專利名稱：感染熊蜂的微孢子蟲的分子檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種動物檢驗檢疫技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種準(zhǔn)確、快速的檢驗進(jìn)出口熊蜂 上的微孢子蟲分子檢驗技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
微孢子蟲是普遍分布于自然界，種群數(shù)量龐大的專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲類寄生物，有極 為廣泛的寄主，包括脊椎動物與無脊椎動物，是經(jīng)濟(jì)昆蟲、魚類、兔類、產(chǎn)毛動物、嚙齒類 及靈長類的致病病原。熊蜂是一類重要的經(jīng)濟(jì)授粉昆蟲，也受到微孢子蟲的危害，因此，微 孢子蟲成為熊蜂進(jìn)出口檢驗檢疫的重要病原物之一。
熊蜂微孢子蟲檢驗通常采用鏡檢法和常規(guī)的分子檢驗法。鏡檢法是將被檢樣品研磨后， 滴加蒸餾水，取1-2滴在載玻片上，于光學(xué)顯微鏡下觀察，極易漏檢。常規(guī)分子檢驗法是采 用酚氯仿提取DNA，設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，克隆測序。這種方法比鏡檢法更 靈敏準(zhǔn)確，不易漏檢，但是酚氯仿提取DNA需要5個小時，操作步驟多，易污染，所用有 機(jī)試劑大部分對人有害，而且克隆測序耗時、費用較高。
Klee等(Klee J. ， Besana A. M. ， Genersch E. ， " a/. Widespread dispersal of the microsporidian iVase脂 cera朋e ， an emergent pathogen of western honey bee ， y4p/s 丄/證n涵o/.， 2007， 96 (1): 1~10.)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段 長度多態(tài)(PCR—RFLP)分析技術(shù)來鑒定微孢子蟲種類，用Mfe I和Msp I 、I三種限 制性內(nèi)切酶對意大利蜜蜂(iV.甲&)、中華蜜蜂cera"ae)和熊蜂微孢子蟲的 部分SSUrRNA基因片段(引物SSU-res-fl: 5，-GCCTGACGTAGACGCTATTC-3，，SSU-res-rl: 5，-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3，)進(jìn)行酶切，用AWe I 、 Ms; I酶切TV. a/ &， Ms/ I酶切 6owW，尸"c I 、 il/印I酶切iV. cera"ae，利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物片斷 的長度來鑒定種類。但是此方法需用三種酶，費用高，而且雙酶切時其中一種酶的酶切效率 會降低，造成部分酶切不完全。其次，用此方法不能鑒定出感染熊蜂的另外一種微孢子蟲

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速的檢驗檢疫進(jìn)出口熊蜂上的微 孢子蟲的方法，而且費用較適中，使用的大部分檢測試劑對人無害。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明在比較了感染熊蜂的三種微孢子蟲M cerawae、iV. 6omW、 W AowMom'的SSUrRNA基因序列后，建立了一種基于單一限制性內(nèi)切酶分析三種微孢子蟲SSUrRNA基因片段的快速檢驗鑒定感染熊蜂的微孢子蟲種類的方法。
首先采用 Chelex-100法提取DNA ，用特異性引物(SSUrRNA-fl : 5'隱CACCAGGTTGATTCTGCCT隱3; SSUrRNA-rlb: 5，-TGTTCGTCCAGTCAGGGTCGTCA-3，) 擴(kuò)增出540 bp的微孢子蟲SSUrRNA基因片段，然后用限制性內(nèi)切酶4/"" I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行 酶切，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，直接根據(jù)酶切產(chǎn)物片斷的長度和條帶數(shù)來檢 驗鑒定種類。
按照本發(fā)明，4^I對PCR產(chǎn)物酶切的結(jié)果如下 iV. cera"ae在500 bp、 50 bp附近產(chǎn)生兩條帶。 M在350 bp、 150 bp、 50bp附近產(chǎn)生三條帶。 AU/zw wom'在350 bp、 100 bp、 50bp附近產(chǎn)生三條帶。 iV. cerawae和iV. 在500 bp、 350 bp、 150 bp、 50 bp附近產(chǎn)生四條帶。
iV. cera"ae和iV. Awmom'在500 bp、 350 bp、 100 bp、 50 bp附近產(chǎn)生四條帶。 iV. 6o附W和iV. 在350 bp、 150 bp、 100 bp、 50 bp附近產(chǎn)生四條帶。
本發(fā)明技術(shù)使用Chelex-100法提取DNA簡便快速，只需30 min左右，并且提取過程始
終在同一試管中進(jìn)行，減少DNA的損失，避免污染，而且Chelex-100是一種以亞氨二乙酸 為吸附因子的苯乙烯和苯二乙烯共聚物，對人無害。只用一種限制性內(nèi)切酶酶切，瓊脂糖凝 膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，直接根據(jù)產(chǎn)物片斷的長度和條帶數(shù)就可以檢驗出熊蜂是否感染了微孢 子蟲，感染了幾種微孢子蟲，并可以鑒定出微孢子蟲的種類，費用低，簡單，準(zhǔn)確，快速。


通過以下實例結(jié)合附圖所作的詳細(xì)描述，可以更清楚地理解本發(fā)明的目的、優(yōu)點及特征。 實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
圖1微孢子蟲SSUrRNA基因片段的4/ 1酶切位點不同微孢子蟲用引物 SSUrRNA-fl/SSUrRNA-rlb擴(kuò)增出540 bp的SSUrRNA基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的I酶切位點 分析。其中括號內(nèi)為微孢子蟲SSUrRNA基因的GenBank登錄號。
圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶不同微孢子蟲用引物SSUrRNA-fl/SSUrRNA-rlb 擴(kuò)增產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中M: DNA Marker; N:陰性對照(未感染微 孢子蟲的熊蜂基因組DNA);泳道l: iV. cmmae;泳道2: iV. 6owW;泳道3: AU/20附TO"/; 泳道4: iV. cera朋e禾口 iV. 6函6z'; 泳道5: iV. cera朋e禾口iV. ^zo柳om'; 泳道6: iV. 6謡6/禾卩_/^
圖3酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶不同微孢子蟲用引物SSUrRNA-fl/SSUrRNA-rlb 擴(kuò)增的產(chǎn)物的4/"1酶切產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中M: DNAMarker; N:陰性對照(未感染微孢子蟲的熊蜂基因組DNA);泳道l-6表示同圖3;泳道7: PCR產(chǎn)物。
圖4不同熊蜂寄主來源的微孢子蟲PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶不同熊蜂寄主來源
的微孢子蟲用引物SSUrRNA-fl/SSUrRNA-rlb擴(kuò)增產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其 中M: DNA Marker; N:陰'性對照(未感染微孢子蟲的熊蜂基因組DNA);泳道1: Bo附&ws 泳道2: 5om6肌tofe狄em^;泳道3-7: 5o w&ws加re欲/s;泳道8-10: 5cw6船々幼'vw"
圖5不同熊蜂寄主來源的微孢子蟲酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶不同熊蜂寄主來源
的微孢子蟲用引物SSUrRNA-fl/SSUrRNA-rlb擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)J/fl I酶切的2%瓊脂糖凝膠電泳檢
測結(jié)果。M、 N、泳道1-10表示同圖4， 11: PCR產(chǎn)物。
具體實施例方式
實施例l 三種微孢子蟲檢驗及種類鑒定 以純化的iV. cera"oe、 iV. 6owW、 W. Aowsom'三種微孢子蟲及兩兩混合為樣本，采用本發(fā) 明的 Chelex-100 法分別提取 DNA ，用特異性引物 (SSUrRNA-fl: 5'-CACCAGGTTGATTCTGCCT-3，,SSUrRNA-rlb:5，-TGTTCGTCCAGTCAGGGTCGTCA國3') 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再經(jīng)4/""I酶切，酶切產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。
PCR反應(yīng)體系
25nl反應(yīng)體系中加入5nl的5xGoTaqBuffer、 1.5(^1的MgCl2 (25mM) (Promega)， 2.0 td的dNTPs (200nM) (TaKaRa), SSUrRNA-fl、 SSUrRNA-rlb引物各1 pi (lOpM), 0.625 U/管的GoTaqDNA聚合酶，5 pl的模板DNA (約5 ng/pl)， 9.375 pl的ddH20。 95。C預(yù)變性 4min后進(jìn)入循環(huán)95。C變性1 min， 64"C退火1 min， 72。C延伸1 min， 40個循環(huán)，最后72°C 延伸10min。取5 nl擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2。/。瓊脂糖凝膠電泳檢湖ij，擴(kuò)增結(jié)果見說明書附圖中的圖2PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶。
PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系
在20 pi反應(yīng)體系中加入1 ^ 4/"" I (TaKaRa)， 2 pl 10xT Buffer, 2 pi 0.1%BSA， 15 ^ 的PCR產(chǎn)物，37。C酶切3h:
酶切結(jié)果與本發(fā)明內(nèi)容中所述的酶切結(jié)果一致，見說明書附圖中的圖3酶切產(chǎn)物的瓊脂糖 凝膠電泳條帶。表明使用本發(fā)明可用于檢驗并鑒定iV. cera""e、 W6owW、 AU/ww卵!'三種微 孢子蟲。
實施例2
國內(nèi)外熊蜂的微孢子蟲的檢驗及種類鑒定 采用本發(fā)明方法，對來自瑞士的5只熊蜂fiom6ws fen^M's和國內(nèi)的1只熊蜂Bow6船Zc^aMerais、 3只Bow6附/e勸'"ras、 1只Bow&ws/Aeam^進(jìn)行微孢子蟲的檢驗及微孢子蟲的種類鑒定。
PCR反應(yīng)體系及PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系同實例1， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物均采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，見說明書附圖中的圖4不同熊蜂寄主來源的微孢子蟲PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶。
酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)來自瑞士的5只熊蜂和國內(nèi)的5只熊蜂都感染了
微孢子蟲，各自酶切產(chǎn)物電泳產(chǎn)生的條帶如下1: 500 bp、 50bp附近產(chǎn)生兩條帶；2: 350 bp、
100 bp、 50bp附近產(chǎn)生三條帶；3-9: 350 bp、 150 bp、 50bp附近產(chǎn)生三條帶；10: 500 bp、50bp附近產(chǎn)生兩條帶。見說明書附圖中的圖5不同熊蜂寄主來源的微孢子蟲酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶。據(jù)此判斷微孢子蟲的種類為1: Wcerawae; 2: W/ omTO"/; 3-9: A^ow6/;10: iV.cerawfle。
權(quán)利要求
1、一種檢驗檢疫熊蜂的病原物微孢子蟲的分子方法，Chelex-100法提取DNA，經(jīng)一次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用一種限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。其特征在于利用特異引物SSUrRNA-f1/SSUrRNA-r1b PCR擴(kuò)增微孢子蟲540bp的SSUrRNA基因片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Afa I酶切，利用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，直接根據(jù)酶切產(chǎn)物片斷的長度，即可檢測出寄生在熊蜂身上的微孢子蟲的種類。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子檢測方法，其特征在于所述的感染熊蜂的微孢子蟲包括 iVos^附a cerawae (簡稱); A^as^/wa 6t7附^/ (簡禾爾TV! 6omZ /); A^se附a ^ o附sow/ (簡禾爾
全文摘要
感染熊蜂的微孢子蟲的分子檢測技術(shù)。屬于動物檢驗檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種準(zhǔn)確、快速的檢測進(jìn)出口熊蜂上的微孢子蟲的分子檢驗技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的特征是采用Chelex-100法提取DNA，用特異性引物進(jìn)行一次PCR，擴(kuò)增出540bp的微孢子蟲SSUrRNA基因片段，然后用限制性內(nèi)切酶Afa I對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，利用2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，直接根據(jù)酶切產(chǎn)物片斷的長度，即可檢測出寄生在熊蜂身上的微孢子蟲的種類，本發(fā)明可應(yīng)用于國內(nèi)外進(jìn)出口熊蜂的病原物微孢子蟲的檢驗檢疫。
文檔編號C12R1/90GK101603093SQ20091015823
公開日2009年12月16日 申請日期2009年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月23日
發(fā)明者杰 吳, 安建東, 彭文君, 李繼蓮, 羅術(shù)東, 陳文鋒, 黃家興 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所