用 Myp/進行酶切雙鏈cDNA，然后利用T4連接酶連接Mspl接頭。(3 ).利用鏈 霉親和素包被的磁珠與生物素雜交結(jié)合帶生物素的片段，利用磁力架吸附該類片 段并洗脫非吸附的冗余片段。(4).利用^:w/對被磁珠吸附的片段進行二次酶切， 然后利用磁力架吸附住帶生物素端的片段，取上清(含目的片段)并將其等分為 I和II兩部分。第I部分連接帶TT粘末端的假接頭；第II部分連接帶兩個任意選 擇性堿基的16種假接頭混合物。(5).分別以不帶選擇性堿基的假接頭引物和 MspI接頭引物組合對A、 B連接產(chǎn)物進行預擴增，再分別以稀釋的預擴產(chǎn)物為模 板，用相應帶兩個選擇性堿基的引物組合進行選擇性擴增。A部分共有12X 16=192 個組合，B部分有15 X 16=240個組合，兩者共計432個組合。(6).利用4%尿素 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離不同長度的擴增片段，硝酸銀染色。差異片段可被 切下回收、重擴增、克隆及測序，供進一步分析。
圖2 —周齡水稻幼苗葉、根基因表達差異研究示意圖I 圖2圖示了 31對選擇性引物組合和第I部分連接產(chǎn)物所擴增的產(chǎn)物經(jīng)變性、 測序膠電泳和硝酸銀染色等程序后得到的一周齡水稻幼苗葉和根的部分RoDD 差異表達圖譜。第I部分引物與帶TT突出末端的假接頭對應。各引物組合下的 1-3個泳道對應的水稻的葉(L)、根(R)和作為對照的葉根混合物(M)。右下角的小圖為矩形框所示局部結(jié)果的放大圖譜。各樣本擴增產(chǎn)物大小分布在 50-1000bp之間，而集中分布的區(qū)域為400bp左右。
圖3—周齡水稻幼苗葉、根基因表達差異研究示意圖n
圖3圖示了 30對選擇性引物組合和第II部分連接產(chǎn)物所擴增的產(chǎn)物經(jīng)變性、 測序膠電泳和硝酸銀染色等程序后得到的一周齡水稻幼苗葉和根的部分RoDD 差異表達圖譜。第II部分引物與非TT的二堿基突出末端假接頭相對應。各引物 組合下的1-3個泳道對應的水稻的葉(L)、根(R)和作為對照的葉根混合物(M)。 右下角的小圖為矩形框所示局部結(jié)果的放大圖譜。各樣本擴增產(chǎn)物大小分布情況 與圖2—致。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本方法發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明要求保護的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件和方 法，實驗條件和方法參照相關(guān)試劑公司的說明書或者《分子克隆》(第三版)(薩 姆布魯克等主編，2001)。
實施例l: 一周齡水稻幼苗葉、根基因表達差異研究
一種魯棒有序的mRNA差異顯示的方法，包括以下步驟
(1) 、雙鏈cDNA的合成。利用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)從一周齡基因 組序列己測定的標準粳稻日本晴幼苗中葉、根中分別提取總RNA。經(jīng)DNase I (Promega，美國)處理、酚仿(體積比1:1)抽提和75% (體積百分比)乙醇沉 淀后，將純化的總RNA溶于30ul焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的水中。取 適量純化后的葉、根各總RNA，以設計的bmaT16V為引物(Invitrogen公司合成, 美國)，利用Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶(Invi加gen，美國)分別合成cDNA第一鏈。 進一步利用RNA酶H、 DNA聚合酶I和大腸桿菌(￡. co//) DNA連接酶(takara， 日本)，通過切口平移法合成cDNA第二鏈。bmaT16V引物序列為 5'-bio-GAGTCTGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'(其中bio代表生物素標記，V 代表堿基A、 G或C)。
(2) 、第一次酶切與連接。利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化回收cDNA，再 利用她pl (neb公司，美國)進行酶切，然后利用T4連接酶連接Ms; I接頭。
接頭序列為M-F5'-GATGATGAGTCCTGAG-3'和 M-R 5'-TACTC AGGACTCAT-3'。
(3) 、第一次分離。通過磁珠法，利用鏈霉親和素包被的磁珠(promega公司，美國)與生物素雜交結(jié)合各cDNA分子經(jīng)M^I酶切并加上M^7l接頭后帶 生物素的片段，再利用磁力架吸附磁珠，洗脫非吸附的冗余片段。
(4) 、第二次酶切、分離與連接，即poly(T/A)置換。利用^cwl (neb公司， 美國)對被磁珠吸附的片段進行再次酶切，然后利用磁力架吸附住帶生物素端的 片段，取上清(含目的片段)并將其等分為I、 II兩部分，再利用T4連接酶連 接各自對應的假接頭，置換掉擴增效率低的poly(T/A)尾。將第I、 II兩部分連 接產(chǎn)物加適量雙蒸水稀釋即獲得預擴增的模板。第I部分連接的假接頭序列為 Pseudo I -F: 5'-CTCGTAGACTGCGAACCTT-3'和Pseudo I —R: 5' -GGTTCGCAGTC-3',帶-TT突出末端；第II部分連接的假接頭序列為Pseudo II-F: 5'-CTCGTAGACTGCGAACCTTNN-3'和PseudolI-R : 5' -AAGGTTCGCAGTC-3'， 帶任意兩堿基突出末端。
(5) 、預擴增和選擇性擴增。通過不帶選擇性堿基的接頭特異性引物，分別 對第I、 II部分連接產(chǎn)物進行預擴增。兩者的預擴增引物序列同為M+0: 5'-GATGATGAGTCCTGAACGG-3'和Pseudo+0: 5'
-CTCGTAGACTGCGAACCTT-3',預擴增的PCR程序為94°C ， 5min, 1個循環(huán)； 94°C， 30s， 56°C， 30s， 72°C， lmin，不超過25循環(huán)；72°C， 5min， 1個循環(huán)； 4'C， hold。將各自的預擴增產(chǎn)物加適量雙蒸水稀釋作為模板，以帶選擇性堿基 的引物進行選擇性擴增。兩部分的選擴引物有區(qū)別，第I部分的選擴引物序列為 PI+2: 5'-GTAGACTGCGAACCTTVN-3'和MI+2:
5'-GATGAGTCCTGAACGGNN-3'，共192個組合；第II部分選擴引物序列為P II+2:
5' -GTAGACTGCGAACCTTON-3'(除去5'陽-GTAGACTGCGAACCTTTT-3，)和M n+2:5'-GATGAGTCCTGAACGGNN-3'，共240個組合；選擇性擴增程序為94 。C， 5min， 1個循環(huán)；94°C， 30s， 65°C (每一循環(huán)降低0.7°C )， 30s， 72°C， lmin, 共13個touchdown循環(huán)；94°C， 30s， 56°C， 30s， 72°C， lmin， 25個循環(huán);72 °C, 5min， l個循環(huán)；4'C，保存。
(6) 、 PAGE凝膠電泳及差異顯示。取各選擴產(chǎn)物10iU，分別加入4ul甲 酰胺DNA變性緩沖液，95'C變性10min,然后迅速轉(zhuǎn)冰上冷卻2-3min。利用DNA 測序電泳儀(Thermo Fisher Scientific Inc.,美國)，以4% (質(zhì)量體積比)尿素變性 PAGE凝膠電泳分離擴增片段，變性產(chǎn)物上樣量l-4iU， 80W恒功率電泳1.5~2 小時，經(jīng)銀(硝酸銀)染顯色即可得到一周齡水稻幼苗葉、根基因差異表達指紋 圖譜(圖2、圖3)。
逐個比較各引物組合條件下水稻日本晴葉、根的選擇性擴增片段，對重要的 差異片段進行切膠、回收、重擴增和克隆測序，以供其它分析，如BLAST分析和半定量RT-PCR驗證。
申請人的驗證結(jié)果表明本方法發(fā)明能夠較靈敏、準確地檢測出不同類型的核 基因組背景的組織或細胞所表達的mRNA的差異，還能檢測出同一生物體的不 同組織所表達的mRNA的差異。據(jù)此，它也適用于同一生物體的同一組織在不 同的發(fā)育時期或不同生理病理條件下的差異表達研究。結(jié)果如圖2、 3中致密有 序的條帶說明了它較高的覆蓋率和較好的分辨率。實驗中通過有限的引物組合就 實現(xiàn)較高的覆蓋率，因而它具有高通量的特點。多次的重復實驗結(jié)果表明它具有 很好的重復性。鑒于本發(fā)明技術(shù)具有較高靈敏度、精確度、覆蓋率、高通量和重 復性的特點，同時普遍適用于不同的實驗室進行多個樣本的差異表達研究，只需 要常規(guī)的儀器和藥品，成本低廉，因而本方法發(fā)明在同領(lǐng)域中具有極高的性價比。
權(quán)利要求
1.一種魯棒有序的mRNA差異顯示的方法，包括以下步驟(1)、雙鏈cDNA的合成，以樣本純化后的總RNA為模板，利用設計的帶5′-端生物素標記和AcuI酶切位點的bmaT16V引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再利用切口平移法合成第二鏈；bmaT16V引物序列為5′-bio-GAGTCTGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTV-3′；(2)、純化回收cDNA，利用MspI酶切，然后利用T4連接酶連接MspI接頭；MspI接頭序列為M-F 5′-GATGATGAGTCCTGAG-3′和M-R5′-TACTCAGGACTCAT-3′；(3)、利用磁珠法分離帶生物素的酶切片段，即利用鏈霉親和素包被的磁珠與生物素雜交結(jié)合帶生物素的片段，利用磁力架吸附磁珠分離帶生物素的酶切片段，洗脫非吸附的不帶生物素的片段；(4)、利用AcuI再次酶切結(jié)合在磁珠上的帶生物素的片段，然后利用磁珠法再次吸附二次酶切產(chǎn)物后帶生物素的片段，取含目的片段的上清并將其等分為I、II兩部分，再利用T4連接酶連接各自對應的假接頭，實現(xiàn)poly(T/A)置換，連接產(chǎn)物加適量雙蒸水稀釋即獲得預擴增的模板；第I部分連接的假接頭序列為Pseudo-F5′-CTCGTAGACTGCGAACCTT-3′和Pseudo-R5′-GGTTCGCAGTC-3′；第II部分連接的假接頭序列為Pseudo-F5′--CTCGTAGACTGCGAACCTTNN-3′和Pseudo-R5′-AAGGTTCGCAGTC-3′；(5)、利用第I、II部分連接產(chǎn)物分別進行預擴增和選擇性擴增；兩部分的預擴增引物序列同為M+05′-GATGATGAGTCCTGAACGG-3′和Pseudo+05′-CTCGTAGACTGC GAA CCTT-3′；兩部分的選擴引物有區(qū)別，第I部分的選擴引物序列為P+25′-GTAGACTGCGAACCTTVN-3′和M+25′-GATGAGTCCTGAACGGNN-3′，共192個組合；第II部分選擴引物序列為P+25′--GTAGACTGCGAACCTTNN-3′和M+25′-GATGAGTCCTGAACGGNN-3′，共240個組合；(6)、利用DNA測序電泳儀以4％尿素變性PAGE凝膠電泳分離擴增片段，80W恒功率電泳1.5～2小時，硝酸銀染顯色，比較顯色結(jié)果獲取差異片段；含差異片段的PAGE膠塊被切下并加以回收，利用原引物及原選擇性擴增的條件重擴，克隆測序供進一步分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種魯棒有序的mRNA差異顯示的方法，步驟是A.提取總RNA，利用設計的帶5′-端生物素標記和AcuI酶切位點的poly(T)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，進一步用切口平移法合成雙鏈；B.純化回收cDNA，利用MspI進行酶切，再利用T4連接酶連接MspI接頭；C.利用磁珠法分離帶生物素的酶切片段，洗脫其余片段；D.利用AcuI對帶生物素的酶切片段進行再次酶切，通過T4連接酶連接AcuI假接頭；E.常規(guī)cDNA-AFLP的預擴增和選擇性擴增；F.尿素變性PAGE凝膠電泳及差異擴增片段顯示。差異片段可被切下回收、重擴、克隆和測序，供進一步分析。本法具有較高靈敏度、精確度、覆蓋率、高通量和重復性，適于常規(guī)分子生物學實驗室進行各種差異表達研究。
文檔編號C12Q1/68GK101638686SQ20091006316
公開日2010年2月3日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者毅 丁, 劉宏高 申請人:武漢大學