專利名稱：一種利用ldr技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
多胎性能是畜牧生產(chǎn)的一個(gè)重要經(jīng)濟(jì)性狀，大部分綿羊和山羊是單胎，但有些品種是雙胎，甚至是一胎3羔或4羔，通過(guò)育種的方法可以提高一些品種的產(chǎn)仔數(shù)。繁殖率的遺傳力較低，通過(guò)傳統(tǒng)的育種方法，遺傳進(jìn)展較慢。隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助選擇(molecular marker-as-sisted selection,MAS)育種技術(shù)可以快速提高一些單胎品種的雙胎率，或者提高其胎產(chǎn)仔數(shù)，從而大幅度提高其繁殖力。MAS是通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)直接分析DNA分子的一些突變位點(diǎn)，可以準(zhǔn)確判斷基因型，而且不受時(shí)間的限制，可以做到早期選擇。BMP 15是一種在卵巢表達(dá)的卵母細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在正常情況下主要和卵巢自身產(chǎn)生的GDF9協(xié)調(diào)作用于卵泡，以自分泌或旁分泌方式影響優(yōu)勢(shì)卵泡的發(fā)育和卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。在某些物種的垂體和睪丸中也發(fā)現(xiàn)BMP15少量mRNA的表達(dá)，表明其在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物生殖方面可能起著多重的調(diào)節(jié)作用。將BMP15基因做為多胎性狀主效候選基因研究其與山羊產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系對(duì)山羊的育種有重大的意義。目前檢測(cè)DNA突變位點(diǎn)的方法一般常用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction FragmentLength Polymorphism,RFLP)技術(shù)禾口單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-StrandCon-format ionalPolymorphism,SSCP)技術(shù)，這兩種方法依靠肉眼進(jìn)行結(jié)果的觀察，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)判斷錯(cuò)誤，從而影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法，是利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊BMP15基因GenBank :EU743938中的自5 ‘端第6353處(編碼序列第901處)脫氧核糖核酸是A還是G，確定魯北白山羊的基因型，根據(jù)基因型可以判斷其產(chǎn)仔性能。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法，步驟如下(1)擴(kuò)增用于LDR反應(yīng)包含A901G位點(diǎn)的片段以山羊基因組DNA為模板，在 TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNIPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小為449bp，用于LDR反應(yīng)；所述引物的序列如下(根據(jù)GenBank :EU743938序列設(shè)計(jì)的，包含A901G位點(diǎn))上游引物CTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAA；下游引物CTGGGCAATCATACCCTCAT；(2)進(jìn)行LDR反應(yīng)設(shè)計(jì)三條探針，然后進(jìn)行LDR反應(yīng)；所述三條探針的序列分別如下A901G_M0DIFY P-GACTTGAAAAGGGTGGAGGGAACACTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ；A901G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCT ；A901G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCC ；其中，A901G_M0DIFY的末端帶有FAM修飾(藍(lán)色熒光)，5’端磷酸化，以便與其它兩條特異性探針連接；探針A901G_A的3’末端堿基與A對(duì)應(yīng)，探針A901G_G的3’末端堿基與G對(duì)應(yīng)；(3)分析LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與各基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如下基因型AA的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp，基因型GG的 LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為84bp，基因型AG的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp和84bp的混合。所述步驟(1)中PCR擴(kuò)增的條件和參數(shù)為PCR 反應(yīng)采用 20 μ IQiagen 系包括 2. 0 μ 1 PCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM)，2· 0 μ IdNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，4· 0μ 1 Q-solution (4Χ), 0. 4 μ 1 primer (5ρΜ)，1· 0 μ 1 基因組 DNA (50ng/L)，最后加入 9. 8 μ 1 去離子水。PCR 程序?yàn)?5°C變性 15min，94°C 30s，59°C lm，72°C lm，;35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 7min。反應(yīng)結(jié)束后，取2μ 1反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE中電泳，得到一條清晰的449bp的DNA條帶。所述步驟O)中LDR反應(yīng)的具體步驟為在200μ 1 的 PCR 反應(yīng)管中，分別加入 1 μ 1 buffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix(各 Probe等比混合),0. 05μ 1連接酶(40U/ μ 1),6. 95 μ 1去離子水，最后加入1 μ 1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物。連接反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性2m，94°C 30s,60°C 2min，;35個(gè)循環(huán)。LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度判斷各基因型。上述分析后，可根據(jù)基因判斷產(chǎn)仔性能BMP15基因A901G突變位點(diǎn)的基因型對(duì)對(duì)魯北白山羊產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響(P <0.05)，各基因型效應(yīng)值依次為GGQ. 5621) > AG(2. 5350) > AA(2. 2257), GG型的產(chǎn)羔數(shù)比AA型多0. 33只，AG型比AA型多0. 31只， BMP15基因A901G突變位點(diǎn)可以做為魯北白山羊的多胎分子標(biāo)記。本發(fā)明的利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法，以堿基錯(cuò)配為基礎(chǔ)，使用特異性探針對(duì)特定片段DNA進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時(shí)，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低。結(jié)果分析直接由軟件分析，客觀性強(qiáng)，避免用肉眼判斷電泳圖的主觀誤差及酶切不完全造成的判斷錯(cuò)誤。與其他SNP檢測(cè)技術(shù)相比，LDR檢測(cè)技術(shù)擁有準(zhǔn)確度高、通用性強(qiáng)、通量大、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。


圖1 :BMP15基因用于LDR分析的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。圖 2 :BMP15 基因 A901G 位點(diǎn) LDR 圖譜。圖3 山羊BMP 15突變位點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記對(duì)魯北白山羊進(jìn)行檢測(cè)，步驟如下(1)擴(kuò)增用于LDR反應(yīng)包含A901G位點(diǎn)的片段以山羊基因組DNA為模板，在 TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNIPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小為449bp，與目的片段完全一致，如圖1所示，用于LDR反應(yīng)；所述引物的序列如下(根據(jù)GenBank :EU743938序列設(shè)計(jì)的，包含A901G位點(diǎn))上游引物CTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAA；下游引物CTGGGCAATCATACCCTCAT；PCR擴(kuò)增的條件和參數(shù)為PCR 反應(yīng)采用 20 μ IQiagen 系包括 2. 0 μ 1 PCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM)，2· 0 μ IdNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶(5U/μ 1)，4· 0μ 1 Q-solution (4Χ), 0. 4 μ 1 primer (5ρΜ)，1· 0 μ 1 基因組 DNA (50ng/L)，最后加入 9. 8 μ 1 去離子水。PCR 程序?yàn)?5°C變性 15min，94°C 30s，59°C lm，72°C lm，;35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 7min。反應(yīng)結(jié)束后，取2μ 1反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖凝膠，0.5XTBE中電泳，得到一條清晰的449bp的DNA條帶，凝膠電泳結(jié)果如圖1。(2)進(jìn)行LDR反應(yīng)設(shè)計(jì)三條探針，然后進(jìn)行LDR反應(yīng)；所述三條探針的序列分別如下A901G_M0DIFY P-GACTTGAAAAGGGTGGAGGGAACACTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ；A901G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCT ；A901G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCC ；其中，A901G_M0DIFY的末端帶有FAM修飾(藍(lán)色熒光)，5’端磷酸化，以便與其它兩條特異性探針連接；探針A901G_A的3’末端堿基與A對(duì)應(yīng)，探針A901G_G的3’末端堿基與G對(duì)應(yīng)；LDR反應(yīng)的具體步驟為在200μ 1 的 PCR 反應(yīng)管中，分別加入 1 μ 1 buffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix(各 Probe等比混合),0. 05μ 1連接酶(40U/ μ 1),6. 95 μ 1去離子水，最后加入1 μ 1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物。連接反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性2m，94°C 30s,60°C 2min，;35個(gè)循環(huán)。(3)分析LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與各基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，關(guān)聯(lián)如下基因型AA的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp，基因型GG的 LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為84bp，基因型AG的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp和84bp的混合，如圖2 所示。(4)測(cè)序結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示BMP15基因GenBank :EU743938序列第6353bp (編碼序列第901bp)發(fā)生了 A-G突變，如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法，其特征在于，步驟如下(1)擴(kuò)增用于LDR反應(yīng)包含A901G位點(diǎn)的片段以山羊基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNIPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物大小為 449bp，用于LDR反應(yīng)；所述引物的序列如下 上游引物CTCAGAGTGTTCAGAAGACCAAA ； 下游引物CTGGGCAATCATACCCTCAT ；(2)進(jìn)行LDR反應(yīng)設(shè)計(jì)三條探針，然后進(jìn)行LDR反應(yīng)；所述三條探針的序列分別如下 A901G_M0DIFY P-GACTTGAAAAGGGTGGAGGGAACACTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM ； A901G_A :TTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCT ； A901G_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCCCAGCCCAGCTGCTGGAAGCC ； 其中，A901G_M0DIFY的末端帶有FAM修飾，5，端磷酸化；(3)分析LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABIPRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與各基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，關(guān)聯(lián)如下基因型AA的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp，基因型GG的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為84bp，基因型AG的LDR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為82bp和84bp的混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法，其特征在于所述步驟(1)中PCR擴(kuò)增的條件和參數(shù)為PCR反應(yīng)采用20 μ IQiagen體系，包括 2. 0 μ lPCR-buffer (10 X), 0. 6 μ 1 Mg2+(IOOmM), 2. 0 μ 1 dNTP (20mM/each), 0. 2 μ 1 Taq 酶 (5U/y 1)，4·0μ lQ-solution (4Χ) ,0. 4μ 1 primer (5ρΜ), 1. 0μ 1 基因組 DNA (50ng/L)，最后加入9. 8μ 1去離子水；PCR 程序?yàn)?5°C 變性 15min，94°C 30s，59°C lm, 72 °C lm，；35 個(gè)循環(huán)，最后 72 °C 延伸 7min ；反應(yīng)結(jié)束后，取2 μ 1反應(yīng)產(chǎn)物在3. 0%瓊脂糖凝膠，0. 5 X TBE中電泳，得到一條清晰的 449bp的DNA條帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法，其特征在于所述步驟⑵中LDR反應(yīng)的具體步驟為在200 μ 1的PCR反應(yīng)管中，分別加入 1 μ Ibuffer(IOX), 1 μ 1 Probe Mix (各 Probe 等比混合)，0· 05 μ 1 連接酶 0OU/μ 1)， 6. 95 μ 1去離子水，最后加入1μ 1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物。連接反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性an，94°C30s， 60°C 2min,35 個(gè)循環(huán)；LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度判斷各基因型。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法，步驟如下(1)擴(kuò)增用于LDR反應(yīng)包含A901G位點(diǎn)的片段以山羊基因組DNA為模板，在TaqDNA聚合酶、緩沖環(huán)境、Mg2+、dNTPs存在的情況下，用引物在PCR條件下進(jìn)行擴(kuò)增，用于LDR反應(yīng)；(2)進(jìn)行LDR反應(yīng)設(shè)計(jì)三條探針，然后進(jìn)行LDR反應(yīng)；(3)分析LDR反應(yīng)產(chǎn)物由ABI PRISM-377DNA測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)LDR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與各基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。本發(fā)明的利用LDR技術(shù)檢測(cè)山羊多胎分子標(biāo)記的方法，以堿基錯(cuò)配為基礎(chǔ)，使用特異性探針對(duì)特定片段DNA進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。與其他SNP檢測(cè)技術(shù)相比，LDR檢測(cè)技術(shù)擁有準(zhǔn)確度高、通用性強(qiáng)、通量大、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102174656SQ20111005536
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者劉學(xué)俊, 李淑青, 王會(huì)珍, 董傳河 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)管理干部學(xué)院