專利名稱：一種提高三孢布拉氏霉菌番茄紅素產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于提高液體深層發(fā)酵好氧微生物次級代謝產(chǎn)物的領(lǐng)域，特別涉 及到添加活性炭提高三孢布拉氏霉菌番茄紅素產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
番茄紅素是一種重要的類胡蘿卜素，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，是抗氧化 性最強(qiáng)的類胡蘿卜素，具有很強(qiáng)的清除單線態(tài)氧功能，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受氧 化傷害，實(shí)現(xiàn)其生理活性，能有效地防治前列腺癌、胃癌、皮膚癌等，對子 宮癌、肺癌細(xì)胞的抑制作用顯著高于P—胡蘿卜素、(X—胡蘿卜素。
番茄紅素可以由番茄皮中提取，可由化學(xué)方法合成，也可以經(jīng)微生物發(fā) 酵產(chǎn)生。從獲得的產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)技術(shù)、資源成本方面考慮，利用微生物技
術(shù)生產(chǎn)番茄紅素是未來發(fā)展的方向。其中，三孢布拉氏霉菌(萬/d^/e" W^wra) (+ )( — )菌株同時(shí)培養(yǎng)時(shí)能夠大量合成P-胡蘿卜素，在上個(gè)世紀(jì)五十年代 后期己實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，在該霉菌發(fā)酵過程中，添加適合的含氮雜環(huán)類化合 物，可以阻斷番茄紅素環(huán)化形成P-胡蘿卜素的過程，造成番茄紅素的積累。 最早在專利US 3097146中提出了這種方法，在以后的專利文獻(xiàn)US 3,369, 974， JP 48016189, JP 48016190, JP73016189, JP73016190, RU2102416, JP09313167, US3369974中均報(bào)道了相關(guān)研究成果。近些年來，國內(nèi)各研究部門和高校也 有相關(guān)研究報(bào)道。CN1528906A描述了一種用三孢布拉霉發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的 方法，CN1582328A發(fā)明了一種無外源胡蘿卜素生成抑制劑的適宜培養(yǎng)基中能 生產(chǎn)0.3g/L番茄紅素的三孢布拉霉。由于三孢布拉氏霉菌是一種高嗜氧菌， 發(fā)酵過程中對氧的需求非常大，生產(chǎn)培養(yǎng)基是糊化后的淀粉漿液，粘度非常 大，給發(fā)酵過程中的氧傳遞帶來了極大的困難，國內(nèi)專利CN1582328A中是 通過增加鼓風(fēng)和攪拌速率來滿足菌種生長過程中的需氧量，但這種方法需要 耗費(fèi)大量的能源，使生產(chǎn)成本提高，對工業(yè)化生產(chǎn)造成困難。有報(bào)道稱，在 發(fā)酵液中加入液態(tài)烷烴可以增加溶解氧含量，但添加濃度要盡量小，避免對 菌體造成傷害，后期產(chǎn)物分離提取要經(jīng)過脫毒處理，操作繁瑣。因此，市場 上有待出現(xiàn)一種安全、無毒、廉價(jià)的攜氧劑來解決這個(gè)問題。
活性炭是一種黑色粉狀，粒狀的無定形具有多孔的碳，主要成分為碳， 還含有少量氧、氫、硫、氮、氯，具有較大的表面積(500 1000米2/克)，有 很強(qiáng)的吸附性能，能在它的表面上吸附氣體、液體或膠態(tài)固體。利用這種性 質(zhì)可以將其加入發(fā)酵液中，釋放其攜帶的氧，優(yōu)化高粘度發(fā)酵液的流體性能，降低發(fā)酵液粘度，提高溶解氧含量，滿足三孢布拉氏霉菌生長所需氧，提高 番茄紅素產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的就是提高三孢布拉氏霉菌液體深層發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅 素的產(chǎn)量。具體實(shí)施方法是在發(fā)酵液中加入顆粒狀活性炭，取締液態(tài)攜氧劑， 優(yōu)化生產(chǎn)流程，降低生產(chǎn)成本，提高番茄紅素產(chǎn)量。
活性炭對菌體無任何毒害作用，固體小顆?？梢栽黾影l(fā)酵液流體流動(dòng)， 加快氧在液體中的溶解，高嗜氧菌生長良好。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，固體小顆粒提 高了菌體的過濾速度，提高了工作效率?；钚蕴恳嗫晌綒埩粼谝后w中的番 茄紅素，減少損失。
本發(fā)明的提供了一種三孢布拉氏霉菌番茄紅素產(chǎn)量的方法，其特征在于.. 在發(fā)酵開始之前或之中在發(fā)酵液中加入活性炭。
進(jìn)一步，加入的活性炭的粒徑是60目 200目。
進(jìn)一步，加入的活性炭的質(zhì)量濃度是0.5 2.0g/L起始發(fā)酵液。
進(jìn)一步，加入活性炭的時(shí)間是發(fā)酵第0 2天。
本發(fā)明的具體技術(shù)路線如下
1) 平板培養(yǎng)取去皮土豆20g，加入200ml去離子水煮開，冷卻后濾掉 土豆，清液加入2g葡萄糖，2g瓊脂，溶解后分裝115°C30分鐘滅菌，制備PDA 培養(yǎng)基。取三孢布拉氏霉菌(+ )( — )菌株孢子懸液分別涂布于含有PDA 培養(yǎng)基的平板中，于28。C避光培養(yǎng)3天，22'C培養(yǎng)2天。
2) 活性炭經(jīng)過鹽酸活化處理，烘干后備用。
3) 種子培養(yǎng)培養(yǎng)基由淀粉、葡萄糖、玉米漿熬制而成，加入溶解的鉀 鹽和鎂鹽，pH調(diào)節(jié)至6.4，將平板培養(yǎng)好的三孢布拉氏霉菌(+ )( — )菌 株，分別取菌皮接入裝有種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，在26 28'C180 200 轉(zhuǎn)/分的條件下，避光震蕩培養(yǎng)36 40小時(shí)。
4) 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基由淀粉、豆餅粉、玉米漿熬制而成，加入溶解 的鉀鹽和鎂鹽，pH調(diào)節(jié)至6.7，將培養(yǎng)好的(+ )、(一)菌種子液按體積比 1:4的比例混合，以體積比10%的接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml錐形瓶 中，活化處理后的活性炭根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求加入發(fā)酵培養(yǎng)基。在26~28°C、 220~250 轉(zhuǎn)/分的條件下，避光震蕩培養(yǎng)120小時(shí)。在發(fā)酵48小時(shí)時(shí)加入煙堿或吡啶類 代謝阻斷劑。
5) 菌體收集發(fā)酵結(jié)束后，用紗布過濾發(fā)酵液收集濕菌體，45'C0.08MP真空干燥得到干菌體。
6)番茄紅素含量分析粉碎干菌體，準(zhǔn)確稱取0.03 0.05g干菌粉，石油 醚萃取，用高效液相色譜法測定番茄紅素含量。
色譜條件
分離柱Diamonsil C18， ID5|im， 250X4.6mm;
流動(dòng)相乙腈二氯甲烷(75:25，V/V);
檢測條件波長450nm;柱溫28"C;流速1.5mL/min。
番茄紅素與番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比較確定，含量測定由外標(biāo)法確定。


圖l空白菌提取物色譜圖(最高峰為番茄紅素檢測峰) 圖2實(shí)施例2中活性炭添加量為1.0g/L時(shí)菌體提取物色譜圖(最高峰為 番茄紅素檢測峰)
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:①平板培養(yǎng)取去皮土豆20g，加入200ml去離子水煮開，冷 卻后濾掉土豆，清液加入2g葡萄糖，2g瓊脂，溶解后分裝115'C30分鐘滅菌， 制備PDA培養(yǎng)基。取三孢布拉霉(+ )( — )菌株孢子懸液分別涂布于含有 PDA培養(yǎng)基的平板中，于28'C避光培養(yǎng)3天，22"C培養(yǎng)2天。②活性炭預(yù)處 理將活性炭經(jīng)過200目、100目、60目、16目、5目篩子過濾，篩出不同 粒徑的活性炭，分別浸泡在質(zhì)量百分比濃度為0.5%的鹽酸中2小時(shí)，抽濾， 去離子水洗至中性，4(TC烘干備用。③種子培養(yǎng)基制備稱取淀粉40g，葡萄 糖20g，玉米漿50g，KH2PO41.5g,MgSO40.1 g ，溶于l升去離子水中，加 熱攪拌糊化至變粘稠，調(diào)節(jié)pH至6.4。分裝于250ml錐形瓶中，115'C30分 鐘滅菌。④發(fā)酵培養(yǎng)基制備稱取淀粉20g,豆餅粉40 g,玉米漿30 g KH2P04lg， MgSO4 0.1g，溶于l升去離子水中，加熱攪拌糊化至變粘稠，調(diào)節(jié) pH至6.7。分別準(zhǔn)確稱取不同粒徑活性炭各0.05g于500ml錐形瓶中，將糊 化好的發(fā)酵培養(yǎng)基量各取50ml倒入錐形瓶中，混勻，用八層紗布塞好瓶口， 外面用牛皮紙包扎好，121。C20分鐘滅菌。⑤種子培養(yǎng)取平板培養(yǎng)的三孢布 拉氏霉菌(+ )、(一)菌株分別接種于種子培養(yǎng)基中，標(biāo)號，于28"C180 轉(zhuǎn)/分避光培養(yǎng)得到(+ )、(一)菌種子液。⑥發(fā)酵以(+ )菌種子液 (一)菌種子液為1:4的體積比例按照體積比10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基 中，28。C220轉(zhuǎn)/分避光培養(yǎng)，在培養(yǎng)第48小時(shí)加入阻斷劑，發(fā)酵120小時(shí)后收集菌體，45'C0.08MP真空干燥得到干菌體。⑦分析測定粉碎干菌體，準(zhǔn) 確稱取0.03g，加入石油醚萃取至無色，用高效液相色譜法分析番茄紅素含量。 所得結(jié)果如下
添加200目活性炭，番茄紅素產(chǎn)量為733mg/L發(fā)酵液，比空白提高64%。 添加100目活性炭，番茄紅素產(chǎn)量為799mg/L發(fā)酵液，比空白提高79%。 添加60目活性炭，番茄紅素產(chǎn)量為677mg/L發(fā)酵液，比空白提高52%。
實(shí)施例2:①平板培養(yǎng)取去皮土豆20g，加入200ml去離子水煮開，冷 卻后濾掉土豆，清液加入2g葡萄糖，2g瓊脂，溶解后分裝115°C30分鐘滅菌， 制備PDA培養(yǎng)基。取三孢布拉氏霉菌(+ )( — )菌株孢子懸液分別涂布于 含有PDA培養(yǎng)基的平板中，于28'C避光培養(yǎng)3天，22"C培養(yǎng)2天。②活性炭 預(yù)處理將IOO目活性炭浸泡在質(zhì)量百分比濃度為0.7%的鹽酸中2小時(shí)，抽 濾，去離子水洗至中性，4(TC烘干備用。③種子培養(yǎng)基制備稱取淀粉40g,葡 萄糖20g，玉米漿50 g， KH2P041.5 g，MgS04 0.1 g ,,溶于1升去離子水中，加 熱攪拌糊化至變粘稠，調(diào)節(jié)pH值至6.4。分裝于250ml錐形瓶中，115°C30 分鐘滅菌。④發(fā)酵培養(yǎng)基制備稱取淀粉20g，豆餅粉40g,玉米漿30g, KH2P04 lg，MgSO40.1g，溶于1升去離子水溶解，加熱攪拌糊化至變粘稠，調(diào) 節(jié)pH值至6.7。準(zhǔn)確稱取0.005、 0.025、 0.05、 0.1、 0.15、 0.5g活化好的活 性炭于500ml錐形瓶中，將糊化好的發(fā)酵培養(yǎng)基量取50ml倒入其中，混勻， 用八層紗布塞好瓶口，外面用牛皮紙包扎好，12rC20分鐘滅菌。⑤種子培養(yǎng): 取平板培養(yǎng)的三孢布拉氏霉菌(+ )、(一)菌株分別接種于種子培養(yǎng)基中， 標(biāo)號，于26。C190轉(zhuǎn)/分避光培養(yǎng)得到(+ )、(一)菌種子液。⑥發(fā)酵以 (+ )菌種子液(一)菌種子液為l:4的體積比例按照體積比10%的接種量 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，26°C230轉(zhuǎn)/分避光培養(yǎng)，培養(yǎng)第48小時(shí)時(shí)加入阻斷劑， 發(fā)酵120小時(shí)后收集菌體，45X:0.08MP真空干燥得到干菌體。⑦分析測定 粉碎干菌體，準(zhǔn)確稱取0.04g，加入石油醚萃取至無色，用高效液相色譜法分 析番茄紅素含量。
所得結(jié)果如下-
添加100目活性炭濃度是0.5g/L，番茄紅素產(chǎn)量為609mg/L發(fā)酵液，比 空白提高37%。
添加100目活性炭濃度是1.0g/L，番茄紅素產(chǎn)量為799mg/L發(fā)酵液，比 空白提高79%。添加100目活性炭濃度是2.0g/L，番茄紅素產(chǎn)量為592mg/L發(fā)酵液，比 空白提高33%。
實(shí)施例3:①平板培養(yǎng)取去皮土豆20g,加入200ml去離子水煮開，冷 卻后濾掉土豆，清液加入2g葡萄糖，2g瓊脂，溶解后分裝115°C30分鐘滅菌， 制備PDA培養(yǎng)基。取三孢布拉氏霉菌(+ ) (_)菌株孢子懸液分別涂布于 含有PDA培養(yǎng)基的平板中，于28'C避光培養(yǎng)3天，22"C培養(yǎng)2天。②活性炭 預(yù)處理將100目活性炭浸泡在質(zhì)量百分比濃度為1.0%鹽酸中2小時(shí)，抽濾， 去離子水洗至中性，4(TC烘干備用。③種子培養(yǎng)基制備稱取淀粉30g,葡萄 糖15g,玉米漿45g，KH2PO41.5g,MgSO40.1g,溶于1升去離子水中，加熱攪 拌糊化至變粘稠，調(diào)節(jié)pH值為6.4。分裝于250ml錐形瓶中，115'C30分鐘 滅菌。④發(fā)酵培養(yǎng)基制備稱取淀粉30g，豆餅粉50g,玉米漿40g,KH2PO4 lg，MgSO40.1g，溶于l升去離子水中，加熱攪拌糊化至變粘稠，調(diào)節(jié)pH值 至6.7，。在其中一瓶中加入0.05g活性炭，其余不加，將糊化好的發(fā)酵培養(yǎng) 基量取50ml倒入500ml錐形瓶中，混勻，用八層紗布塞好瓶口，外面用牛皮 紙包扎好，121。C20分鐘滅菌。⑤種子培養(yǎng)取平板培養(yǎng)的三孢布拉氏霉菌 (+ )、(一)菌株分別接種于種子培養(yǎng)基中，標(biāo)號，于27°C200轉(zhuǎn)/分避光 培養(yǎng)得到(+ )、(一)菌種子液。⑥發(fā)酵以(+ )菌種子液(一)菌種 子液為1:4的體積比例按照體積比10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，27°C 250rpm培養(yǎng)，在培養(yǎng)了 24、 48、 72、 96小時(shí)時(shí)分次加入活性炭粉末0.05g， 培養(yǎng)了48小時(shí)時(shí)加入阻斷劑，發(fā)酵120小時(shí)后收集菌體，45"C0.08MP真空 干燥得到干菌體。⑦分析測定粉碎干菌體，準(zhǔn)確稱取0.05g，加入石油醚萃 取至無色，用高效液相色譜法分析番茄紅素含量。
所得結(jié)果如下
發(fā)酵開始時(shí)添加100目活性炭，番茄紅素產(chǎn)量為764mg/L發(fā)酵液，比空 白提高68°/。。
發(fā)酵開始后第1天添加100目活性炭，番茄紅素產(chǎn)量為654mg/L發(fā)酵液， 比空白提高43%。
發(fā)酵開始后第2天添加100目活性炭，番茄紅素產(chǎn)量為537mg/L發(fā)酵液, 比空白提高18°/。。
權(quán)利要求
1、一種提高三孢布拉氏霉菌番茄紅素產(chǎn)量的方法，其特征在于在發(fā)酵開始之前或之中在發(fā)酵液中加入活性炭。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其特征在于其中加入的活性炭的粒徑是60目 200目。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于其中加入的活性炭的質(zhì)量濃度是0.5 2.0g/L起始發(fā)酵液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于其中加入活性炭的時(shí)間是發(fā)酵第0 2天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高三孢布拉氏霉菌番茄紅素產(chǎn)量的方法，屬于提高好氧微生物液體深層發(fā)酵生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物的領(lǐng)域，特別涉及到添加活性炭提高三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)生產(chǎn)番茄紅素的方法。方法是在發(fā)酵液中加入活性炭，利用活性炭吸附氣體的性質(zhì)，增加發(fā)酵液中溶解氧的濃度，改善發(fā)酵液粘度，促進(jìn)三孢布拉氏霉菌的生長，番茄紅素的產(chǎn)量提高為原產(chǎn)量的150％以上。本方法成本低廉、操作簡便、效果明顯，可以取代液態(tài)烷烴、過氧化氫作攜氧劑，避免了化學(xué)物質(zhì)對菌種的毒害性，簡化了番茄紅素后提純工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的依據(jù)。
文檔編號C12R1/645GK101555490SQ20091008437
公開日2009年10月14日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日
發(fā)明者劉淑惠, 袁其朋 申請人:北京化工大學(xué)