專利名稱：一種通過滲透壓突變提高重組蛋白瞬時表達的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種通過滲透壓突變提高重組蛋白表達的方法。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學研究不斷深入，基因表達技術(shù)有了很大的提高。迄今為止，已經(jīng)研究開發(fā)出多種原核和真核表達系統(tǒng)用以生產(chǎn)重組蛋白。原核生物表達體系主要包括大腸桿菌表達系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)、鏈霉菌表達系統(tǒng)。真核生物表達系統(tǒng)包括酵母表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)以及植物表達系統(tǒng)。
最早采用的原核表達系統(tǒng)，也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)，該項技術(shù)主要是用已克隆目的基因片段的載體來轉(zhuǎn)化細菌，通過誘導表達、純化獲得所需的目的蛋白 [Busuttil B E, Tumey K L, Frauman A G. Protein Expression and Purification, 2001； 23(3) :369-373. Leandro P, Lechner M C, Almerda H, etal.Molecular Genetics and Metabolism, 2001 ；73 (2) :173_17。由于原核表達系統(tǒng)中的細菌培養(yǎng)操作簡單、生長繁殖快、價格低廉，外源基因產(chǎn)物表達水平高，基因背景和表達特性清楚等因素，使得該系統(tǒng)成為最受歡迎的異源蛋白表達系統(tǒng)之一。但原核表達系統(tǒng)也有很多不足，它的主要缺點有 ①沒有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進行mRNA的剪接，所以只能表達cDNA而不能表達真核的基因組基因；②沒有真核翻譯后加工的功能，表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構(gòu)象折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)生物學活性差； ③表達的蛋白質(zhì)經(jīng)常會在細菌內(nèi)聚集成包涵體Kane J F,Hartley D L. Tibtech, 1988 ；6 95-102，致使產(chǎn)物復(fù)性困難，活性不佳。
真核表達系統(tǒng)具有翻譯后的加工修飾體系，表達的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。因此，利用真核表達系統(tǒng)來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統(tǒng)有哺乳動物細胞表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)和昆蟲細胞表達系統(tǒng)。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)能夠指導蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準確的0型糖基化等多種翻譯后加工功能，其表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子，在活性方面遠勝于原核表達系統(tǒng)及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統(tǒng)[Chen P, Hutter D, Liu P, et al. Protein ExprPurif, 2002 ；24(3) ；481—488]。巨前， 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺，并且在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中起了極為重要的作用。
哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中常用的是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其原理是將外源DNA整合到宿主細胞的染色體中，通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)、 胸苷激酶(TK)等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。雖然穩(wěn)定的表達系統(tǒng)是生物生產(chǎn)系統(tǒng)的金標準。然而，其中的轉(zhuǎn)染和細胞篩選過程需耗費大量時間和人力Geisso S， Kocher HP. [J], Methods Enzymol，1999，306 :19。而隨著基因工程的飛速發(fā)展，急需成千上百種的目的蛋白來進行研究和分析。這就要求在盡可能短的時間內(nèi)得到大量的重組3蛋白表達產(chǎn)品，因此瞬時基因表達作為一種快速、方便的外源基因表達系統(tǒng)得到了很大的發(fā)展，其外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不與宿主細胞染色體相整合，其在細胞中的數(shù)目通常隨著細胞的分裂而減少，因此蛋白表達只能維持幾天到十幾天的時間，相對于構(gòu)建穩(wěn)定株的基因表達方法，瞬時基因(蛋白質(zhì))表達方法在得到基因后幾周內(nèi)就可以獲得目的蛋白Cullen，B. R. (1987) · Methods Enzymol. , 152，684-704. Blasey， H. D.，Aubry, J.-P.，Mazzei, G. and Bernard, Α. (1996). Cytotechnology,18,183-192. Cachianes, G. , Ho, C. , Weber, R. F. , Williams, S. R. , Goeddel, D. V. and Leung, D. W. (1993). Biotechniques,15,255-259.。
目前，有很多種傳遞質(zhì)粒DNA的方法，除病毒載體外，主要有磷酸鈣共沉法， DEAE-葡萄糖法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法和基因槍轟擊法。電穿孔法是在高壓電場的作用下，細胞膜發(fā)生臨時性破裂形成微孔，可使大分子及小分子從外界進入細胞內(nèi)部，或反向流出細胞從而實現(xiàn)DNA的轉(zhuǎn)染；基因槍技術(shù)是通過提供給包裹有DNA的微小金顆粒(或鎢粉) 很高的初速度，使其穿透植物細胞壁而達到轉(zhuǎn)移外源DNA的目的。磷酸鈣法轉(zhuǎn)染的原理是把含外源DNA的質(zhì)粒與磷酸鈣轉(zhuǎn)染液混合，加入到被轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)環(huán)境中，在磷酸鈣轉(zhuǎn)染液的媒介下使外源DNA進入細胞。DEAE-葡聚糖介導法轉(zhuǎn)染原理是帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的復(fù)合物被細胞內(nèi)吞。脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染可能的機理是陽離子脂質(zhì)體與帶負電的基因借靜電作用形成脂質(zhì)體基因復(fù)合物，此復(fù)合物因陽離子脂質(zhì)體的過剩正電荷而帶正電，借助靜電作用吸附于帶負電的細胞表面，再通過與細胞膜融合或細胞內(nèi)吞作用而進入細胞內(nèi)。各種轉(zhuǎn)染方法，DNA進入細胞所需要的時間不同，借助于轉(zhuǎn)染試劑進行的轉(zhuǎn)染方法，DNA進入細胞的過程通常會持續(xù)幾個小時的時間。
雖然外源基因瞬時表達在速度和通用性上面具有很大的優(yōu)點，并且隨著磷酸鈣和 PEI等廉價轉(zhuǎn)染試劑的使用，這項技術(shù)獲得了很大的應(yīng)用Boussif，0.，Lezoualc' h，F(xiàn).， Zanta, Μ. A. , Mergny, M. D. , Scherman, D. , Demeneix, B. and Behr, J. P. (1995) Proc. Natl Acad. ki. USA，92，7297-7301。但它具有轉(zhuǎn)染效率低、蛋白表達量低的缺點導致其應(yīng)用受到很大的限制。
之前已經(jīng)有些提高瞬時轉(zhuǎn)染效率的研究報道，比如選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑；優(yōu)化轉(zhuǎn)染試劑和DNA的比例；設(shè)計適合瞬時轉(zhuǎn)染表達的載體；與一些生長因子共轉(zhuǎn)染表達；轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)時加入蛋白水解物；通過控制培養(yǎng)基的PH ；通過溫度的轉(zhuǎn)換控制來提高重組蛋白的表達量；在轉(zhuǎn)染過程中將細胞暴露于丁酸鈉溶液來增加受感染細胞的百分數(shù)， 誘導蛋白質(zhì)的合成；使用2-氨基嘌呤來提高重組蛋白的表達量DUR0CHER，Y. et al.， Anal Biochem,2000. 284(2) :p.316-26. BALDI, L, et al.，Biotechnol Prog,2005. 21 (1) P.148-53. MEISSNER,P. et al.，Biotechnol Bioeng,2001. 75(2) :ρ· 197-203. STETTLER, Μ, et al. ,Biotechnol Bioeng,2006. FUSSENEGGER, Μ,et al. ,Nat Biotechnol，1998. 16(5) p. 468-72。通過上面的方法來提高細胞的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后細胞的高密度生長和蛋白高表達。美國專利US2008/0145893將這些因素組合起來使用，達到了一個較高的表達量和轉(zhuǎn)染效率，但其工藝復(fù)雜，所用試劑昂貴，不適合大規(guī)模推廣使用。
滲透壓對細胞表達蛋白的影響的研究也有較多報道，Ryu等的研究表明高滲透壓可使CHO細胞發(fā)生Gl期阻滯，從而提高目的蛋白的產(chǎn)量Ryu J S, Lee M S, Lee,G Μ, [J], Biotechnol Prog, 2001,17 (6) :993 999.Kim等用提高滲透壓的方法增加CHO細胞外源蛋白產(chǎn)量，采用兩階段培養(yǎng)策略用標準培養(yǎng)基094mmol/L)使細胞快速生長至合適密度， 然后用高滲透壓(522mmol/L)培養(yǎng)基替換標準培養(yǎng)基，使目的蛋白的產(chǎn)量提高161%Kim M S, Kim N S, Sung Y H, etal, [J], InVitro Cell Dev Biolanim，2002，38(6) :314_319。 Sun等較為系統(tǒng)地研究了高滲透壓對免疫球蛋白在鼠雜交瘤細胞中的轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后加工等過程的影響，發(fā)現(xiàn)高滲透壓可提高蛋白的翻譯水平及翻譯后加工的速度，使細胞體積增大及抗體表達水平提高Sun Ζ, Zhou R，Liang S, etal, [J]，Biotechnol Prog, 2004, 20(2) ；576-589。
在這些報道中，都是通過調(diào)整轉(zhuǎn)染后細胞的滲透壓來增加蛋白表達水平，我們沒有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染過程中通過改變細胞的滲透壓來提高轉(zhuǎn)染效率的相關(guān)報道。本專利提供了一種通過改變轉(zhuǎn)染前后細胞的培養(yǎng)液的滲透壓來提高重組蛋白瞬時表達的方法，能在原基礎(chǔ)上，使重組蛋白的表達量提高20 %以上。發(fā)明內(nèi)容
用哺乳動物細胞系統(tǒng)生產(chǎn)的重組蛋白具有很高的商業(yè)價值，然而目前使用的最多的是耗費大量人力和時間的構(gòu)建穩(wěn)定株的方法?；谕庠椿蛩矔r表達的方法在速度和通用性上面具有很大的優(yōu)點，而且在表達具體有細胞毒性或者影響細胞分裂的蛋白上具有獨特的優(yōu)勢。隨著脂質(zhì)體、磷酸鈣和PEI等轉(zhuǎn)染試劑的使用，這項技術(shù)獲得了很大的應(yīng)用。但是相對于穩(wěn)定株表達系統(tǒng)來說，瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)重組蛋白存在轉(zhuǎn)染效率低、蛋白表達量低的缺點，使得此方法的應(yīng)用受到較大的限制。
本專利提供了一種通過突變轉(zhuǎn)染前后細胞所處環(huán)境滲透壓的方法來提高哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染效率進而提高重組蛋白的表達量。能在原基礎(chǔ)上，使重組蛋白的表達量提高 20%以上。
本發(fā)明是在轉(zhuǎn)染前將細胞所處環(huán)境的滲透壓降低到一個比細胞生長適宜的滲透壓低的范圍，使其更易于引入外源DNA，從而提高細胞的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后細胞回到適宜生長的滲透壓培養(yǎng)，盡量保持細胞的最佳的生長和表達環(huán)境，減少滲透壓突變以及引入質(zhì)粒對細胞的毒害，使細胞高密度生長從而實現(xiàn)外源DNA編碼蛋白的高表達。
本發(fā)明的滲透壓突變范圍和幅度是隨不同的細胞不同的轉(zhuǎn)染方法而變化，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能很容易的確定滲透壓突變的范圍和幅度。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，選用HEK 293細胞進行滲透壓突變，在進行轉(zhuǎn)染前將其所處的滲透壓從適宜生長的 265m0sm/kg突變到230-175m0sm/kg，持續(xù)一段時間后，回到^5m0sm/kg的滲透壓下培養(yǎng)細胞進行蛋白表達。能使蛋白表達量和Qp顯著提高。
本發(fā)明中的滲透壓的突變的起始時間可以是外源DNA加入細胞培養(yǎng)液前的某個時間，也可以是外源DNA加入細胞培養(yǎng)液時。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能很容易的確定不同轉(zhuǎn)染方法以及不同細胞的滲透壓突變的起始時間。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，對 HEK 293細胞的滲透壓的突變的起始時間做了優(yōu)化，確定出在DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液之前的0-1個小時時開始突變是比較好的范圍，此時突變既能保持細胞的較佳生長，又能提高細胞的轉(zhuǎn)染效率，從而得到外源DNA編碼蛋白的高表達。蛋白表達量提高 22. 7% -31. 1%。
本發(fā)明中的滲透壓的突變的終止時間可以是外源DNA加入細胞培養(yǎng)液后的某個時間，也可以是外源DNA加入細胞培養(yǎng)液時。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能很容易的確定不同轉(zhuǎn)染方法以及不同細胞的滲透壓突變的終止時間。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，對HEK 293細胞的滲透壓的突變的終止時間做了優(yōu)化，確定出在DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液之后的0-4個小時時結(jié)束突變是比較好的范圍，此時突變既能保持細胞的較佳生長， 又能提高細胞的轉(zhuǎn)染效率，從而得到外源DNA編碼蛋白的高表達。最高一組的蛋白表達量提高34. 9%。
本發(fā)明中的細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，可以選擇各種提高蛋白表達的方式來培養(yǎng)，比如流加培養(yǎng)、加入丁酸鹽、降低表達溫度等策略。本發(fā)明中的瞬時轉(zhuǎn)染的方法與所有的提高細胞中重組蛋白表達的方法都可以組合使用，不受任何的限制。
本發(fā)明中用到的載體可以是任意的商業(yè)化載體，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都能選擇合適的載體來進行質(zhì)粒構(gòu)建。
本發(fā)明的方法適用于各種哺乳動物細胞的瞬時轉(zhuǎn)染，本發(fā)明的具體實施例中，用 HEK 293細胞做了優(yōu)化，取得了較好的效果。
本發(fā)明的方法適用于懸浮細胞或者貼壁細胞，在本發(fā)明的具體實施例中，分別用貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)來進行滲透壓突變，都取得較好的效果。
本發(fā)明的方法適用于各種適合相應(yīng)轉(zhuǎn)染方法的培養(yǎng)基中。
本發(fā)明中的“轉(zhuǎn)染”是指將外源DNA引入細胞的過程，當外源DNA通過細胞膜進入細胞內(nèi)部則稱此細胞被轉(zhuǎn)染。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的許多轉(zhuǎn)染技術(shù)，都能將一個或者多個核酸合成物比如質(zhì)粒載體和其他的核酸分子引入細胞。本發(fā)明的方法適用于各種瞬時轉(zhuǎn)染的方法，比如磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、活化的樹狀聚合物轉(zhuǎn)染、多胺試劑轉(zhuǎn)染。 各種轉(zhuǎn)染方法都可以在其各自優(yōu)化的條件下進行。
本發(fā)明中“蛋白，，是指被盡可能高量表達和收獲的產(chǎn)物蛋白，它可以是任何有意義的蛋白、抗體、抗體片段或多肽。本發(fā)明的具體實施例中使用了一個EGFR蛋白和任意一個 IgG抗體。產(chǎn)物收集以及用于純化從培養(yǎng)物中獲得蛋白的下游加工技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的常規(guī)方式，包括但不限于離心、超濾、離子交換層析、親和純化等技術(shù)。
本發(fā)明中的“滲透壓突變”是指在特定的時機改變細胞培養(yǎng)的滲透壓，持續(xù)特定的時間后再恢復(fù)到改變前滲透壓的過程。
本發(fā)明中的“瞬時表達”是指將外源DNA引入哺乳動物細胞，但外源DNA不整合在宿主細胞染色體上，而是以游離的形式被轉(zhuǎn)錄、翻譯、最終表達出外源DNA編碼的蛋白。
本發(fā)明作為簡單易行并且有效的提高重組蛋白瞬時表達的方法，其具有非常大的商業(yè)價值，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的構(gòu)建細胞穩(wěn)定株表達系統(tǒng)來生產(chǎn)諸如有細胞毒性的蛋白、阻斷細胞分裂的蛋白?？梢钥焖俚玫街亟M蛋白，對生命科學研究和藥物開發(fā)有重大支撐作用。
本發(fā)明中的“單位時間單位細胞的表達率” “細胞表達率” “Qp”是指目標重組蛋白在單個細胞中的M小時的表達量。
本發(fā)明中的“表達量”是指目標蛋白的濃度，這個濃度可以是El isa檢測方法得來或者是經(jīng)過下游蛋白純化后得出的結(jié)果。


圖1.不同滲透壓條件下轉(zhuǎn)染的HEK 293細胞在轉(zhuǎn)染后的生長情況。突變到213m0sm/kg-281m0sm/kg滲透壓下轉(zhuǎn)染的細胞對其生長沒有太大的影響，但突變到低于 213m0sm/kg和高于^lmOsm/kg滲透壓下轉(zhuǎn)染的細胞，轉(zhuǎn)染后的生長較差。
圖2.不同滲透壓條件下轉(zhuǎn)染的HEK 293細胞，轉(zhuǎn)染后蛋白EGFR的表達情況。表達量在突變到190m0sm/kg滲透壓下轉(zhuǎn)染的細胞表達量最高。
圖3.不同滲透壓條件下轉(zhuǎn)染的HEK 293細胞，轉(zhuǎn)染后的表達率(Qp)的變化。隨著轉(zhuǎn)染時突變的滲透壓的降低，Qp在突變到190m0sm/kg滲透壓下轉(zhuǎn)染的細胞Qp最高。
圖4.滲透壓突變開始的不同時間對HEK 293細胞轉(zhuǎn)染后的生長的影響。細胞生長隨滲透壓突變起始的時間距離DNA加入細胞培養(yǎng)液的時間越近越好，在距離DNA加入細胞1-0小時時開始突變，與不進行滲透壓突變的對照組的細胞生長一致。
圖5.滲透壓突變開始的不同時間對HEK 293細胞轉(zhuǎn)染后蛋白EGFR的表達情況。 蛋白表達最佳出現(xiàn)在滲透壓距離DNA加入細胞1-0小時時開始突變，此時蛋白表達量增長22.7% -31. 3%。
圖6.滲透壓突變開始的不同時間對HEK 293細胞轉(zhuǎn)染后表達率(Qp)的影響。Qp 隨滲透壓突變起始的時間距離外源DNA加入細胞培養(yǎng)液的時間越近越低，也表明滲透壓突變的時間的延長，有利于轉(zhuǎn)染效率的提高。
圖7.滲透壓突變持續(xù)的不同時間對HEK 293細胞轉(zhuǎn)染后的生長的影響。滲透壓突變持續(xù)到外源DNA加入細胞培養(yǎng)液后的4小時時對細胞生長有影響，4小時之前的時間均無明顯的影響。
圖8.滲透壓突變持續(xù)的不同時間對HEK 293細胞轉(zhuǎn)染后蛋白EGFR的表達情況。 在實驗范圍內(nèi)的突變時間內(nèi)，表達量均有提高，最高一組的蛋白表達量提高34. 9%。
圖9.滲透壓突變持續(xù)的不同時間對HEK 293細胞轉(zhuǎn)染后蛋白表達率(Qp)的情況。在實驗范圍內(nèi)的所有條件，滲透壓突變的Qp均比不突變的有較大幅度的提高，提高幅度在 30. 5% -47. 3%。
圖10.滲透壓突變對抗體表達量的影響。滲透壓突變組比對照組表達量提高23.3 % ο
圖11.滲透壓突變對HEK 293貼壁細胞表達EGFR蛋白的影響。滲透壓突變組的蛋白表達量比正常對照組的表達量提高31 %。
具體實施方式
材料和方法
材料
高效轉(zhuǎn)染試劑Sinofection、帶Fc標簽的EGFR蛋白的質(zhì)粒、IgG抗體質(zhì)粒均來自于北京義翹神州生物技術(shù)有限公司(中國)
細胞培養(yǎng)
人胚腎細胞HEK 293(ATCC)貼壁細胞，用DMEM+10%FBS培養(yǎng)基在T75細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待豐度為90%左右，用胰酶消化傳代細胞。放37°C，8%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，取豐度為90%左右的細胞，胰酶消化計數(shù)。用DMEM+10% FBS的培養(yǎng)基將細胞稀釋到 0. 9X 106Cells/ml，取0. 4ml放24孔板的孔中，將細胞搖勻后放入37°C,8% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5小時后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后將M孔板放37°C，8% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后72小時時取樣檢測蛋白濃度。
人胚腎細胞HEK 293,經(jīng)過懸浮馴化到SBH93TM(北京義翹神州生物技術(shù)有限公司，中國)培養(yǎng)基中，細胞每三天傳代，傳代起始密度為0. 3 0. 6 X 106cells/ml，細胞培養(yǎng)在搖瓶中進行，工作體積為總體積的15 35%，搖床轉(zhuǎn)速100 130rpm，溫度36. 5°C，二氧化碳5%。轉(zhuǎn)染前，取處于對數(shù)生長期的細胞，離心傳代到所需的細胞密度，放搖床中， 100 130rpm，36. 5°C下培養(yǎng)，IOOml的搖瓶中每瓶放30ml的培養(yǎng)物，然后在設(shè)計的時間進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細胞繼續(xù)在100 130rpm，36. 5°C搖床中培養(yǎng)，并于加入DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物后的M小時開始每隔48小時加入1. 2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液來進行培養(yǎng)以提高細胞生長和重組蛋白的表達。轉(zhuǎn)染后72小時和144小時取樣檢測細胞密度和蛋白濃度。
轉(zhuǎn)染
以轉(zhuǎn)染30ml的細胞懸液為例取30ug DNA稀釋到1. 5ml的150mM的NaCl溶液中混合均勻，另取90ul高效轉(zhuǎn)染試劑Sinofection稀釋到1. 5ml的150mM的NaCl溶液中混合均勻，然后將DNA溶液和轉(zhuǎn)染試劑溶液混合均勻，室溫下孵育10-20min，制成DNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液。然后逐滴加入要轉(zhuǎn)染的細胞懸浮液中?？装逯械霓D(zhuǎn)染，其所用DNA和轉(zhuǎn)染試劑以及NaCl溶液的量按比例減少。
細胞計數(shù)
用血細胞計數(shù)器來計數(shù)細胞密度；用臺盼藍染色法來判斷細胞的活率。
蛋白檢測
采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫(Elisa)檢測樣品中IgG抗體(Fe標簽的蛋白)的含量。 將抗人IgG(Fc)的特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。加標準品及待測樣品，樣品及標準品中的人IgG(Fc)與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物；然后，加酶標記的抗人IgG(Fc)抗體，保溫反應(yīng)，固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢樣中人IgG(Fc)的量相關(guān)。加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標本中Fc標簽的蛋白(或人 IgG抗體)的量。
以上方法均為生物技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)操作方法，為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所熟知。
實施例1 滲透壓突變對重組蛋白表達的影響
為了分析轉(zhuǎn)染時細胞所處環(huán)境的滲透壓的突變對細胞瞬時轉(zhuǎn)染過程產(chǎn)生的影響， 用HEK 293細胞設(shè)計如下實驗通過調(diào)整培養(yǎng)基中NaCl的濃度，得到一系列滲透壓的培養(yǎng)基，分別為175、190、213、230、265、281、306、330m0sm/kg，并在轉(zhuǎn)染前1小時，取健康的種子細胞離心換液到不同的滲透壓的培養(yǎng)基中，每個滲透壓條件3個平行樣。并且保持細胞密度為1. 0X106cells/ml，放100 130rpm,36. 5°C,5% CO2搖床中培養(yǎng)，1小時后進行轉(zhuǎn)染。 所有細胞DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入順序隨機，加入時間相差不超過5分鐘。DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液后1小時，離心換液，使細胞回到滲透壓^5m0sm/kg的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。并于加入DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物后的M小時開始每隔48小時加入1. 2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液來進行培養(yǎng)，以提高細胞生長和重組蛋白的表達。72小時和144小時取樣檢測細胞密度和蛋白濃度。
細胞生長和表達結(jié)果如圖1-3所示，轉(zhuǎn)染時的滲透壓對細胞的轉(zhuǎn)染效率影響較大，具體表現(xiàn)在在實驗范圍內(nèi)，隨著滲透壓的降低，Qp增大，而細胞生長在190m0sm/kg時開始出現(xiàn)明顯的降低。蛋白表達在190-213m0sm/kg范圍內(nèi)有最佳值，表達量比^5m0sm/kg 滲透壓下轉(zhuǎn)染的時候提高四％，Qp提高25. 7-41. 8%。
實施例2 =HEK 293細胞滲透壓突變起始時間的確定
設(shè)計如下實驗來確定HEK 293細胞的滲透壓突變的時間取健康的處于對數(shù)生長期的細胞，在轉(zhuǎn)染前的4hr、air、lhr、0. 5hr,0hr分別離心處理到190m0sm/kg滲透壓的培養(yǎng)基中，然后進行轉(zhuǎn)染。所有細胞DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入順序隨機，加入時間相差不超過 5分鐘。DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液后1小時時離心換液到滲透壓為^5m0sm/ kg的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。并于加入DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物后的M小時開始每隔48小時加入1. 2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液來進行培養(yǎng)，以提高細胞生長和重組蛋白的表達。DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液后72小時和144小時取樣檢測細胞密度和蛋白濃度。
實驗結(jié)果如圖4-6所示，轉(zhuǎn)染前的不同時間進行滲透壓突變，在實驗范圍內(nèi)Qp隨突變的時間的延長而增加，但細胞生長隨時間的增加而變差，兩種趨勢的綜合效應(yīng)導致在轉(zhuǎn)染前1-0. 5小時內(nèi)進行突變有較佳的蛋白表達量，此時蛋白表達量增長22. 7% -31. 3%0
實施例3 =HEK 293細胞滲透壓突變持續(xù)時間的確定
設(shè)計如下實驗來確定細胞在轉(zhuǎn)染過程中滲透壓突變的持續(xù)時間取健康的處于對數(shù)生長期的細胞，在轉(zhuǎn)染前0. 5小時，分別離心處理到190m0sm/kg滲透壓的培養(yǎng)基中，0. 5 小時后進行轉(zhuǎn)染，所有細胞DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入順序隨機，加入時間相差不超過5分鐘。并分別在DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液后的0小時，0. 5小時，1小時，2 小時，4小時將細胞所處環(huán)境的滲透壓離心換液調(diào)整到^5m0sm/kg繼續(xù)培養(yǎng)。并于加入 DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物后的M小時開始每隔48小時加入1. 2ml的200mM L-谷氨酰胺和 400g/L的葡萄糖的混合加料液來進行培養(yǎng)，以提高細胞生長和重組蛋白的表達。DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液后72小時和144小時取樣檢測細胞密度和蛋白濃度。
實驗結(jié)果如圖7-9所示，細胞生長在滲透壓突變持續(xù)到加入DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物后4小時時明顯變差。在實驗范圍內(nèi)的所有條件，滲透壓突變的Qp均比不突變的有較大幅度的提高，提高幅度在30. 5% -47.3%, EGFR的表達量也均有提高，提高幅度在 6. 2% -39. 6%。
實施例4 滲透壓突變對抗體的表達的影響
設(shè)計如下實驗來確定滲透壓突變對HEK 293細胞瞬時轉(zhuǎn)染生產(chǎn)抗體的影響取健康的處于對數(shù)生長期的細胞，在轉(zhuǎn)染前0. 5小時時離心細胞，重懸到190m0sm/kg滲透壓的培養(yǎng)基中，分裝成三瓶，0. 5小時后進行轉(zhuǎn)染，并在DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液后的1小時將細胞所處環(huán)境的滲透壓離心換液調(diào)整到^5m0sm/kg繼續(xù)培養(yǎng)。另一組三個平行樣，離心換液到^5m0sm/kg的培養(yǎng)基中，作為對照組不進行滲透壓突變，共同轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)。所有細胞DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入順序隨機，加入時間相差不超過5分鐘。兩組均于加入DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物后的M小時開始每隔48小時加入1. 2ml的200mM L-谷氨酰胺和400g/L的葡萄糖的混合加料液來進行培養(yǎng)，以提高細胞生長和重組蛋白的表達。DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液后72小時和144小時取樣檢測細胞密度和抗體濃度。
實驗結(jié)果如圖10所示，滲透壓突變組比對照組表達量提高23. 3%。9
實施例5.滲透壓突變在貼壁細胞中的應(yīng)用
用人胚腎細胞HEK 293貼壁細胞來考察貼壁情況下滲透壓突變對細胞重組蛋白表達的影響。處理好兩組細胞，每組三個平行樣，在轉(zhuǎn)染前0.5小時，將其中一組細胞培養(yǎng)液更換為滲透壓為190m0sm/kg的培養(yǎng)基，另一組作為對照不進行滲透壓突變，只更換為 265m0sm/kg滲透壓的培養(yǎng)基，0. 5小時后進行轉(zhuǎn)染，所有細胞DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入順序隨機，加入時間相差不超過5分鐘。DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞后1小時，將培養(yǎng)基更換為^5m0sm/kg滲透壓的培養(yǎng)基，放36. 5°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物加入細胞培養(yǎng)液后72小時時取樣檢測EGFR的濃度。
結(jié)果如圖11所示滲透壓突變組的蛋白表達量比正常對照組的表達量提高31%。
權(quán)利要求
1.利用滲透壓突變來提高重組蛋白在哺乳動物細胞中瞬時表達效率的方法，其特征在于在細胞轉(zhuǎn)染前降低細胞培養(yǎng)液的滲透壓，轉(zhuǎn)染后再將滲透壓恢復(fù)到降低前水平。
2.權(quán)利要求1中所述滲透壓降低范圍是lO-lOOmOsm/kg。
3.權(quán)利要求2中所述滲透壓降低范圍是30-70m0sm/kg。
4.權(quán)利要求1中所述的滲透壓降低起始時間為外源DNA加入細胞培養(yǎng)液之前0-1小時。
5.權(quán)利要求1中所述的滲透壓恢復(fù)時間為外源DNA加入細胞培養(yǎng)液之后0-4小時。
6.權(quán)利要求1中所述的哺乳動物細胞為人胚腎細胞(HEK293)或中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)。
7.權(quán)利要求1中所述的重組蛋白為蛋白、抗體、抗體片段或多肽。
全文摘要
哺乳動物細胞生產(chǎn)的重組蛋白具有很大的商業(yè)價值。利用瞬時轉(zhuǎn)染的方法生產(chǎn)重組蛋白，具有快速和通用的優(yōu)點，但這些方法的轉(zhuǎn)染效率低，蛋白表達量低，從而極大的限制了此類方法的應(yīng)用。本發(fā)明是關(guān)于一種通過滲透壓突變來提高哺乳動物細胞瞬時轉(zhuǎn)染效率的方法，可以將重組蛋白的表達量提高20～40％。
文檔編號C12N15/09GK102533721SQ20101060363
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者張延靜, 李磊, 謝良志, 賈靜華, 馬寧寧 申請人:北京義翹神州生物技術(shù)有限公司