專利名稱：一種規(guī)模化分離水稻未成熟胚的方法
一種規(guī)?；蛛x水稻未成熟胚的方法技術(shù)領(lǐng)域生物技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)：
1，隨著水稻功能基因組學(xué)研究的進(jìn)一步深入，越來越多的水稻基因被分離出來， 絕大多數(shù)需要通過水稻遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株來驗證基因的相關(guān)功能。近年來，國家轉(zhuǎn) 基因重大專項項目的逐步實施，進(jìn)一步增加了水稻遺傳轉(zhuǎn)化操作的工作量。水稻遺傳轉(zhuǎn)化 過程中需要大量的受體組織，優(yōu)質(zhì)受體的數(shù)量往往成為擴(kuò)大水稻轉(zhuǎn)基因規(guī)模的限制因素。2，水稻遺傳轉(zhuǎn)化是植物生物技術(shù)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)，目前水稻遺傳轉(zhuǎn)化主要采用農(nóng) 桿菌感染法和基因槍法，受體組織常采用水稻未成熟胚(幼胚)和成熟胚。幼胚材料具有 胚性好，轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，在水稻的遺傳轉(zhuǎn)化中得到廣泛的應(yīng)用。如何快速獲得大量的優(yōu) 質(zhì)受體組織是一個關(guān)鍵的技術(shù)。多數(shù)生物技術(shù)工作者獲得水稻未成熟胚采用的方法是先 手工剝?nèi)ニ疚闯墒旆N子的外殼，經(jīng)過消毒處理后，再用金屬解剖針挑取的方法。該方法通 過剝除水稻未成熟胚的外殼，有效降低了水稻未成熟胚遭受細(xì)菌污染的概率，可以獲得高 質(zhì)量的水稻未成熟胚供研究者使用。但該方法存在操作效率低的問題，難以在短時間內(nèi)獲 得大量的高質(zhì)量未成熟胚，無法滿足目前水稻規(guī)?；D(zhuǎn)基因?qū)Υ罅康母哔|(zhì)量水稻未成熟胚 的需求問題。3，本發(fā)明以低成本的簡單操作為基礎(chǔ)，在配套以有效的快速選樣和高效的消毒措 施，解決了水稻未成熟胚遭受細(xì)菌污染問題的基礎(chǔ)上，選用鑷子和金屬刮牙器為主要操作 工具，省略了手工剝除水稻未成熟種子外殼的操作步驟。本發(fā)明大大提高了水稻未成熟胚 的獲得效率，使生物技術(shù)工作者能夠在短時間內(nèi)獲得大量的低污染、高質(zhì)量的水稻未成熟 胚，可以滿足水稻規(guī)模化轉(zhuǎn)基因以及生理學(xué)研究對水稻未成熟胚的大量需求。本發(fā)明具體 涉及水稻未成熟種子的田間取樣標(biāo)準(zhǔn)、實驗室脫粒選樣方法、高效的滅菌消毒、幼胚快速擠 取和實驗室培養(yǎng)等一整套的具體操作過程。發(fā)明內(nèi)容通過有效的選樣和消毒措施，解決污染問題，簡化實驗操作，通過省略 手工剝除水稻未成熟種子外殼的操作步驟，以及選用合適的未成熟胚擠取工具，大大提高 了水稻未成熟胚的獲得效率。 建立未成熟種子的田間取樣標(biāo)準(zhǔn)，提高未成熟胚質(zhì)量，并降低污染率。 應(yīng)用簡便的脫粒選樣方法，快速獲得高質(zhì)量的水稻未成熟種子。 利用高效的種子消毒程序，降低未成熟種子表面的微生物污染。 利用金屬刮牙器的特殊構(gòu)造，進(jìn)行未成熟種子的快速擠壓和未成熟胚的快速挑 取。
具體實施例方式一、水稻未成熟種子的田間取樣1，取樣時間以晴天的下午取樣為佳。下雨天或早上又露水時，田間濕度過大，這時 取的材料容易遭受細(xì)菌污染。
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2，選取抽穗后12-15天的穗子。具體操作中，用手指擠壓未成熟種子，以胚能夠被 快速擠出，而無液狀胚乳流出的未成熟種子為理想材料。這樣的材料既容易擠取未成熟胚， 又能降低污染率。將符合條件的穗子整穗取回即可。二、水稻未成熟種子的實驗室脫粒選樣1，用培養(yǎng)皿皿底刮穗子的方法快速脫粒。具體操作為一手抓住穗子基部，將穗子 置于托盤上，用培養(yǎng)皿皿底的邊緣自穗子基部往穗子頂部用力刮，未成熟種子即可脫下。2，脫粒后的未成熟種子用水浮法選樣。具體操作為將脫粒后的材料置于燒杯中， 灌上自來水，用手?jǐn)嚢?，將浮在水面的空癟粒丟棄，沉在水底的材料即為理想的水稻未成熟 種子。三、水稻未成熟種子的滅菌消毒1，將完成選樣的未成熟種子分裝于200ml的有蓋廣口玻璃瓶中，先用70%酒精消 毒1分鐘，再換成180ml的2%次氯酸鈉溶液，另加1滴表面活性劑吐溫20，附加抽真空消 毒處理30分鐘，將玻璃瓶倒置后，再次抽真空消毒處理30分鐘。2，完成消毒后，用無菌水反復(fù)清洗3次，此步驟必須在超凈工作臺上操作。四、水稻未成熟胚的快速擠取1，在超凈工作臺上，用消毒后的金屬勺子取少量完成消毒的未成熟種子，置于經(jīng) 過高壓滅菌消毒并烘干的多層濾紙上。此步驟有利于吸干未成熟種子表面的水分，方便操 作并減少污染。取下一批未成熟種子時，必須換濾紙，金屬勺子也必須火燒消毒。2，在濾紙上，用左手拿鑷子夾住未成熟種子，右手拿金屬刮牙器。用金屬刮牙器的 弓背部位擠壓未成熟種子的胚部，這時水稻未成熟胚就會被擠出，用金屬刮牙器的針尖部 位挑取未成熟胚，盾片朝上置于培養(yǎng)基上培養(yǎng)。3，未成熟胚比較小，在培養(yǎng)皿下放一黑色紙張，有利于分辨未成熟胚的盾片部位。 為降低污染概率，每操作5-10個未成熟種子，就將金屬刮牙器火燒消毒。金屬刮牙器的針 尖部位除了挑取未成熟胚之外，切忌觸碰未成熟種子的外殼等部位。未成熟種子的外殼是 很容易藏菌的部位，雖然消毒相對徹底，其外殼還是可能有極少量的菌造成污染。金屬刮牙 器的優(yōu)點(diǎn)，正是其弓背部位是擠壓未成熟種子的理想器械，同時又能保持針尖部位的無菌 狀態(tài)。五、水稻未成熟胚的實驗室培養(yǎng)1，在含有NB培養(yǎng)基的9cm玻璃培養(yǎng)皿中，每皿可以放置30_50粒水稻未成熟胚。2，獲得的未成熟胚可以直接用于水稻轉(zhuǎn)基因操作和生理學(xué)研究，也可以在26°C黑 暗條件下培養(yǎng)，等誘導(dǎo)出未成熟胚愈傷組織后，再用于水稻轉(zhuǎn)基因操作和生理學(xué)研究。
權(quán)利要求
一種規(guī)模化獲取水稻未成熟胚的方法，其特征是以低成本的簡單操作為基礎(chǔ)，在配套以有效的快速選樣和高效的消毒措施，解決水稻未成熟胚遭受細(xì)菌污染問題的基礎(chǔ)上，利用金屬刮牙器的特殊構(gòu)造，進(jìn)行未成熟種子的快速擠壓和未成熟胚的快速挑取，以快速獲得大量的高質(zhì)量水稻未成熟胚。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的未成熟種子指的是水稻成熟收割前的種子。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是利用未成熟種子在水中沉浮的方法選樣。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征是水稻未成熟種子未經(jīng)脫殼處理。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是利用金屬刮牙器的特殊構(gòu)造，進(jìn)行未成熟種子 的快速擠壓和未成熟胚的快速挑取。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述的未成熟胚應(yīng)用于水稻組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因 和生理學(xué)研究。
全文摘要
本發(fā)明要解決如何快速獲取大量的高質(zhì)量水稻未成熟胚，以滿足水稻規(guī)?；D(zhuǎn)基因研究和生理學(xué)研究對水稻受體組織的大量需求問題。本發(fā)明以低成本的簡單操作為基礎(chǔ)，在配套以有效的快速選樣和高效的消毒措施，解決水稻未成熟胚遭受細(xì)菌污染問題的基礎(chǔ)上，利用金屬刮牙器的特殊構(gòu)造，成功選用鑷子和金屬刮牙器為主要操作工具，進(jìn)行未成熟種子的快速擠壓和未成熟胚的快速挑取，以快速獲得大量的高質(zhì)量水稻未成熟胚。本發(fā)明省略了手工剝除水稻未成熟種子外殼的操作步驟，使操作達(dá)到快速、低污染、高質(zhì)量的要求。實踐表明，按照該發(fā)明操作，每人每小時可以獲取水稻未成熟胚300個以上，獲得的未成熟胚胚性好，污染率低，可以滿足需求。
文檔編號C12N5/04GK101942412SQ201010275779
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者付亞萍, 劉文真, 孫宗修, 斯華敏, 胡國成 申請人:中國水稻研究所