專利名稱：凝集性酵母及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生物乙醇生產(chǎn)的、屬于凝集性得到提高的馬克斯克魯維酵母 (Kluyveromyces marxianus)的凝集性酵母及其制備方法等。
背景技術(shù)：
微生物在工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)中占有重要的位置。其中，更高效、便宜地進(jìn)行生產(chǎn)是人們 想解決的一項(xiàng)課題。其解決方法有選擇表現(xiàn)更高生產(chǎn)率的菌株、以及對(duì)用于微生物培養(yǎng)的 培養(yǎng)基的組成或培養(yǎng)溫度等培養(yǎng)條件進(jìn)行研究等。以近年來(lái)分子遺傳學(xué)的發(fā)展為基礎(chǔ)，作 為菌株的一種選擇方式，可以列舉由現(xiàn)有的菌株利用特定的優(yōu)秀基因，將菌株轉(zhuǎn)化的方法。 目前，即使對(duì)于生產(chǎn)有用的食品類的酵母，為了更有效的生產(chǎn)，也較多地進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。作為用于有效生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化的一種，可以列舉提高菌體凝集性的轉(zhuǎn)化。利用了發(fā)酵 法的醇生產(chǎn)，可以通過(guò)在作為發(fā)酵酵母的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中使用醇 生產(chǎn)率特別高的株，并利用分批發(fā)酵法或連續(xù)發(fā)酵法這樣的方法來(lái)實(shí)施?，F(xiàn)有的分批發(fā)酵 法，是通過(guò)在醇發(fā)酵酵母中添加糖蜜等作為原料，并在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)生成醇的。 生成的醇通過(guò)加熱培養(yǎng)液而蒸餾回收，但殘留在培養(yǎng)液中的酵母由于加熱而滅活。因此，在 持續(xù)進(jìn)行醇生產(chǎn)時(shí)，必須要補(bǔ)充酵母液。這樣的工序效率差，進(jìn)而成本高。當(dāng)使用凝集性 酵母時(shí)，靜置并回收上清液的醇，在沉淀的凝集性酵母中添加新的發(fā)酵液，可再次進(jìn)行醇生 產(chǎn)，因此對(duì)于利用了分批發(fā)酵法的醇生產(chǎn)，優(yōu)選使用凝集性的酵母。作為賦予凝集性的轉(zhuǎn)化的方法，有在醇發(fā)酵酵母染色體上的任意的標(biāo)記基因區(qū) 域，導(dǎo)入作為外源DNA的凝集性基因表達(dá)盒而制成的實(shí)用的凝集性醇發(fā)酵酵母和其育種方 法(專利文獻(xiàn)1)；獲取酵母的凝集性基因的、編碼與凝集性有關(guān)的蛋白區(qū)域的DNA，并將該 DNA導(dǎo)入啤酒酵母中來(lái)制備凝集性得到強(qiáng)化的酵母的方法(專利文獻(xiàn)2)；用于燃料用乙醇 生產(chǎn)的凝集性酵母的構(gòu)筑(非專利文獻(xiàn)1)等。這些已經(jīng)報(bào)道的轉(zhuǎn)化酵母，是將源于釀酒酵 母的凝集性基因?qū)雽儆卺劸平湍傅木祁愔圃煊媒湍付瞥傻摹Ａ硪环矫?，?duì)于在屬于與 釀酒酵母為不同屬的酵母中導(dǎo)入了源于釀酒酵母的凝集性基因的轉(zhuǎn)化酵母，尚未有報(bào)道， 并且對(duì)于源于釀酒酵母的凝集性基因在釀酒酵母以外的酵母中是否也能參與凝集性的調(diào) 節(jié)，完全不清楚。對(duì)于釀酒酵母，全基因組分析已經(jīng)完成，正在確定凝集性基因。涉及凝集性的FLO 基因群組中，有存在于1號(hào)染色體上的FLOl基因(非專利文獻(xiàn)2)、存在于8號(hào)染色體上的 FL05基因(非專利文獻(xiàn)3)、存在于5號(hào)染色體上的FL08基因(非專利文獻(xiàn)4)、存在于1號(hào) 染色體上的FL09基因(非專利文獻(xiàn)5)、存在于11號(hào)染色體上的FL010基因(非專利文獻(xiàn) 6)等。這些基因被認(rèn)為是具有與FLOl類似的堿基序列的凝集素樣蛋白質(zhì)。目前，從石油供給的問(wèn)題考慮，在世界范圍內(nèi)，正嘗試進(jìn)行使用來(lái)自生物資源(〃 ^ t-r 的能源來(lái)代替石油的探索。依賴于生物資源的新能源的一種有作為生物資源燃 料的生物乙醇。生物乙醇可以利用較多含有糖質(zhì)或淀粉質(zhì)的植物資源獲得。作為利用以生 物資源為原料的微生物來(lái)進(jìn)行醇生產(chǎn)的方法，公開(kāi)了將西谷椰子原木的粉碎物糖化，利用
3釀酒酵母進(jìn)行的乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)法(專利文獻(xiàn)3)；使用屬于釀酒酵母的酵母，由垃圾等廢 棄物生產(chǎn)燃料用醇的方法(專利文獻(xiàn)4)。在生物乙醇的生產(chǎn)中使用的酵母，優(yōu)選具有可與 生物資源的處理相對(duì)應(yīng)的耐熱性、具有與醇生產(chǎn)酵母同樣高的凝集性的酵母。馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)是具有耐熱性的酵母，由 Lertwattanasakul 以及山田等，確認(rèn)了醇脫S酶(alcohol dehydrogenase ；Adh)的表達(dá)， 所述醇脫氫酶與由糖向乙醇的轉(zhuǎn)換有關(guān)(非專利文獻(xiàn)7)。馬克斯克魯維酵母不僅可以產(chǎn)生 乙醇，而且由于蛋白質(zhì)生產(chǎn)率高，因而被認(rèn)為在工業(yè)生產(chǎn)中非常有用，然而現(xiàn)狀是，沒(méi)有一 般性地確立馬克斯克魯維酵母的轉(zhuǎn)化方法，這等的研究沒(méi)有進(jìn)展。因此，對(duì)于適于生物乙醇 的工業(yè)生產(chǎn)的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株，至今沒(méi)有任何報(bào)道。專利文獻(xiàn)1 專利第3040959號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 專利第3643404號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 特開(kāi)2007-195406號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 特開(kāi)2006-325577號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1 =Biotechnol Lett, 30 :97_102，2008非專利文獻(xiàn)2 Yeast, 9 :423_427，1993非專利文獻(xiàn)3 =Science, 265 :2077_2082，1994非專利文獻(xiàn)4 =Nature 387 78-81,1997非專利文獻(xiàn)5 :Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :3809_3813，1995非專利文獻(xiàn)6 =Nature 369 :371_378，1994非專利文獻(xiàn)7 =Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 :1170_82，200
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于，通過(guò)將外源的凝集性基因引入馬克斯克魯維酵母菌，提供適 于生物乙醇的工業(yè)生產(chǎn)，并具有耐熱性和凝集性的新型的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株，以及 提供上述轉(zhuǎn)化株的有效制備方法。本發(fā)明人等著眼于釀酒酵母的凝集性基因FLO作為用于賦予馬克斯克魯維酵母 凝集性的外源基因，制備了含有已知的表達(dá)啟動(dòng)子序列和源于釀酒酵母的FLO基因序列的 直鏈狀(線狀)DNA片段，來(lái)作為用于誘導(dǎo)FLO基因表達(dá)的FLO基因表達(dá)盒。將該線狀DNA 片段導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母菌，結(jié)果確認(rèn)能夠高效地得到馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株，同時(shí) 作為預(yù)料之外的結(jié)果，確認(rèn)上述轉(zhuǎn)化株的凝集性顯著提高，從而完成本發(fā)明。SP，本發(fā)明涉及[1]具有凝集性和耐熱性的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)轉(zhuǎn)化 株的制備方法，其特征在于，依次含有下述工序(A) (C) (A)在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的內(nèi)源性FLO基因的上游導(dǎo)入標(biāo)記基因序列和表達(dá)啟動(dòng)子序列來(lái)制備釀酒酵 母轉(zhuǎn)化株的工序；⑶由染色體DNA得到含有標(biāo)記基因序列、表達(dá)啟動(dòng)子序列和FLO基因序 列的DNA片段的工序，所述染色體DNA源于工序(A)中制備的釀酒酵母轉(zhuǎn)化株；(C)將工序 (B)中得到的DNA片段作為FLO基因表達(dá)盒導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母，制備馬克斯克魯維酵母 轉(zhuǎn)化株的工序；[2]根據(jù)上述[1]所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征在于，釀酒酵母的內(nèi)源性FLO基因是選自FLO1基因、FL05基因、FL09基因和FLO10基因中的1種以上 的FLO基因；[3]根據(jù)上述[1]或[2]所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征在 于，標(biāo)記基因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因；[4]根據(jù)上述[1] [3]中任一項(xiàng)所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其 特征在于，營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因是組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸('J > )、腺嘌 呤、色氨酸、精氨酸的至少1種的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因；[5]根據(jù)上述[4]所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征在于，營(yíng)養(yǎng) 缺陷型標(biāo)記基因是URA3基因；[6]根據(jù)上述[1] [5]中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，馬克斯克魯維酵 母是在組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸的至少1種的營(yíng)養(yǎng) 缺陷型基因中具有突變的馬克斯克魯維酵母突變體；[7]根據(jù)上述[1] [6]中任一項(xiàng)所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其 特征在于，表達(dá)啟動(dòng)子是3-磷酸甘油醛脫氫酶(TDH3)啟動(dòng)子；[8]根據(jù)上述[1] [7]中任一項(xiàng)所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其 特征在于，將線狀的DNA片段作為FLO基因表達(dá)盒導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母；[9]根據(jù)上述[1] [8]中任一項(xiàng)所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法， 其特征在于，馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株是RAK4299株(NITEBP-514)、RAK4300株(NITE BP-515)、RAK4301 株(NITE BP-516)或者 RAK4302 株(NITE BP-517)。另外本發(fā)明涉及[10]由上述[1] [8]中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的、具有凝集性和耐熱性的 馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株；[11]根據(jù)上述[10]所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株，其特征在于，其是RAK4299 株(NITE BP-514)、RAK4300 株(NITE BP-515)、RAK4301 株(NITE BP-516)或者 RAK4302 株 (NITE BP-517)。根據(jù)本發(fā)明，可以將馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化，來(lái)制備凝集性和耐熱性優(yōu)異的酵母， 能夠提供有效用于生物乙醇的工業(yè)生產(chǎn)的酵母。


[圖1]是表示在FLO基因上游插入源于PST106質(zhì)粒的TDH3啟動(dòng)子和URA3DNA片 段的示意圖。[圖2]是表示轉(zhuǎn)化用DNA片段的電泳結(jié)果的圖。(Lane1,6 =DNAladder, lane 2 源于 FL03，lane 3 源于 FL05，lane 4 源于 FL09，lane 5 源于 FL010)[圖3]是表示導(dǎo)入了轉(zhuǎn)化用DNA片段的釀酒酵母BY4700的染色體DNA(TF)、和沒(méi) 有導(dǎo)入的染色體DNA(WT)的電泳結(jié)果的圖。[圖4]是表示導(dǎo)入轉(zhuǎn)化用DNA片段所得到的4種類型釀酒酵母的染色體DNA中的 重組 FLO 基因的電泳結(jié)果的圖。(Lane 1,6 :DNA ladder, lane 2 :URA3-TDH3p_FL01，lane 3 :URA3-TDH3p-FL05, lane4 :URA3_TDH3p-FL09，lane 5 :URA3_TDH3p-FL010)[圖5]是表示相對(duì)于馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042和釀酒酵母BY4700的各轉(zhuǎn)化
5株的凝集性的圖。[圖6]是表示馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株在28°C和40°C下的凝集性的圖。[圖7]是表示對(duì)于溫度為40 50°C的熱休克的時(shí)間，相對(duì)于溫度的反應(yīng)時(shí)間的 上限和下限的圖。[圖8]是表示對(duì)于馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉(zhuǎn)化的結(jié)果的照片的圖。使 用25ng直鏈DNA的URA3片段，可以得到板面的轉(zhuǎn)化株數(shù)。[圖9]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉(zhuǎn)化效果中酵母細(xì)胞濃度的影響 的圖。[圖10]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉(zhuǎn)化效果中聚乙二醇(PEG)的分 子量和熱休克后的稀釋液的影響的圖。[圖11]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉(zhuǎn)化效果中DTT的影響的圖。[圖12]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉(zhuǎn)化效果中DNA片段大小的影響 的圖。[圖13]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042的轉(zhuǎn)化效果中熱休克溫度和時(shí)間的 影響的圖。[圖14]是表示馬克斯克魯維酵母DMKU3-1042為在使用了DNA片段的轉(zhuǎn)化中最有 效的菌株的圖。
具體實(shí)施例方式作為本發(fā)明的具有凝集性和耐熱性的酵母的制備方法，只要含有在耐熱性馬克斯 克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)中導(dǎo)入FLO基因表達(dá)盒的方法即可，沒(méi)有特別限 制。上述FLO基因只要是可賦予馬克斯克魯維酵母凝集性的FLO基因，可使用任意的基 因，可以優(yōu)選列舉例如全基因組序列得到解析的釀酒酵母的FLO基因，更具體地，可以優(yōu)選 例示釀酒酵母的FLOl基因、FL05基因、FL09基因、FL010基因等。對(duì)于釀酒酵母的FLO基 SWffE^ADDBJ (DNA Data Bank of Japan) > EMBL-EBI (European Molecular Biology Laboratory)、GenBank-NCBI (National Center for Biotechnology Information)、 S⑶(Saccharomyces Genome Database)等的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，可知其堿基序列信息。上述FLO基因表達(dá)盒只要可在馬克斯克魯維酵母中誘導(dǎo)FLO基因的表達(dá)即可，沒(méi) 有特別限制，優(yōu)選下述那樣的FLO基因表達(dá)盒，其含有用于有效選擇轉(zhuǎn)化株的標(biāo)記基因序 列，還以通過(guò)表達(dá)啟動(dòng)子控制FLO基因的表達(dá)這樣的方式來(lái)設(shè)計(jì)。上述選擇標(biāo)記基因可以 列舉抗生素等的耐藥性基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因等編碼受體(宿主)細(xì)胞中缺失產(chǎn)物的 基因等，上述耐藥性基因可以例示對(duì)于氨芐青霉素、博來(lái)霉素、卡那霉素、寡霉素等藥物的 耐藥性基因等，上述營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因可以例示HIS3、URA3、LEU2等，特別優(yōu)選使用營(yíng)養(yǎng) 缺陷型標(biāo)記基因。通過(guò)將選擇性培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因組合，可以選擇表達(dá)標(biāo)記基 因的細(xì)胞，例如當(dāng)將URA3的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因?qū)爰?xì)胞時(shí)，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以在不含有尿 嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，可進(jìn)行被賦予凝集性的菌株的選擇。另外，上述表達(dá)啟動(dòng)子沒(méi)有特別 限制，具體可以列舉例如3-磷酸甘油醛脫氫酶3 (TDH3、GAP)啟動(dòng)子、TDHl啟動(dòng)子、TDH2啟 動(dòng)子、PH05啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、GALl啟動(dòng)子、GAL10啟動(dòng)子、熱休克蛋白質(zhì)啟 動(dòng)子、MFa 1啟動(dòng)子、CUPl啟動(dòng)子等，這些啟動(dòng)子序列可以是源于生物體的基因組DNA序列，也可以是利用化學(xué)方法等，人工得到的DNA序列。用于導(dǎo)入FLO基因表達(dá)盒進(jìn)行轉(zhuǎn)化的馬克斯克魯維酵母(夕X《口 4七 ^ · ^ ^ 5 )菌體，優(yōu)選使用作為標(biāo)記的基因突變的突變體。獲取突變基因的方法沒(méi) 有特別限制，可以使用現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行。作為利用了 UV照射的方法，例如有Hashimoto 等的方法(Applied andEnvironmental Microbiology, 71 (1) :312_319，2005)。在該方法 中，對(duì)于菌體生長(zhǎng)的板上的酵母株，從距離35cm處照射UV 20秒，得到0. 05 0. 2%的突 變體。根據(jù)該方法，可以得到組氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、尿嘧啶(Ura)、蛋 氨酸(Met)、色氨酸(Tri)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。或者，還有下述的方法將基因破壞盒載 體(Gene Disruption Cassette Vector)等具有與靶基因同源的堿基序列、不能作為基因 發(fā)揮功能的DNA導(dǎo)入細(xì)胞中，進(jìn)行同源重組、使其不活化的方法(日本特開(kāi)2001-46053號(hào) 公報(bào))。當(dāng)進(jìn)行無(wú)法目測(cè)表達(dá)的基因的突變時(shí)，需要導(dǎo)入標(biāo)記基因，以能夠通過(guò)細(xì)胞的藥物 (抗生素等)感受性試驗(yàn)、細(xì)胞的繁殖速度、酶活性試驗(yàn)、光學(xué)方法或營(yíng)養(yǎng)缺陷試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行 觀察。如上述那樣，作為使用了 FLO基因表達(dá)盒的本發(fā)明的酵母制備方法，所述FLO基因 表達(dá)盒含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因序列和源于釀酒酵母的FLO基因序列，且可利用上述表達(dá) 啟動(dòng)子控制上述FLO基因的表達(dá)這樣來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)，可以列舉下述制備方法，其依次含有下 述工序(A) (C) =(A)在釀酒酵母的內(nèi)源性FLO基因的上游導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因序列 和表達(dá)啟動(dòng)子序列來(lái)制備釀酒酵母轉(zhuǎn)化株的工序；(B)由染色體DNA得到含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型 標(biāo)記基因序列、表達(dá)啟動(dòng)子序列和FLO基因序列的DNA片段的工序，所述染色體DNA源于工 序㈧中制備的釀酒酵母轉(zhuǎn)化株；(C)將工序⑶中得到的DNA片段作為FLO基因表達(dá)盒 導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因具有突變的馬克斯克魯維酵母突變體，來(lái)制備馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化 株的工序，所述營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因?qū)?yīng)于在上述DNA片段中含有的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因。在上述工序(A)中，釀酒酵母轉(zhuǎn)化株，可以通過(guò)在營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因發(fā)生突變的釀 酒酵母菌株中導(dǎo)入含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因序列、源于釀酒酵母的FLO基因序列的轉(zhuǎn)化用 DNA片段來(lái)制備，作為上述營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因發(fā)生突變的釀酒酵母菌株，可以使用市售的尿 嘧啶缺陷型基因突變的釀酒酵母BY4700株；尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸的缺陷型基因突變的 釀酒酵母BY4740株；組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶的缺陷型基因突變的釀酒酵母BY4743株；或 I^ig Hashimoto ^ ^iTj ^ (Applied and EnvironmentalMicrobiology, 71(1) 312-319, 2005)制備的尿嘧啶要求性缺陷型基因突變的馬克斯克魯維酵母RAK3605等。另外，在上 述轉(zhuǎn)化用DNA片段的制備中，基于釀酒酵母FLO基因的序列信息，可以使用由從起始密碼子 ATG起、由含有ATG在內(nèi)、直至第40個(gè)堿基的序列構(gòu)成的DNA片段，例如，作為包含40個(gè)堿 基的DNA片段的堿基序列，源于FLOl基因時(shí)可以列舉atgacaatgcctcatcgctatatgtttttgg cagtcttta(Seq. No.序歹丨J編號(hào) 1),源于 FL05 基因時(shí)可以歹丨」舉 atgacaattgcacaccactgcatat ttttggtaatcttgg(Seq. No. 2),源于 FL09 基因時(shí)可以歹丨」舉 atgtctctggcacattattgtttactac tagccatcgtca (Seq. No. 3),源于 FL010 基因時(shí)可以歹Ij 舉 atgcctgtggctgctcgatatatattttt gaccggcctat(Seq. No. 4)等。將基于這些FLO基因的堿基序列信息制備的DNA片段退火， 插入到具有表達(dá)啟動(dòng)子序列和營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因序列的質(zhì)粒中，通過(guò)利用PCR擴(kuò)增所需 區(qū)域，可以得到FLO基因表達(dá)盒用的DNA序列。上述具有表達(dá)啟動(dòng)子序列和營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo) 記基因序列的質(zhì)粒沒(méi)有特別限制，可以優(yōu)選列舉質(zhì)粒URA3-TDH3p (稱為“pST106”)，其根據(jù)Turgeon等的方法(Plasmid51 =24-36,2004)制備，具有TDH3p作為表達(dá)啟動(dòng)子，并具有尿
嘧啶缺陷型基因作為營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因。在基因突變株中導(dǎo)入轉(zhuǎn)化用DNA片段的方法，可以使用導(dǎo)入DNA片段的一般的轉(zhuǎn) 化方法?？梢允褂美缃雍戏ā㈦姶┛追?、感受態(tài)細(xì)胞法、微注射法、粒子炮法等任意的方 法。另外，也可以利用赤田等的方法(特開(kāi)2005-269920號(hào)公報(bào))，在含有堿金屬離子和聚 乙二醇的培養(yǎng)基中進(jìn)行熱休克，而導(dǎo)入轉(zhuǎn)化用DNA片段。在上述工序(A)中，作為使用了尿嘧啶缺陷型基因突變的釀酒酵母BY4700株的 釀酒酵母轉(zhuǎn)化株的例子，可以列舉導(dǎo)入了 URA3-TDH3p-FL0401的釀酒酵母RAK3977株、導(dǎo) 入了 URA3-TDH3p-FL0405 的釀酒酵母 RAK3979 株、導(dǎo)入了 URA3_TDH3p-FL0409 的釀酒酵母 RAK3981株、或?qū)肓?URA3-TDH3p-FL04010的釀酒酵母RAK3983株等利用以下實(shí)施例制備 的轉(zhuǎn)化株。在上述工序(B)中，作為由源于工序(A)制備的釀酒酵母轉(zhuǎn)化株的染色體DNA、來(lái) 得到編碼FLO基因表達(dá)盒的DNA片段的方法，可以列舉下述方法，即，對(duì)于上述釀酒酵母轉(zhuǎn) 化株的染色體DNA，用使用了 SDS(月桂基硫酸鈉)溶液等的通常的方法進(jìn)行裂解 攪拌 提 取 離心分離的操作，由此進(jìn)行純化，將經(jīng)純化的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)的方法。 在上述PCR反應(yīng)時(shí)，通過(guò)使用為了擴(kuò)增含有FLO基因表達(dá)盒序列的DNA序列而設(shè)計(jì)的引物， 可以得到編碼FLO基因表達(dá)盒的DNA片段，所述FLO基因表達(dá)盒序列含有營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 基因序列、表達(dá)啟動(dòng)子序列、和FLO基因序列。在上述(C)中，只要是在染色體基因上具有突變的馬克斯克魯維酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型 突變體，所述染色體基因?qū)?yīng)于在上述FLO基因表達(dá)盒中含有的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因，則 可以使用任意的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因突變的馬克斯克魯維酵母突變體，可以選擇組氨酸、亮氨 酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸等營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因突變的馬克斯克魯 維酵母突變體。例如，如以下實(shí)施例所示，當(dāng)使用URA3-TDH3p-FL0基因片段作為FLO基因 表達(dá)盒時(shí)，可以使用尿嘧啶缺陷型基因突變的馬克斯克魯維酵母菌株的馬克斯克魯維酵母 RAK3605株來(lái)制備。作為使用本發(fā)明的制備方法制備的、具有凝集性和耐熱性的酵母，沒(méi)有特別限制， 具體可以列舉例如，在尿嘧啶缺陷型基因突變的馬克斯克魯維酵母RAK3605株中，導(dǎo)入源 于釀酒酵母RAK3977株的FLO基因表達(dá)盒(URA3_TDH3p-FL01)而成的馬克斯克魯維酵 母RAK4299株(保藏號(hào)NITE BP-514)，導(dǎo)入源于釀酒酵母RAK3979株的FLO基因表達(dá)盒 (URA3-TDH3p-FL05)而成的馬克斯克魯維酵母RAK4300株(保藏號(hào)NITE BP-515)，導(dǎo)入 源于釀酒酵母RAK3981株的FLO基因表達(dá)盒(URA3_TDH3p-FL09)而成的馬克斯克魯維酵 母RAK4301株(保藏號(hào)NITE BP-516)，導(dǎo)入源于釀酒酵母RAK3983株的FLO基因表達(dá)盒 (URA3-TDH3p-FL010)而成的馬克斯克魯維酵母RAK4302株(保藏號(hào)NITE BP-517)等。并 且，上述4種馬克斯克魯維酵母突變株保藏于獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)(獨(dú)立 行政法人製品評(píng)価技術(shù)基盤機(jī)構(gòu))專利微生物保藏中心(地址千葉縣木更津市上總鐮足 2-5-8，千葉県木更津市如Τ ^鎌足2-5-8)。在本發(fā)明中，作為用于選釋轉(zhuǎn)化的菌株的培養(yǎng)基，可以是通常使用的酵母培養(yǎng)用 培養(yǎng)基，例如可以使用實(shí)施例中列舉的YPD培養(yǎng)基(1%酵母提取物、2%胨、2%葡萄糖)、ΥΜ 培養(yǎng)基(0.3%酵母提取物、0.3%麥芽提取物、0.5%胨、葡萄糖)。對(duì)于培養(yǎng)基的碳源、氮源的種類、堿金屬離子等在培養(yǎng)基中的添加物，只要能夠有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)化株的選擇，則可 以是任何培養(yǎng)基。對(duì)于培養(yǎng)，在25 33°C、優(yōu)選28 30°C的溫度下進(jìn)行1 5天、優(yōu)選 2 3天。下面，列舉實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。實(shí)施例1<過(guò)表達(dá)啟動(dòng)子TDH3p向釀酒酵母的FLO基因的上游中的插入>A. URA3-TDH3p 片段的擴(kuò)增以具有作為標(biāo)記基因的URA3基因序列、和作為表達(dá)啟動(dòng)子序列的TDH3的pST106 質(zhì)粒作為模板，使用表1所示的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，制備釀酒酵母轉(zhuǎn)化用的DNA片段。上 述引物以插入PST106質(zhì)粒的URA3-TDH3p序列的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)，此外，將釀酒酵母的FL01、 FL05、FL09或FL010基因上游序列分別以含有40個(gè)堿基的方式進(jìn)行設(shè)計(jì)。PCR反應(yīng)液是 用各自為0. 2μ 1的1對(duì)0. 2μΜ的引物、KOD plus緩沖液1. 0 μ 1 (Τ0Υ0Β0社制)、0. 2mM dNTPsl. 0 μ 1 (Τ0Υ0Β0 社制)、0· 2mMMgS040. 8 μ 1 (Τ0Υ0Β0 社制)、0· 4ng/ μ 1 pST106 質(zhì)粒 0. 4μ 1、K0D Plus DNA聚合酶0. 2 μ 1 (Τ0Υ0Β0社制)、滅菌水6. 2 μ 1制成的、總體積為10 μ 1 的溶液。反應(yīng)首先在94°C下加熱1分鐘，然后在94°C下進(jìn)行20秒的熱變性，在55°C下退 火30秒鐘，在68°C下進(jìn)行3分鐘的延伸反應(yīng)，以上反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。結(jié)果得到分 別具有FLOl、FL05、FL09或FL010基因上游的同源序列的DNA片段URA3_TDH3p-FL0401、 URA3-TDH3p-FL0405、URA3_TDH3p-FL0409、URA3_TDH3p-FL04010 (以下，有時(shí)將這些 DNA 片段統(tǒng)稱為 URA3-TDH3p-FL040s)(圖 1、2)。[表 1]
制備的轉(zhuǎn)化用DNA片段 (URA3-TDH3p-FL040s)引物-I引物-IIURA3-TDH3p-FL0401FL01-401 ( Seq.No.5) tatttltaattcllglcaccagtaa acagaacalccaaaaggcgcgcccgFL01-402 ( Seq.No.6) taaagactgccaaaaacatatagcg atgaggcaltgtcattttatgtgatURA3-TDH3p-FL0405FL05-401 ( Seq.No.7) caaatgattttclttaaattgatta gcac cac1aaaaaaaggcgcgcccgFL05-402 (Seq.No.8) ccaagattaccaaaaatatgcagtg gtgtgcaattgtcattttatgtgatURA3-TDH3p-FL0409FL09-401 (Seq.No.9) gcaatttaaaaagaacaattgtaca ataaaagccccaaaaggcgcgcccgFL09-402 (Seq.No.10) tgacgatggclaglagtaaacaati atgtgccagagacat1丨tatgtgaURA3-TDH3p-FL04010FL010-401 (Seq.No.ll) tttgttttagggtgcttaatcaaag aacaacaaataaaaaggcgcgcccgFL010-402 (Seq.No.12) ataggccggtcaaaaatatatatci agcagccacaggcattt tatgtgat B. URA3-TDH3p序列向釀酒酵母中的導(dǎo)入
將釀酒酵母BY4700株在放入了 2ml YPD培養(yǎng)基(1 %酵母提取物、2%聚胨、2%葡 萄糖)的試管中接種，在28°C、150rpm的條件下培養(yǎng)一夜。將培養(yǎng)液Iml移入加入了 YPD 培養(yǎng)基9ml的培養(yǎng)皿，在28°C、150rpm的條件下培養(yǎng)5小時(shí)。培養(yǎng)液以8500rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn) 行3分鐘的離心分離，收集細(xì)胞，用滅菌蒸餾水清洗一次。殘?jiān)脺缇麴s水100 μ 1溶解。 轉(zhuǎn)化用的溶液通過(guò)將115μ 1 60%的PEG3350、5y 1 4M的醋酸鋰、15μ 1蒸餾水混合來(lái)制 備。將細(xì)胞裂解液50 μ 1移入加入了轉(zhuǎn)化用緩沖液135 μ 1的微型離心分離用管中，加入鮭 魚(yú)DNAlO μ 1和上述A制備的4種DNA片段(URA3_TDH3p-FL040s)各5 μ 1，使用攪拌機(jī)充 分?jǐn)嚢?0秒鐘。將管在42°C下進(jìn)行40分鐘的熱處理。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞溶液200 μ 1在選 擇培養(yǎng)基上攤開(kāi)，在28°C下培養(yǎng)2-3天。隨機(jī)采集在缺少尿嘧啶的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞菌 落，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離。使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并在4°C下保存。C.利用了 PCR的釀酒酵母轉(zhuǎn)化株的確認(rèn)l.PCR 用 DNA 的制備將上述B制備的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在放入了 Iml YPD培養(yǎng)基的12孔板的孔中接種，在 28°C下培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)后，添加YPD培養(yǎng)基1ml，再在28°C下培養(yǎng)4小時(shí)。采集培養(yǎng)液 1. 5ml，轉(zhuǎn)移至微型離心分離用管中，以12000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行3分鐘的離心分離后，除去上 清液，用滅菌蒸餾水將殘?jiān)逑匆淮巍３フ麴s水，將7. 5 μ 1的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有2. 5 μ 1 1% SDS的微型離心分離用管中，使用攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢?0秒。以12000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行3分 鐘的離心分離，取上清液。上清液用于菌落PCR。2.菌落 PCR菌落PCR使用如表2所示的引物進(jìn)行。PCR反應(yīng)液包括0.4μΜ的1對(duì)引物各 0. 4 μ 1、KOD Dash 緩沖液 1. 0 μ 1 (Τ0Υ0Β0 社制)、0· 2mMdNTPsl. 0μ 1 (Τ0Υ0Β0 社制)、KOD Dash DNA聚合酶0. 2 μ 1 (Τ0Υ0Β0社制)、滅菌水4. 0 μ 1，以上述制備的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的染色體 DNA5. 0 μ 1作為模板，在總體積為10 μ 1的液體中進(jìn)行PCR。反應(yīng)首先在94°C下加熱1分 鐘，然后在94°C下進(jìn)行20秒鐘的熱變性，在60°C下退火2秒鐘，在74°C下進(jìn)行4分鐘的延 伸反應(yīng)，上述反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行30次循環(huán)。結(jié)果確認(rèn)，如圖3所示，可制備在釀酒酵母BY4700 株中導(dǎo)入了 URA3-TDH3p-FL040s的轉(zhuǎn)化株。這里制備的4種釀酒酵母的轉(zhuǎn)化株，是在內(nèi)源 性的？11)1111)5、？11)9或？11)10基因的上游含有作為選擇標(biāo)記的URA3基因序列、和TDH3啟 動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)化株。[表 2]
權(quán)利要求
具有凝集性和耐熱性的馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征在于，依次含有下述工序(A)～(C)(A)在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的內(nèi)源性FLO基因的上游導(dǎo)入標(biāo)記基因序列和表達(dá)啟動(dòng)子序列來(lái)制備釀酒酵母轉(zhuǎn)化株的工序；(B)由染色體DNA得到含有標(biāo)記基因序列、表達(dá)啟動(dòng)子序列、和FLO基因序列的DNA片段的工序，所述染色體DNA源于工序(A)中制備的釀酒酵母轉(zhuǎn)化株；(C)將工序(B)中得到的DNA片段作為FLO基因表達(dá)盒導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母，制備馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征在于，釀酒酵 母的內(nèi)源性FLO基因是選自FLO1基因、FL05基因、FL09基因、和FLO10基因中的1種以上 的FLO基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征在于，標(biāo)記 基因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征 在于，營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因是組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精 氨酸的至少1種的營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征在于，營(yíng)養(yǎng)缺 陷型標(biāo)記基因是URA3基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，馬克斯克魯維酵母是在 組氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、賴氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸的至少1種的營(yíng)養(yǎng)缺陷型 基因中具有突變的馬克斯克魯維酵母突變體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征 在于，表達(dá)啟動(dòng)子是3-磷酸甘油醛脫氫酶(TDH3)啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征 在于，將線狀的DNA片段作為FLO基因表達(dá)盒導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株的制備方法，其特征 在于，馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株是RAK4299株(NITEBP-514)、RAK4300株(NITE BP-515)、 RAK4301 株(NITE BP-516)、或者 RAK4302 株(NITE BP-517)。
10.由權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的、具有凝集性和耐熱性的馬克斯 克魯維酵母轉(zhuǎn)化株。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株，其特征在于，其是RAK4299株 (NITE BP-514)、RAK4300 株(NITE BP-515)、RAK4301 株(NITE BP-516)、或者 RAK4302 株 (NITE BP-517)。全文摘要
通過(guò)將外源的凝集性基因?qū)腭R克斯克魯維酵母菌，提供適于生物乙醇的工業(yè)生產(chǎn)的、具有耐熱性和凝集性的新型馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株，以及該轉(zhuǎn)化株的有效制備方法。作為用于賦予馬克斯克魯維酵母凝集性的外源基因，本發(fā)明釀酒酵母的凝集性基因FLO，制備了含有已知表達(dá)啟動(dòng)子序列和源于釀酒酵母的FLO基因序列的線狀DNA片段。將該線狀DNA片段導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母菌，結(jié)果，確認(rèn)能夠高效地得到馬克斯克魯維酵母轉(zhuǎn)化株，同時(shí)作為預(yù)料之外的結(jié)果，確認(rèn)上述轉(zhuǎn)化株的凝集性顯著提高，從而完成了本發(fā)明。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101983240SQ20098010751
公開(kāi)日2011年3月2日 申請(qǐng)日期2009年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月18日
發(fā)明者B·M·A·阿布戴樂(lè)-巴納特, S·農(nóng)克朗, 星田尚司, 赤田倫治 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人山口大學(xué)