專利名稱：利用酶拆分法制備l-硒代蛋氨酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸的生物拆分方法，尤其是涉及一種利用酶拆分法制備L-硒代蛋氨酸的方法。
背景技術：
硒是人體必需的微量元素之一，它是人體紅細胞谷胱甘肽過氧化物酶(GSH--Px)的組成成份，它主要的作用是參與酶的合成，保護細胞膜的結構及其功能，免遭過度氧化損害和干擾的重要物質，研究表明缺硒會引起人類很多疾病，如貧血、冠心病、大骨節(jié)病、克山病及糖尿病等。而適量補硒具有增強機體免疫功能和抗癌、防癌、保護心臟、延緩衰老的作用。科學研究發(fā)現，人體對硒的正常攝入量為40—240Mg/kg. d，硒主要來源于與人類生活息息相關的生物樣品，如大蒜、枸杞、紫菜、肉、蛋、魚類等。無論是植物性或動物性食物，其中所含有的硒都來自于土壤，所以人是否缺硒主要取決于所生活的區(qū)域土壤中的含硒量，而我國存在一條東北至西南走向的低硒帶，在該地區(qū)種植的食物中硒含量較低，遠遠達不到人體的需要，所以生活在該地區(qū)的人群必須靠補充硒來滿足體內的營養(yǎng)需要。目前采用的補硒產品主要是無機亞硒酸鈉強化的食品及保健品，如亞硒酸鈉片、富硒食鹽、硒寶康、黃金搭檔等，均含無機硒化物。實驗證明l.無機硒對人的毒性較有機硒大，生物利用率也遠低于有機硒化物。2.過量的硒對機體有一定的毒害，毒性的大小與其化學形態(tài)有關。而人體從生物樣品中攝入的硒主要是以硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸形式存在的，屬于有機硒化合物。氨基酸由于有手性中心而具有不同的構型。不同構型的硒代氨基酸其生理活性和生物可利用性存在很大差異。通常只有L-構型的硒代氨基酸能被人體組織所利用，而對于D-構型或消旋的硒代氨基酸則會對人體產生較大的危害。目前通過化學合成法制備的硒代氨基酸一般為DL-外消旋型的化合物，要作為食品、飼料的添加劑及醫(yī)藥應用皆要求L-氨基酸，所以必須對化學合成的DL-氨基酸進行光學拆分。目前常用的拆分方法有化學拆分法和生物拆分法等，化學拆分法合適的拆分劑難尋且成本高、拆分過程須用大量的有機溶劑及化工原料、生產周期長、毒副作用大、工業(yè)生產受限制；生物拆分法以酶為拆分劑、生產工藝簡單、反應條件溫和、無公害、對環(huán)境污染小、完全能適合工業(yè)化生產。氨基酸的生物拆分法以氨基?；?E. C. 3. 5. 1. 14)為酶源是尤其有效的，該酶存在于各種動物、植物器官以及微生物細胞內或發(fā)酵液中，是生物體進行氨基酸代謝過程中的一種重要的水解酶、活性高、來源廣、易得到、生產成本低，用于大規(guī)模氨基酸拆分方面已被大量報道，但在DL-硒代蛋氨酸拆分方面的應用國內外尚屬空白。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種用化學合成的DL-硒代蛋氨酸為原料，利用酶拆分法制備L-硒代蛋氨酸的方法。
為實現上述目的，本發(fā)明可采取下述技術方案
本發(fā)明所述的利用酶拆分法制備L-硒代蛋氨酸的方法，它包括下述步驟第一步氨基?；傅闹苽?br> 將新鮮動物內臟100重量份切除內膜洗凈，加入pH7. 0冷凍0-5'C的磷酸鹽緩沖溶液100重量份，置于搗碎機中打碎成細槳，再加入冷凍0-5-C磷酸鹽緩沖溶液150重量份，在0-5'C下，攪拌浸取30-40min，將浸取混合液置于冷凍離心機中，0-5'C條件下離心分離30min后，取上清液在相同條件下再重復離心分離兩次，取最后得到的上清液慢慢加入碾細的固體(NH4) 504至30-50%飽和，在0-5'C下攪拌使其均勻后，置于冰箱中0-5""C放置過夜，將上清液虹吸倒出，剩余沉淀物置于冷凍離心機中，在溫度0-5'C條件下，離心沉降得鹽析沉降物，將其裝入透析袋并放入去離子水中，于0-5'C透析12-24h，用BaCl2檢驗透析液無S(V2—離子時，透析完畢；將透析后的酶液冷凍離心除去雜蛋白后，用PH7.0磷酸鹽緩沖液稀釋，在0--4'C條件下保存于冰箱中備用；
第二步N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸的制備取NaOH和Na2C03按照2:5-6重量份的比例添加到60份水中配成緩沖液，將20重量份的DL-硒代蛋氨酸攪拌加入使之溶解，冷卻到2(TC以下，緩慢滴加乙酸酐14-15重量份，繼續(xù)攪拌2小時后，用茚三酮顯色呈陰性即可；然后用濃HC1調溶液pHl-2，密封后放置20小時析出淡黃色結晶，經抽濾、去離子水洗滌，再用乙醚洗至中性，干燥后既得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸成品；
第三步L-硒代蛋氨酸的制備
a、 拆分取第二步中所得的N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸18-20重量份，用去離子水400重量份稀釋，用6 mol/LNaOH調節(jié)pH7. 0-8.0,加入2重量份的0. lmol/LCoCl2溶液，再加入氨基?；?，酶用量為700U/mraol底物，在20_40°C下，保溫40-110h，然后用乙酸中和至pH5-6，加入活性炭脫色，于80-85'C加熱攪拌后，過濾除去活性炭，將濾液減壓蒸發(fā)至干，得N-乙酰-D-硒代蛋氮酸與L-硒代蛋氨酸的混合物，用乙酸乙酯提取三次，合并提取液待用，剩余物為L-硒代蛋氨酸粗品；
b、 精制將上述所得L-硒代蛋氨酸粗品溶于80-9(TC熱水中，用HC1調pH5， 5-6.0，加入l-4g/L活性炭處理，熱濾，濾液冷卻至室溫，再滴加乙醇至出現白色混濁為止，于0-6'C放置數小時結晶，抽濾，即得精制的L-硒代蛋氨酸
精品o
本發(fā)明的優(yōu)點在于采用化學合成的DL-硒代蛋氨酸為原料，經乙?；螅脧膭游锬I臟(如牛、豬)中提取的氨基?；傅牧Ⅲw專一性地去乙?；?，從而達到拆分DL-硒代蛋氨酸制備L-硒代蛋氨酸的目的。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的利用酶拆分法制備L-硒代蛋氨酸的方法，它包括下述步驟第一步氨基?；傅闹苽?br> 將新鮮動物內臟100g切除內膜洗凈，加入100mlpH7. 0冷凍0-5'C的磷酸鹽緩沖溶液，置于搗碎機中打碎成細漿，再加入冷凍0-5。C磷酸鹽緩沖溶液150ml，
6在0-5'C下，攪拌浸取30-40min，將浸取混合液置于冷凍離心機中，于轉速4500rpm，溫度0-5'C條件下離心分離30min后，取出上清液在相同冷凍離心條件下再重復操作兩次，取最后得到的上清液慢慢加入碾細的固體(MU 2S04至30-50%飽和，在0-5'C條件下攪拌0.5h使其均勻后，置于冰箱中在0-5-C條件下放置過夜，將上清液虹吸倒出，剩余沉淀物置于冷凍離心機中，于轉速4500rpm，溫度0-5'C條件下，離心沉降45min后得鹽析沉降物，將其裝入透析袋并放入去離子水中，于0-5'C透析12-24h，在其間經常更換去離子水，并用BaCl2檢驗透析液無S0/—離子時，透析完畢；將透析后所得的酶液冷凍離心除去雜蛋白后，用pH7. 0磷酸鹽緩沖液稀釋，在0—4'C條件下保存于冰箱中備用，經測定，酶活力為16000 u/ml;
第二步N-乙酰-DL-硒代蛋氮酸的制備
將2. Og(O. 05mol)NaOH和5. 3g (0. 05mol)勛2(:03與60mlH20中配成的緩沖液加到反應瓶中，攪拌下加入DL-硒代蛋氨酸20g使之溶解，冷卻到2(TC以下，緩慢滴加乙酸酐14. 3ml，約1. 5h滴完，繼續(xù)攪拌2h后，用茚三酮顯色呈陰性說明a -氨基已全部乙?；?；然后用濃HC1調溶液pHl-2，密封后于冰箱在小于5'C條件中放置20h析出淡黃色結晶，經抽濾、0-5'C冰冷的去離子水洗滌，再用乙醚洗至中性，干燥后既得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸成品20.0g， m.p.126-128°C，產率為82. 4%;
第三步L-硒代蛋氨酸的制備
a、拆分取第二步中所得的N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸19g (0.08mol)，加入去離子水400ml稀釋，用6 mol/LNaOH調節(jié)PH7. 0-8. 0，加入0. lmol/LCoCl2溶液2ml，再加入氨基?；?，酶用量為700U/mmol底物，在20-40。C條件下，保溫40-110h，然后用乙酸中和至PH5-6，以停止酶的活力，再加入活性炭脫色，于80-85'C加熱攪拌0.5h后，過濾除去活性炭，將濾液減壓蒸發(fā)至干，得N-乙酰-D-硒代蛋氨酸與L-硒代蛋氨酸的混合物，用乙酸乙酯提取三次，合并提取液(含N-乙酰-D-硒代蛋氨酸的乙酸乙酯提取液)待用，剩余物為L-硒代蛋氨酸粗n
b、精制將上述所得L-硒代蛋氨酸粗品溶于80-90'C熱水中，用HC1調pH5. 5-6.0，加入1-4g/L活性炭處理0. 5h，熱濾，濾液冷卻至室溫，再滴加乙醇至出現白色混濁為止，于0-6'C放置數小時結晶，抽濾，即得精制的L-硒代蛋氨酸精品6. 7g，產率為85%, m. p. 264-265。C， [ a ]D12= +18. 2 (C二l， lmol/L HC1)。
D-硒代蛋氨酸的消旋化將第三步a中所得的拆分后含N-乙酰-D-硒代蛋氮酸的乙酸乙酯提取液減壓濃縮，升溫100-130'C，以3ml/min的速度滴加一定量的醋酐，反應時間20min ，后冷卻到室溫，加HCl調pH2.5，濃縮后，入冰箱中在0-5-C條件下結晶，得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸，收率為71.鄉(xiāng)，供制備L-硒代蛋氨酸拆分用。
利用氨基?；笇L-硒代蛋氨酸進行光學拆分是一種十分有效的方法，反應條件溫和，分離純化方便，產品光學純度高，可以對化學合成的多種氨基酸進行光學拆分，同時可以制得D-型和L-型兩種光學活性產物。該方法克服了生物發(fā)酵法和不對稱合成法制備L-硒代蛋氨酸收率低、生產成本高的缺點，而且該方法使用的酶活性高、來源廣、易得到，對大規(guī)模生產十分有利，可作為對化學合成新型氨基酸進行光學拆分的一種新途徑。
權利要求
1、一種利用酶拆分法制備L-硒代蛋氨酸的方法，其特征在于它包括下述步驟第一步氨基?；傅闹苽鋵⑿迈r動物內臟100重量份切除內膜洗凈，加入pH7.0冷凍0-5℃的磷酸鹽緩沖溶液100重量份，置于搗碎機中打碎成細漿，再加入冷凍0-5℃磷酸鹽緩沖溶液150重量份，在0-5℃下，攪拌浸取30-40min，將浸取混合液置于冷凍離心機中，0-5℃條件下離心分離30min后，取上清液在相同條件下再重復離心分離兩次，取最后得到的上清液慢慢加入碾細的固體(NH4)2SO4至30-50％飽和，在0-5℃下攪拌使其均勻后，置于冰箱中0-5℃放置過夜，將上清液虹吸倒出，剩余沉淀物置于冷凍離心機中，在溫度0-5℃條件下，離心沉降得鹽析沉降物，將其裝入透析袋并放入去離子水中，于0-5℃透析12-24h，用BaCl2檢驗透析液無SO4-2-離子時，透析完畢；將透析后的酶液冷凍離心除去雜蛋白后，用pH7.0磷酸鹽緩沖液稀釋，在0--4℃條件下保存于冰箱中備用；第二步N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸的制備取NaOH和Na2CO3按照2∶5-6重量份的比例添加到60份水中配成緩沖液，將20重量份的DL-硒代蛋氨酸攪拌加入使之溶解，冷卻到20℃以下，緩慢滴加乙酸酐14-15重量份，繼續(xù)攪拌2小時后，用茚三酮顯色呈陰性即可；然后用濃HCl調溶液pH1-2，密封后放置20小時析出淡黃色結晶，經抽濾、去離子水洗滌，再用乙醚洗至中性，干燥后既得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸成品；第三步L-硒代蛋氨酸的制備a、拆分取第二步中所得的N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸18-20重量份，用去離子水400重量份稀釋，用6mol/LNaOH調節(jié)pH7.0-8.0，加入2重量份的0.1mol/LCoCl2溶液，再加入氨基?；?，酶用量為700U/mmol底物，在20-40℃下，保溫40-110h，然后用乙酸中和至pH5-6，加入活性炭脫色，于80-85℃加熱攪拌后，過濾除去活性炭，將濾液減壓蒸發(fā)至干，得N-乙酰-D-硒代蛋氨酸與L-硒代蛋氨酸的混合物，用乙酸乙酯提取三次，合并提取液待用，剩余物為L-硒代蛋氨酸粗品；b、精制將上述所得L-硒代蛋氨酸粗品溶于80-90℃熱水中，用HCl調pH5.5-6.0，加入1-4g/L活性炭處理，熱濾，濾液冷卻至室溫，再滴加乙醇至出現白色混濁為止，于0-6℃放置數小時結晶，抽濾，即得精制的L-硒代蛋氨酸精品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用酶拆分法制備L-硒代蛋氨酸的方法，它包括下述步驟1.將新鮮動物內臟加磷酸鹽緩沖液打碎、分離，沉淀物離心沉降透析后用磷酸鹽溶液稀釋為氨基?；競溆茫?.取NaOH和Na₂CO₃加水配成緩沖液，將DL-硒代蛋氨酸攪拌加入使之溶解，滴加乙酸酐調整為陰性，用濃HCl調溶液pH1-2，密封放置析出淡黃色結晶，抽濾、去離子水洗滌，用乙醚洗至中性，干燥后既得N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸成品；3.將N-乙酰-DL-硒代蛋氨酸用去離子水稀釋，NaOH調節(jié)，加入CoCl₂溶液和氨基?；负笥靡宜嶂泻?、活性炭脫色后，濾液蒸發(fā)至干，用乙酸乙酯提取得L-硒代蛋氨酸粗品，精制后即得L-硒代蛋氨酸精品。
文檔編號C12P13/00GK101671704SQ200910172259
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月25日 優(yōu)先權日2009年9月25日
發(fā)明者王小松 申請人:王小松;姚永強