專(zhuān)利名稱(chēng)：一種鑒定微生物肥料中側(cè)孢短芽孢桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及利用適當(dāng)?shù)囊锿ㄟ^(guò)PCR反應(yīng)，檢測(cè)微 生物肥料中側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)的方法，以及在該方法中所用 的引物。
背景技術(shù)：
側(cè)孢短芽孢桿菌是自然界中廣泛分布的細(xì)菌，土壤、海洋、動(dòng)物、昆蟲(chóng)中均有存在。 隨著對(duì)短芽孢桿菌研究的深入，已發(fā)現(xiàn)其能產(chǎn)生多種有應(yīng)用潛力的代謝產(chǎn)物，如殺蟲(chóng)蛋白、 抑菌物質(zhì)、抗癌免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。另外，側(cè)孢短芽孢桿菌在溶解無(wú)機(jī)磷、降解有機(jī)磷、防治害 蟲(chóng)、提高作物防御能力等多種功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)、研究并開(kāi)發(fā)利用。鑒于側(cè)孢短芽孢桿菌的多功能性，已有很多企業(yè)將其用于微生物肥料生產(chǎn)，并取 得了很好的效果。為確保含側(cè)孢短芽孢桿菌的微生物肥料產(chǎn)品的使用效果，需要保證產(chǎn)品 的質(zhì)量，尤其是產(chǎn)品中側(cè)孢短芽孢桿菌的數(shù)量。常用的平板計(jì)數(shù)檢測(cè)法關(guān)鍵在于準(zhǔn)確識(shí)別 有效菌，目前使用的傳統(tǒng)菌種識(shí)別是以形態(tài)特征和各項(xiàng)生理生化方法為主，操作步驟煩瑣， 檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，并且特異性差。因此，迫切需要研究建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)新方法，以滿(mǎn) 足側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)品的質(zhì)量檢測(cè)的準(zhǔn)確性和時(shí)效性。PCR方法有著快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，已經(jīng)在微生物肥料領(lǐng)域得到了應(yīng)用，關(guān)大 偉等人曾建立了的特異PCR法用于沼澤紅假單胞菌的鑒定和檢測(cè)，并取得了良好的應(yīng)用效 果。為將PCR技術(shù)更廣泛應(yīng)用于微生物肥料檢測(cè)領(lǐng)域，本發(fā)明人通過(guò)反復(fù)摸索實(shí)踐建立了 一種基于PCR技術(shù)的、快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)微生物肥料中側(cè)孢短芽孢桿菌的方法。該方 法適用于側(cè)孢短芽孢桿菌的鑒定和檢測(cè)。本發(fā)明是通過(guò)下述的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用特異引物PCR技術(shù)對(duì)微生物肥料中側(cè)孢短芽孢 桿菌進(jìn)行鑒定的方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中提供了通過(guò)特異引物PCR技術(shù)鑒 定側(cè)孢短芽孢桿菌的鑒定方法。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的側(cè)孢短芽孢桿菌是純 菌種。本發(fā)明的另一目的在于提供上述鑒定方法中所用的特異引物。具體而言，本發(fā)明基于已知的側(cè)孢短芽孢桿菌16S rDNA核酸序列，設(shè)計(jì)了相應(yīng)于 上述菌種的特異引物。通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)中的鎂離子濃度和退火溫度等條件來(lái)提高PCR方 法的特異性，并根據(jù)優(yōu)化結(jié)果建立了側(cè)孢短芽孢桿菌的PCR鑒定方法，用于微生物肥料產(chǎn) 品中側(cè)孢短芽孢桿菌的鑒定。本專(zhuān)利發(fā)明的鑒定側(cè)孢短芽孢桿菌的PCR方法為上游引物L(fēng)25 :5，-TGAAGCGAAACGGAAAG-3，；下游引物R322 :5，-CGTCAAGGTGCTACCTTATT-3，。PCR 反應(yīng)體系10 X buffer 2. 0 μ LMg2+(25mmol/L)0. 8 μ L
權(quán)利要求
一種側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)的特異性引物對(duì)，其特征在于所述的引物對(duì)由上游引物和下游引物組成，上游引物L(fēng)25 5′ TGAAGCGAAACGGAAAG 3′；下游引物R3225′ CGTCAAGGTGCTACCTTATT 3′。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)和鑒定微生物肥料中側(cè)孢短芽孢桿菌的技術(shù)。本技術(shù)設(shè)計(jì)了側(cè)孢短芽孢桿菌的特異引物，建立了這種芽孢菌的PCR鑒定方法，可以根據(jù)樣品基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)微生物肥料中的側(cè)孢短芽孢桿菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101956018SQ20101052266
公開(kāi)日2011年1月26日 申請(qǐng)日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者關(guān)大偉, 姜昕, 曹鳳明, 李俊, 李力, 楊小紅, 沈德龍, 葛一凡, 陳慧君 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所