專利名稱：一種用于綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胚胎干細胞的生物技術(shù)，采用機械剝離和無血清分離培養(yǎng)技術(shù)，為轉(zhuǎn) 基因綿羊的生產(chǎn)提供堅實的技術(shù)平臺。
背景技術(shù)：
胚胎干細胞(Embryonic stem cell，ESC)，是由哺乳動物著床前囊胚期內(nèi)細胞團 (inner cell mass, ICM)，經(jīng)體外特定培養(yǎng)環(huán)境選擇、適應后，獲得的具有保持未分化狀態(tài) 和無限增殖能力的細胞系，其特定的生物學特性能夠使其與ICM重新整合，并參與到胚胎 發(fā)育的全部過程中。采用ESC克隆技術(shù)，其整合效率遠遠高于傳統(tǒng)核移植技術(shù)，可在短期內(nèi) 生產(chǎn)較多的具有遺傳同質(zhì)性的動物，免去后裔測定，大幅度提高良種家畜的繁殖效率。同時 利用ESC細胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜，將會大幅度提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進動物生長，提高畜產(chǎn)品產(chǎn) 量，并可在細胞水平對家畜胚胎進行性別、多胎、產(chǎn)肉、產(chǎn)毛性能的早期選擇，縮短家畜育種 時間。目前，國內(nèi)外在綿羊ESC的研究中，普遍采用常規(guī)分離培養(yǎng)體系，借助小鼠胚胎干 細胞(Mouse Embryonic Stem Cell, mESC)、人胚胎干細胞(HumanEmbryonic Stem Cell, hESC)的成功經(jīng)驗，將影響mESC、hESC增殖、分化的因素，如飼養(yǎng)層細胞、條件培養(yǎng)基、細 胞因子、生長因子、激素、胎牛血清和血清提取物等進行有機組合，依照mESC、hESC建系標 準，直接應用到綿羊ESC建系研究中，但截止目前為止，綿羊ESC研究尚未獲得實質(zhì)性突 破，普遍存在建系效率低下等問題，且最高僅獲得了第8代ESC。關(guān)于綿羊胚胎干細胞的 相關(guān)研究及所獲ESC代數(shù)報道檢索有①白昌明.生物工程學報.2008《不同培養(yǎng)體系對 綿羊類胚胎干細胞分離、傳代的影響》oESC最高代數(shù)P8 ；②Zhu，Sun etal. Zygote. 2007 ((Ovine (Ovis aries)blastula from an in vitro productionsystem and isolation of primary embryonic stem cells〉〉oESC 最高代數(shù) P3 ；③ Dattena，Chessa et al.Mol Reprod Dev. 2006《solation，culture，andcharacterization of embryonic cell lines from vitrified sheepblastocysts》oESC 最高代數(shù) P5 ；④ Talbot，Rexroad et al.Mol Reprod Dev. 1993 ((Alkaline phosphatase staining of pig and sheep epiblast cells inculture》oESC 最高代數(shù) PO ；⑤ Handyside, Hooper et al. Development Genesand Evolution.1987 《Towards the isolation of embryonal stem cell linesfrom the she印》oESC最高代數(shù)PI。這些都極大制約了 ESC技術(shù)在綿羊遺傳育種中的研究與應用。 本發(fā)明以此為切入點，結(jié)合目前國內(nèi)外ESC研究最新趨勢，采用機械剝離和無血清分離培 養(yǎng)方法，具有較強的科學性、實踐性及應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于綿羊胚胎干細胞(ESC)的機械剝離和無血清分 離培養(yǎng)技術(shù)，使得綿羊ESC原代集落形成率提高至33% (14/42)，體外培養(yǎng)可傳至16代，拓 展了 ESC研究領(lǐng)域。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種用于綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法， 將體外培養(yǎng)的綿羊囊胚，采用Tyrode's Solution去除透明帶后，接種于自制的綿羊胚胎干 細胞無血清培養(yǎng)液中；用針頭固定內(nèi)細胞團，置于38.6°C、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，培 養(yǎng)中每48小時半量更換培養(yǎng)液，pH為6. 8-7. 2，原代培養(yǎng)7-9天；之后每3_4天采用常規(guī)機 械法按1 2-1 4傳代一次，即綿羊胚胎干細胞體外培養(yǎng)可傳至16代。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，無血清培養(yǎng)液的配制D-MEM/ F-12+80ng/mL bFGF+3 μ M CHIR99021+10μ L/mL Ν2+20 μ L/mL Β27+10 μ L/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0. 2mM β -Mercaptoethanol。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，采用32號針頭將裸胚固定于培 養(yǎng)皿底部，同時應盡量避免損傷囊胚內(nèi)細胞團，以最大限度的將裸胚滋養(yǎng)層細胞剝離。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，裸胚接種數(shù)量因以45-60枚/組為宜。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，該方法能使綿羊的胚胎干細胞原 代集落形成率由0% (0/129)提高至33% (14/42)。所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，藥劑的選用均為市售產(chǎn)品。本發(fā)明研究機理包括綿羊囊胚原代接種與綿羊ESC無血清培養(yǎng)的兩項技術(shù)環(huán)節(jié)綿羊囊胚原代接種傳統(tǒng)綿羊囊胚內(nèi)細胞團的分離，主要采用免疫外科手術(shù)法及 酶法等實驗手段剝離囊胚滋養(yǎng)層細胞，但由于囊胚經(jīng)過長時間的免疫反應及酶處理操作 后，用于綿羊ESC建系的內(nèi)細胞團，不同程度的受到了外源機械損傷，從而影響了后期綿羊 ESC的建系效率；并且無法根本性解決囊胚內(nèi)細胞團貼壁的關(guān)鍵技術(shù)問題，而這就最終導 致綿羊ESC原代集落形成率較低。本發(fā)明從導致綿羊ESC原代建系效率低主要誘因出發(fā)， 經(jīng)過大量實驗室驗證發(fā)現(xiàn)，采用32號注射器針頭，將去除透明帶的裸胚固定于培養(yǎng)皿底部 (同時應盡量避免損傷囊胚內(nèi)細胞團，及最大限度的將裸胚滋養(yǎng)層細胞剝離)，能顯著改善 綿羊囊胚內(nèi)細胞團在無飼養(yǎng)層、無血清培養(yǎng)體系下的原代克隆形成率，該體系下其綿羊ESC 原代集落形成率由0% (0/129)提高至33% (14/42)。綿羊ESC無血清培養(yǎng)體系的建立結(jié)合國際最新ESC研究趨勢，采用無血清培養(yǎng) 體系，參考小鼠胚胎干細胞(Mouse Embryonic Stem Cell, mESC)、人胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cell,hESC)的全能性維持機制，將影響mESC、hESC增殖、分化的因素進行 分類與組合，先后從維持小鼠、人胚胎干細胞全能性的關(guān)鍵信號調(diào)控通路LIF-STAT3途徑、 MAPK-ERK途徑、FGF途徑、Wnt途徑入手，對原代獲得的綿羊ESC集落從2種培養(yǎng)液(DMEM/ F12,KnockOut DMEM)、4 種主添加成分(FBS、Serum R印lacement、N2、B27)、4 種小分子化合 物(SU5402、PD0325901、CHIR99021)、4 種添加因子(mLIF、hLIF、bFGF、EGF)進行了大量優(yōu) 化組合試驗，累計使用綿羊體外囊胚2100多枚。研究發(fā)現(xiàn)，當添加bFGF，激活FGF途徑時 (圖IbFGF組)，能顯著促進綿羊ESC的自我更新，此時綿羊ESC倍增時間為2. 0天；與之相 反，加入FGF受體抑制劑，阻斷FGF途徑時(圖ISU組)，綿羊ESC體外倍增時間延長為3. 7 天，自我更新受到明顯抑制，因此篩選對比后，所得結(jié)論為綿羊ESC自我更新的調(diào)控途徑為 FGF途徑，這也為進一步建立綿羊ESC無血清培養(yǎng)體系提供了科學依據(jù)。其次，我們又對綿羊ESC無血清培養(yǎng)體系中，bFGF的添加量進行了一系列對比試 驗。研究發(fā)現(xiàn)，該無血清培養(yǎng)體系下，綿羊ESC對bFGF的添加量存在量性需求(見圖2)當添加10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL bFGF時，綿羊ESC自我更新有所改善，高于對照組(見 圖2)；當bFGF添加量提高至80ng/mL、100ng/mL時，綿羊ESC自我更新進一步得到顯著提 高，且二者效果相當(見圖2)。因此我們認為該無血清培養(yǎng)體系下，bFGF的最佳添加量應 在 80ng/mLo本發(fā)明的技術(shù)效果(1)用于綿羊ESC建系研究的體外培養(yǎng)囊胚，應以A級囊胚(內(nèi)細胞團大、且明顯) 為宜；B級、C級囊胚不易形成原代集落，且原代集落形成率偏低；采用Tyrode’ s Solution 去除透明帶的時間尤為重要，應時刻觀察透明帶的變形程度；處理時間長，易導致囊胚腔塌 陷，為后續(xù)機械法剝離滋養(yǎng)層細胞造成一定難度；(2)裸胚接種數(shù)量因以45-60枚/組左右為宜；接種數(shù)量過低，會因旁分泌途徑缺 失，導致綿羊ESC原代集落形成率偏低；(3)原代接種后，應隔日觀察內(nèi)細胞團生長情況，并及時采用32號針頭剝離接種 過程中殘留的滋養(yǎng)層細胞；殘留的滋養(yǎng)層細胞，其生長優(yōu)勢遠遠高于內(nèi)細胞團中的細胞，滋 養(yǎng)層細胞過度增殖是導致原代集落形成率偏低，及培養(yǎng)液極易偏酸的主要誘因；(4)原代接種后，每48小時須半量更換ESC培養(yǎng)液；及時更換培養(yǎng)液，能有效將培 養(yǎng)體系pH維持在6. 8-7. 2之間，對綿羊ESC長期增殖具有十分重要的作用；(5)每次胚胎干細胞體外操作時間不宜過長；時間過長，對綿羊ESC長期增殖具有 不可逆的損傷作用。本發(fā)明以提高綿羊囊胚內(nèi)細胞團原代集落形成率及篩選綿羊ESC自我更新的關(guān) 鍵調(diào)控因子為突破口，通過精心設(shè)計與方法實踐，采用機械剝離和無血清分離培養(yǎng)技術(shù)，使 得綿羊ESC原代集落形成率達33 % (14/42)，體外培養(yǎng)可傳至16代，該研究成果為通過ESC 技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因綿羊提供了堅實有力的技術(shù)平臺，拓展了 ESC研究領(lǐng)域，彰顯技術(shù)進步。


下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明。附圖1為不同信號通路對綿羊ESC維持自我更新的效果生長圖；如圖，所示Control——對照組，基礎(chǔ)培養(yǎng)液；bFGF——基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入bFGF，激活FGF途徑；SU——基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入SU5402，抑制FGF途徑；hLIF、mLIF——基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入hLIF、mLIF,激活LIF-STAT3途徑；PD——基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入PD0325901，抑制ERK途徑。附圖2為bFGF途徑對綿羊ESC自我更新效果生長圖；附圖3為綿羊ESC原代接種7天的放大顯微片(40x)；附圖4為綿羊ESC原代接種7天的放大顯微片(IOOx)；附圖5為綿羊ESC接種9天的第1代的放大顯微片(IOOx)；附圖6為綿羊ESC接種12天的第2代的放大顯微片(IOOx)；附圖7為綿羊ESC接種19天的第5代的放大顯微片(IOOx)；附圖8為綿羊ESC接種30天的第8代的放大顯微片(IOOx)；
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附圖9為綿羊ESC接種35天的第10代放大顯微片(IOOx)；附圖10為綿羊ESC接種54天的第16代的放大顯微片(IOOx)；附圖11為綿羊第9代ESC堿性磷酸酶活性檢測片，紅色為陽性(IOOx)；附圖12為綿羊第14代ESC堿性磷酸酶活性檢測片，紅色為陽性(IOOx)。
具體實施例方式下面將結(jié)合實例就發(fā)明進一步的說明。實施例分離培養(yǎng)方法步驟收集綿羊體外培養(yǎng)獲得的囊胚42枚，采用Tyrode'sSolution 去除透明帶后，將裸胚接種于該發(fā)明所提供的綿羊ESC無血清培養(yǎng)液中，并采用32號針 頭將裸胚固定于培養(yǎng)皿底部，同時應盡量避免損傷囊胚內(nèi)細胞團，及最大限度的將裸胚滋 養(yǎng)層細胞剝離，之后置于38. 6°C、5 % CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，原代培養(yǎng)時間7天(見 圖3、4原代集落)，之后每4天采用常規(guī)機械法按1 2-1 4傳代一次，培養(yǎng)期間每48 小時半量更換培養(yǎng)液。并對獲得的第9代、第14代綿羊ESC進行常規(guī)堿性磷酸酶染色， 對其體外長期培養(yǎng)過程中干細胞特性是否丟失加以判定(具體檢測方法見Leukocyte AlkalinePhosphatase Kit 說明，紅色為陽性)。試劑的配制D-MEM/F-12 (I η ν i tr ο gen , 1 1 3 2 00 3 3) , bFGF (Sigma, F0291-25UG), N2Supplement(Invitrogen,17502048)， B27 Supplement (Invitrogen,17504044)， CHIR99021(Stemolecule,04-0004)， NEAA(Invitrogen,11140050)， L-Glutamine(Sigma, G8540-100G), β -Mercaptoethanol(Amresco,0482-100ml), Tyrode' s Solution(Sigma, T1788-100ML), Leukocyte AlkalinePhosphatase Kit (Sigma，86R)。(上述試劑均為市售 產(chǎn)品)綿羊ESC 培養(yǎng)液D-MEM/F-12+80ng/mL bFGF+3 μ M CHIR99021+10 μ L/ mLN2+20μ L/mL Β27+10μ L/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0. 2mMβ -Mercaptoethanol。實驗結(jié)果原代接種7天后，分離原代集落14枚，原代集落形成率33% (14/33)(見圖3、4原 代集落)；采用綿羊ESC無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)9天、12天、19天、30天、35天、54天后獲得第1、 2、5、8、10、16代綿羊ESC細胞(見圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10)；對獲得的第9代、第14 代綿羊ESC進行常規(guī)堿性磷酸酶染色，檢測結(jié)果為強陽性(見圖11、圖12)，表明該無血清 培養(yǎng)體系下，長期培養(yǎng)獲得的細胞堿性磷酸酶活性較高，細胞具備胚胎干細胞的典型特征。
權(quán)利要求
一種用于綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，其特征在于將體外培養(yǎng)的綿羊囊胚，采用Tyrode’s Solution去除透明帶后，接種于自制的綿羊胚胎干細胞無血清培養(yǎng)液中；用針頭固定內(nèi)細胞團，置于38.6℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)中每48小時半量更換培養(yǎng)液，pH為6.8 7.2，原代培養(yǎng)7 9天；之后每3 4天采用常規(guī)機械法按1∶2 1∶4傳代一次，即綿羊胚胎干細胞體外培養(yǎng)可傳至16代。
2.按照權(quán)利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，其特征在于無 血清培養(yǎng)液的配制D-MEM/F-12+80ng/mL bFGF+3 μ M CHIR99021+10 μ L/mL Ν2+20 μ L/mL Β27+10 μ L/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0. 2mM β-Mercaptoethanol。
3.按照權(quán)利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，其特征在于采用 32號針頭將裸胚固定于培養(yǎng)皿底部，同時應盡量避免損傷囊胚內(nèi)細胞團，以最大限度的將 裸胚滋養(yǎng)層細胞剝離。
4.按照權(quán)利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，其特征在于裸胚 接種數(shù)量因以45-60枚/組為宜。
5.按照權(quán)利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，其特征在于該方 法能使綿羊的胚胎干細胞原代集落形成率由0% (0/129)提高至33% (14/42)。
6.按照權(quán)利要求1所述的綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，其特征在于藥劑 的選用均為市售產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種用于綿羊胚胎干細胞的無血清分離培養(yǎng)方法，將體外培養(yǎng)的綿羊囊胚，采用Tyrode’s Solution去除透明帶后，接種于綿羊胚胎干細胞無血清培養(yǎng)液中，并用針頭固定，置于38.6℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)中每48小時半量更換培養(yǎng)液，pH為6.8-7.2，原代培養(yǎng)7-9天；之后每3-4天采用常規(guī)機械法按1∶2-1∶4傳代一次，即綿羊胚胎干細胞體外培養(yǎng)可傳至16代。綿羊胚胎干細胞無血清培養(yǎng)液的配制D-MEM/F-12+80ng/mL bFGF+3μMCHIR99021+10μL/mL N2+20μL/mL B27+10μL/mL NEAA+2mM L-Glutamine+0.2mM β-Mercaptoethanol。使用32號針頭將裸胚固定于培養(yǎng)皿底部，避免損傷囊胚內(nèi)細胞團并將裸胚滋養(yǎng)層細胞剝離。裸胚接種數(shù)量因以45-60枚/組為宜。該方法能使綿羊的胚胎干細胞原代集落形成率提高至33％(14/42)。
文檔編號C12N5/0735GK101914487SQ20101010010
公開日2010年12月15日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者林嘉鵬, 汪立芹, 趙云程, 陳世彬, 陳童, 黃俊成 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院中國—澳大利亞綿羊育種研究中心