專利名稱：一種應用于轉(zhuǎn)基因作物土壤微生態(tài)安全性評價的Biolog ECO微平板技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應用于轉(zhuǎn)基因作物土壤微生態(tài)安全性評價的Biolog ECO微平板技術(shù)，屬轉(zhuǎn)基因生物安全性評估和微生物生態(tài)學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自1983年世界上首例轉(zhuǎn)基因植物獲得成功以來，利用基因工程對農(nóng)作物進行改良和優(yōu)化后在提高產(chǎn)量、改善農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)成分、縮短育種周期、增強抗病蟲性等方面均取得了巨大成就。許多轉(zhuǎn)基因作物如玉米、棉花、大豆等已經(jīng)進入了商業(yè)化生產(chǎn)。然而這些轉(zhuǎn)入了外源基因的作物是否會給人們帶來不可預料的風險卻備受爭議，轉(zhuǎn)基因作物的安全問題也是目前國際社會關(guān)注的熱點。土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場所，土壤微生物既是土壤有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化的執(zhí)行者，又是影響植物營養(yǎng)元素活性的重要因素，土壤微生物多樣性與活性的保持是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)健康、穩(wěn)定的基礎(chǔ)。土壤微生物群落功能多樣性是描述土壤微生物群落特征的一個重要指標，可以反映土壤狀況的重要信息。因此，開展轉(zhuǎn)基因植物對土壤微生物群落功能影響的研究對于科學評價轉(zhuǎn)基因植物的潛在風險具有重要意義。目前研究土壤微生物群落功能主要通過兩種方式一種是通過研究土壤酶活性變化來探討微生物群落功能的變化；另一種是基于“碳源利用水平”的代謝指紋法來研究微生物群落功能。Biolog ECO微平板就是通過微生物對單一碳源的利用情況來了解其微生物的動態(tài)，微生物對碳源的利用能力是表征土壤微生物生長情況的主要指標，可用于估價土壤微生物群落代謝多樣性和功能多樣性的研究。Biolog ECO微平板方法由于操作簡便，培養(yǎng)周期短，得到了研究者的青睞，是研究微生物代謝特征的主流方法之一，與DGGE、PLFA等分子手段互為補充、相互印證，被用于評估植物對重金屬污染土壤、養(yǎng)殖場土壤、曝氣廢水處理反應器的修復效果、長期施肥等農(nóng)田管理措施對土壤微生物的影響等。然而應用此技術(shù)評價轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生物群落功能影響的研究較為匱乏，急需建立完善相關(guān)技術(shù)體系。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種分布廣泛的革蘭氏陽性細菌，在其芽孢形成過程中會產(chǎn)生Bt殺蟲晶體蛋白，該Bt殺蟲毒蛋白又可分為α外毒素、β外毒素、S內(nèi)毒素和虱因子，其中用于轉(zhuǎn)基因作物的主要是δ內(nèi)毒素。δ內(nèi)毒素被靶標昆蟲取食后，在中腸的堿性和還原性環(huán)境中降解為60kD左右的活性肽，并與昆蟲中腸上皮細胞的特異性受體結(jié)合，引起細胞膜穿孔，破壞細胞滲透平衡，致使細胞腫脹破裂， 最終導致昆蟲癱瘓或死亡。由于Bt毒蛋白對敏感害蟲專一性強、效果好，且對人畜安全，因此Bt基因是目前轉(zhuǎn)基因作物研究中應用最廣泛的抗蟲基因。因此，建立一種適用于評價轉(zhuǎn)Bt基因作物對根際土壤微生物群落功能影響的 Biolog ECO微平板技術(shù)，對于完善轉(zhuǎn)基因作物土壤生態(tài)安全評價技術(shù)體系尤其至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種應用于轉(zhuǎn)基因作物土壤微生態(tài)安全性評價的Biolog ECO微平板技術(shù)，特別是提供一種快捷、敏感地評價轉(zhuǎn)Bt基因植物對根際土壤微生物群落功能影響的研究方法，以解決傳統(tǒng)方法工作量繁重、誤差大、不全面等問題， 從而將Biolog ECO微平板技術(shù)成功應用于轉(zhuǎn)Bt基因作物對根際土壤微生態(tài)安全性評價中。為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)。本發(fā)明所述的應用于轉(zhuǎn)基因作物土壤微生態(tài)安全性評價的Biolog ECO微平板技術(shù)，其工藝流程如

圖1所示，具體包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因親本作物根際土壤樣品；2)進行 Biolog ECO 實驗；3)平均吸光度(AWCD)及多樣性指數(shù)的計算；4)主成分(PCA)分析。其中，上述方法中，所述的生育期包括苗期、分蘗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期。所述的轉(zhuǎn)基因作物優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因作物，如轉(zhuǎn)Bt基因水稻、轉(zhuǎn)Bt基因棉花。所述的根際土壤樣品的收集為稱取根際土樣(分別為轉(zhuǎn)基因作物或非轉(zhuǎn)基因親本作物的根際土壤)，放入無菌水中，二者比例為1 99 (g/ml)，室溫下在搖床上中速振蕩，-20°C保存。所述的Biolog ECO實驗步驟為將得到的根際土壤樣品溶液從冰箱中取出，進行 1000倍稀釋，接種到Biolog ECO微平板，然后放入保濕的無菌塑料容器中恒溫培養(yǎng)； 分別在培養(yǎng)對11、4811、7211、9611、12011、14411，測定波長為590nm時，對該微平板進行讀數(shù)。本發(fā)明采用平均吸光度(AWCD)來描述微生物代謝強度，其計算公式如下AWCD = [Σ (Ci-R)]/31其中，Ci是除對照孔外各孔的吸光度值，R是對照孔的吸光度值。AWCD值可用以衡量微生物利用不同碳源的整體能力，通過對一系列讀數(shù)時間的 AffCD值變化趨勢的差異來分析樣品間微生物群落代謝功能的不同。由于AWCD值隨時間變化的趨勢線具有直觀可見的特點，這樣更易于發(fā)現(xiàn)樣品間碳源利用能力的差異。本發(fā)明所述的多樣性指數(shù)包括Siannon多樣性指數(shù)(H' )、Simpson指數(shù)⑶、 Mcintosh多樣性指數(shù)(U)，以及Siarmon均勻度和Mchtosh均勻度，它們的計算公式分別如下H' = - Σ PilnPiD=I-E Pi權(quán)利要求
1.一種應用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價的Biolog ECO微平板技術(shù)，包括以下步驟(1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因親本作物根際土壤樣品；(2)進行Biolog ECO 實驗；(3)平均吸光度AWCD及多樣性指數(shù)的計算；(4)主成分PCA分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的生育期包括苗期、分蘗期、 拔節(jié)期、抽穗期、成熟期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因作物優(yōu)選轉(zhuǎn)Bt基因作物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述根際土壤樣品的收集如下稱取轉(zhuǎn)基因作物或非轉(zhuǎn)基因根際土樣，放入無菌水中，二者比例為1 99(g/ml)，室溫下在搖床上中速振蕩，-20°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的BiologECO實驗步驟為 將得到的根際土壤樣品溶液從冰箱中取出，進行1000倍稀釋，接種到Biolog ECO微平板， 然后放入保濕的無菌塑料容器中恒溫培養(yǎng)；分別培養(yǎng)Mh、48h、72h、96h、120h、144h， 然后在測定波長為590nm下，對該微平板進行讀數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的多樣性指數(shù)包括aiarmon多樣性指數(shù)H'、Simpson指數(shù)D、Mcintosh多樣性指數(shù)U,以及Shannon均勻度和Mcintosh 均勻度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微平板技術(shù)，其特征在于，所述的主成分PCA是指BiologECO 微平板中的31種碳源，分別為胺類、氨基酸、糖類、羧酸類、聚合物類。
8.權(quán)利要求1 7任一項所述的BiologECO微平板技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應用于轉(zhuǎn)基因作物根際土壤微生態(tài)安全性評價的Biolog ECO微平板技術(shù)，包括以下步驟1)收集不同生育期的轉(zhuǎn)基因作物、非轉(zhuǎn)基因親本作物根際土壤樣品；2)進行Biolog ECO實驗；3)平均吸光度AWCD及多樣性指數(shù)的計算；4)主成分PCA分析。本發(fā)明技術(shù)可用于評價轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生物群落功能的影響，并由此評價轉(zhuǎn)基因作物對根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)的潛在安全風險。
文檔編號C12Q1/04GK102251016SQ20111020624
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者唐雪明, 朱宏, 王金斌, 程凱, 趙凱, 魏曼曼 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院