專利名稱：一種堿性果膠酶pla及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種堿性果膠酶PLA及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
果膠質(zhì)是廣泛存在于高等植物初生壁和細(xì)胞間隙中的一組多糖，在植物的細(xì)胞組織中起著“粘合”的作用。構(gòu)成果膠質(zhì)的基本單元是不同酯化度的半乳糖醛酸，D-半乳糖醛酸以α _1，4糖苷鍵相連接作為主鏈，并以鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖及其他糖類連接在其主鏈上作為支鏈(Thakur BR, et al. Crit Rev Food Sci Nutr. 37 :47-73,1997) 果膠酶(pectinases)是分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱。由于果膠質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜.能夠催化其分解的果膠酶也是種類繁多。果膠酶根據(jù)分解糖苷鍵的反應(yīng)性質(zhì)或降解底物的性質(zhì)可以分為果膠水解酶(pectin hydrolases)、果膠裂解酶(pectin lyases, PL)、果膠酉旨酶(pectin esterases, ΡΕ)禾口原果膠酶(Alkorta I, et al. Process Biochem33 :21-28,1998).果膠酶按其作用最適pH分為酸性果膠酶和堿性果膠酶。目前研究和應(yīng)用較多的是酸性果膠酶，其酶作用最適PH在偏酸性范圍，主要用于水果榨汁和果汁澄清。堿性果膠酶(Alkaline pectinase)則是指在堿性范圍內(nèi)具有較高活性的果膠酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(Polygalacturonate lyase，簡(jiǎn)稱PGL)。其最適pH在 8. 0-10.0，可以在高pH條件下斷開果膠聚合物主鏈，產(chǎn)寡聚半乳糖醛酸。堿性果膠酶是非常重要的工業(yè)酶制劑之一，具有不可估量的潛在應(yīng)用價(jià)值。目前，堿性果膠酶在植物藥提取、茶和咖啡發(fā)酵、油提取，紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、含果膠工業(yè)廢水處理及生物技術(shù)等行業(yè)的應(yīng)用越來(lái)越受到重視，所以成為人們研究的熱點(diǎn)(Jayani RS, et al. Process Biochemistry 40 :2931-2944,2005) 堿性果膠酶多由細(xì)菌中的桿菌屬和假單胞菌屬產(chǎn)生(Hayashi K， et al. Phytochemistry 45 :1359-1363,1997),放線菌(Beg QK, et al. J Ind MicrobiolBiotechnol 24 :396-402,2000)和真菌產(chǎn)堿性果膠酶也有報(bào)道(Baracat et al. J IndMicrobiol 11 139-142,1993) 0不同來(lái)源的堿性果膠酶生化性質(zhì)差異較為明顯。 來(lái)源于 Bacillus licheniformis (Singh SA, et al. Process Biochem. 35 :411-417,1999) 禾口 Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersci (Pietro AD,et al. FEMS Microbiol Lett. 145 295-298,1996)的堿性果膠酶的最適 pH 為 11. O。來(lái)源于 Bacillus alcalophillusNTT33 果膠酶的最適 pH 為 9. 5(Zhai C，et al. Enzyme and Microbial Technology. 33 :173-178， 2003)。來(lái)源于 Pseudomonas marginal is CFBP 1沘7 的果膠酶的最適 pH 為 8. 5-9. O (Membre and Burlot，Appl Environ Microbiol. 60 :2017_2022，1994)。報(bào)道的堿性果膠酶的最適溫度在30-70°C之間。一些堿性果膠酶的基因已經(jīng)被克隆，并且已經(jīng)大腸桿菌、畢赤酵母等表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)(Zhai C, et al. Enzyme andMicrobial Technology. 33 173-178， 2003;王蕓等，微生物學(xué)通報(bào)，35 C3) :341-345，2008)。但堿性果膠酶的表達(dá)量仍然很低，由于成本問(wèn)題，至今未得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)堿性果膠酶的菌株Klebsiella sp.Yl。本發(fā)明再一目的是提供來(lái)源于上述菌株的堿性果膠酶。本發(fā)明的再一目的是提供上述果膠酶的基因。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述果膠酶的重組載體。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述果膠酶基因的重組菌株。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備堿性果膠酶的方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述堿性果膠酶的應(yīng)用。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的新 酶。本發(fā)明人篩選到ー種天然菌株，其來(lái)自于該克雷伯氏菌Klebsiella sp.，它所產(chǎn)生的果 膠酶適合于在紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、茶和咖啡發(fā)酵、油提取、含果膠エ業(yè)廢水 處理及生物技術(shù)等行業(yè)中使用。本發(fā)明從上述菌株中獲得了一種堿性果膠酶PLA，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 示1 MKIAKITLAL GVLSLFSLNA GAQENERLSS VKQFADVVLD KASDRYGHYS51 PLLANGVDPR TGKQMEffVFP DGKVTVLSNF SAQQNLMRML VGLSNLTGET101 KYKQRVAENI RYYFDHYQDA SGLLLffGGHR FVDLKTLQPQ GPSEKERVHE151 LKNAYPYYDM MFAVDDQATA RFIKAFffNAH VYDffKTLETS RHGEYGKPMG201 ALffQSDFVQQ PPFFATKGLS FLNAGNDLIY SASLLYQYDG DAGALTffAKR251 LAEQYVLPRD KKTGLGVYQF TQPLKRADTS DDSDTHSKYG DRAQRQFGPE301 LGPDALEG匪 LLKGRTSTLY SENALMQLAL AKSLGKD⑶D LKKffTLDGLK351 AFATYAYDEQ NNTFRPMLAN GTDLSDYALK RDGYYGKKGT VLKAYPAGNE401 FLLSYARAffT LEPDHAIffKV ARGIAKGQGL GDIGEPGGTN RRLNSQTENH451 QPYAIFALID LffQSTGQRDY LTLADRIGAN IINKQRLNGF FVDDPEAEYA501 SIDSIAPYAL LALEAAFRNT PDAVAPFLNG AGFTEGAYRM ADGTVRYSTR551 DDELFRLRPG EQLKPNGKK*其中，該酶基因編碼569個(gè)氨基酸和ー個(gè)終止密碼子，N端22個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè) 的信號(hào)肽序列“ MKIAKITLALGVLSLFSLNAGA，，。因此，成熟的堿性果膠酶PLA的理論分子量為63. 8kDa，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示1 QENERLSSVK QFADVVLDKA SDRYGHYSPL LANGVDPRTG KQMEffVFPDG51 KVTVLSNFSA QQNLMRMLVG LSNLTGETKY KQRVAENIRY YFDHYQDASG101 LLLffGGHRFV DLKTLQPQGP SEKERVHELK NAYPYYDMMF AVDDQATARF151 IKAFffNAHVY DffKTLETSRH GEYGKPMGAL WQSDFVQQPP FFATKGLSFL201 NAGNDLIYSA SLLYQYD⑶A GALTffAKRLA EQYVLPRDKK TGLGVYQFTQ251 PLKRADTSDD SDTHSKY⑶R AQRQFGPELG PDALEG匪LL KGRTSTLYSE301 NALMQLALAK SLGKD⑶DLK KffTLDGLKAF ATYAYDEQNN TFRPMLANGT351 DLSDYALKRD GYYGKKGTVL KAYPAGNEFL LSYARAffTLE PDHAIffKVAR
401 GIAKGQGLGD IGEPGGTNRR LNSQTENHQP YAIFALIDLff QSTGQRDYLT451 LADRIGANII NKQRLNGFFV DDPEAEYASI DSIAPYALLA LEAAFRNTPD501 AVAPFLNGAG FTEGAYRMAD GTVRYSTRDD ELFRLRPGEQ LKPNGKK*該果膠酶PLA同時(shí)具有好的pH穩(wěn)定性，在低溫(0°C )、常溫及較高溫下具備高活性、在堿性和中性的范圍內(nèi)均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本發(fā)明篩選到的克雷伯氏菌Klebsiella sp. Yl所產(chǎn)生的果膠酶，其最適ρΗ9· 0，在ρΗ7· 5-10. 0的范圍內(nèi)維持80%以上的酶活性；最適溫度50°C，在20-60°C之間有85%以上的酶活，在0°C能維持35%以上的酶活。具有良好的PH穩(wěn)定性，在pH5. 0-10. 5之間穩(wěn)定；比活797U/mg ；極好的堿性蛋白酶抗性以及易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明還提供了編碼上述堿性果膠酶的基因。本發(fā)明通過(guò)PCR的方法分離克隆了
這一堿性果膠酶基因plA，基因plA全長(zhǎng)1710bp，該酶的全基因序列如SEQ IDNO. 3所示
1ATGAAGATTGCAAAAATCACTCTGGCATTGGGCGTTCTGAGTCTCTTCTCACTGAATGCG
61GGTGCCCAGGAGAACGAGCGCCTGAGCAGCGTAAAGCAGTTCGCCGACGTCGTGCTGGAC
121AAAGCAAGCGATCGGTACGGGCATTACTCTCCCCTGCTGGCTAATGGCGTGGACCCACGC
181ACCGGCAAACAAATGGAATGGGTATTTCCGGACGGTAAAGTGACCGTGCTGTCGAACTTC
241TCTGCCCAGCAAAACTTGATGCGGATGCTGGTAGGGTTAAGCAACCTGACTGGCGAAACA
301AAATATAAACAGCGGGTCGCGGAGAATATACGCTACTACTTTGACCACTATCAGGATGCA
361AGCGGGCTGCTGCTATGGGGAGGGCATCGTTTTGTTGATTTAAAAACGCTGCAGCCTCAA
421GGCCCAAGTGAAAAAGAGCGGGTTCATGAACTTAAGAATGCCTATCCCTATTACGACATG
481ATGTTTGCCGTCGATGACCAGGCGACCGCGCGCTTTATCAAGGCTTTCTGGAATGCCCAT
541GTTTACGACTGGAAAACGCTGGAAACCAGCCGCCACGGGGAGTACGGCAAACCGATGGGC
601GCGCTCTGGCAAAGTGATTTTGTCCAACAGCCGCCCTTTTTCGCCACCAAAGGTCTGAGC
661TTTCTCAATGCCGGCAACGACCTGATCTACTCCGCATCGCTGCTGTATCAATACGATGGT
721GACGCTGGCGCACTGACGTGGGCAAAACGGCTGGCCGAACAGTACGTTCTGCCGCGAGAT
781AAGAAGACCGGGCTGGGCGTATACCAGTTTACCCAACCGTTAAAACGCGCCGATACCAGC
841GATGACAGCGACACGCATTCGAAATACGGCGACCGCGCGCAGCGTCAGTTTGGCCCGGM
901CTGGGCCCGGACGCGCTGGAAGGCAATATGCTGCTTAAGGGCCGMCCAGTACGCTCTAT
961TCAGAAMTGCGCTGATGCAGCTTGCCCTGGCAAMTCGCTCGGCAAAGACGGTGACGAT
1021CTCAAAMATGGACTCTTGATGGCCTCAAGGCCTTCGCGACCTACGCTTACGATGAGCAG
1081AATAATACCTTCCGCCCGATGCTGGCCAACGGCACGGATCTCTCCGACTACGCGTTAAM
1141CGCGATGGCTATTATGGAAAMAAGGGACGGTGCTCAAAGCCTATCCGGCGGGMATGAA
1201TTTCTTCTCTCCTATGCCCGCGCCTGGACGCTTGMCCGGATCATGCCATCTGGAAGGTC
1261GCCCGCGGCATCGCGAMGGCCAGGGGTTAGGCGATATCGGTGAACCCGGCGGCACAAAC
1321CGCAGGCTGAATAGCCMACGGAGAATCATCAGCCGTATGCGATTTTCGCGCTTATCGAC
1381CTGTGGCAGTCCACCGGGCAGCGGGATTATTTGACGCTGGCGGATCGCATCGGCGCGAAC
1441ATCATCMCAAGCAGCGCCTCMCGGCTTTTTTGTCGATGATCCTGAGGCAGAATATGCC
1501AGTATCGATAGTATCGCCCCCTATGCGCTTCTCGCCCTGGAAGCCGCCTTCCGCAACACG
1561CCGGACGCGGTCGCTCCGTTCCTGAACGGCGCTGGATTCACGGAAGGCGCTTATCGGATG
1621GCTGACGGAACCGTGCGCTACTCCACCCGAGATGACGAGCTGTTCAGGCTCAGACCCGGT
1681 GAGCAGCTGA AACCGAACGG CAAAAAATAA其中，信號(hào)肽的堿基序列為ATGAAGATTGCAAAAATCAC TCTGGCATTG GGCGTTCTGAGTCTCTTCTC ACTGAATGCG GGTGCC。成熟蛋白理論分子量為63. SkDa0將堿性果膠酶基因plA DNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)。發(fā)現(xiàn)與來(lái)源于EntercAacter sp. 638的果膠裂解酶的核苷酸序列一致性為78. 9 %，氨基酸序列一致性為85. 8%。為此基因的改造并在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供優(yōu)良的基因材料。說(shuō)明PLA是一種新的堿性果膠酶。這也是第一次從克雷伯氏菌中克隆得到堿性果膠酶基因。本發(fā)明還提供了包含上述果膠酶基因的重組ρ IA載體。本發(fā)明還提供了包含上述果膠酶基因plA的重組菌株。本發(fā)明還提供了一種制備堿性果膠酶的方法，包括以下步驟1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組果膠酶的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的果膠酶。本發(fā)明還提供了上述堿性果膠酶的應(yīng)用。本發(fā)明的堿性果膠酶的最適pH為9. 0，在pH7. 5-10. 0之間有80%以上的酶活。具有良好的PH穩(wěn)定性，在pH5. 0-10. 5之間穩(wěn)定；比活797U/mg ；極好的堿性蛋白酶抗性以及易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。做為一種新型的酶制劑，在紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、茶和咖啡發(fā)酵、油提取、含果膠工業(yè)廢水處理及生物技術(shù)等行業(yè)都有應(yīng)用價(jià)值。


圖IplA在大腸桿菌中表達(dá)的果膠酶的SDS-PAGE分析，1，分子量標(biāo)準(zhǔn)；2。3誘導(dǎo)培養(yǎng)基上清；4，穿透峰 5，NTA-O ；6,NTA-20 ；7，NTA_40 ；8，NTA_60 ；9，NTA_80 ；純化的重組果膠酶。圖2本發(fā)明重組果膠酶的最適pH值。圖3本發(fā)明果膠酶的pH穩(wěn)定性。圖4本發(fā)明果膠酶最適反應(yīng)溫度。圖5本發(fā)明果膠酶的熱穩(wěn)定性。圖6本發(fā)明果膠酶的金屬離子抗性
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、菌株及載體宿主大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)，載體 pET_22b (+)， 購(gòu)自于Novagen公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司，連接酶購(gòu)自hvitrogen公司。 果膠、半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸購(gòu)自Sigma公司，其它都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到)。3、培養(yǎng)基
(1)誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基0. 5%果膠，0.5%蛋白胨，0.5%酵母提取物，0. KH2PO4, 0. 2% CuSO4,0. 1% CaCl2, ρΗ9· 0。(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，ρΗ7.0)。說(shuō)明以下實(shí)施例中未作具體說(shuō)明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)施例1克雷伯氏菌果膠酶編碼基因plA的克隆克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)來(lái)源于廣西果汁廠的土樣，提取克雷伯氏菌 (Klebsiella sp.)基因組DNA 將在LB培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)了 2d的菌液IOOOOrpm離心 IOmin,稱取50mg菌泥加500 μ L無(wú)菌水清洗，離心取沉淀的菌體。沉淀的菌體重懸于500 μ L 溶菌酶混合液，37°C溫育lh，再補(bǔ)加酶液100μ L于45°C繼續(xù)保溫30min，至菌液透明后，加 10% SDS至終濃度2%，攪拌約5min至菌液粘度顯著下降，15000rpm離心IOmin去碎片。上清液分別用等體積酚，酚氯仿，氯仿依次抽提。取上層溶液加0. 6-1倍體積的異丙醇常溫沉淀lOmin。16000rpm離心15min。沉淀用70%乙醇清洗，稍離心，將沉淀抽干后用30 μ L 無(wú)菌水溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)發(fā)表的果膠裂解酶的序列比對(duì)結(jié)果找到兩個(gè)保守氨基酸序列保守序列GLF(L)Y(L)WGGH和RQFGPE，并設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并引物PL9-F， 5 ‘ -CTGTTYTAYTGGGGYGGRCA-3 ‘ ；PL9-R, 5 ‘ -CTCNGGNCCRAAYTGTCG-3 ‘ (Y 代表 C/T，R 代表G/A，N代表A/T/C/C)，以克雷伯氏菌Yl的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為 950C 5min ；94°C 30sec, 53-48°C 30sec (其中每個(gè)循環(huán)后復(fù)性溫度下降 0. 5°C )，72°C lmin, 10個(gè)循環(huán)，然后進(jìn)入第二個(gè)循環(huán)程序94°C 30sec,48°C 30sec,72°C lmin，25個(gè)循環(huán)后； 72°C lOmin，瓊脂糖電泳檢測(cè)。得到的片段測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的核甘酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計(jì)方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計(jì)在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每?jī)蓚€(gè)引物之間的距離沒有嚴(yán)格規(guī)定，引物長(zhǎng)度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并將它們分別命名為uspl，卿2，usp3(上游特異性引物)，dspl, dsp2, dsp3(下游特異性引物)見表1。表1果膠酶plA TAIL-PCR特異性引物
權(quán)利要求
1.一種堿性果膠酶PLA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種堿性果膠酶PLA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種堿性果膠酶基因plA，其特征在于，編碼權(quán)利要求2或3所述的果膠酶PLA。
4.如權(quán)利要求3所述的果膠酶基因plA，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO. 3所示。
5.包含權(quán)利要求3或4所述果膠酶基因plA的重組載體。
6.包含權(quán)利要求3或4所述果膠酶基因plA的重組菌株。
7.一種制備果膠酶的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求5重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組果膠酶因的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的果膠酶PLA。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌。
9.權(quán)利要求1或2所述的果膠酶PLA的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種堿性果膠酶PLA及其基因和應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的堿性果膠酶PLA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。本發(fā)明的堿性果膠酶的最適pH為9.0，在pH7.5-10.0之間有80％以上的酶活。具有良好的pH穩(wěn)定性，在pH5.0-10.5之間穩(wěn)定；比活797U/mg；極好的堿性蛋白酶抗性以及易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。做為一種新型的酶制劑，在紡織、造紙、洗滌劑、植物纖維加工、茶和咖啡發(fā)酵、油提取、含果膠工業(yè)廢水處理及生物技術(shù)等行業(yè)都有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102559638SQ20101060922
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者張菁, 苑鵬, 詹志春 申請(qǐng)人:武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司