專利名稱：可用于預(yù)防慢性重金屬中毒的重組食品級乳酸菌、其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種含人IA型金屬硫蛋白融合蛋白的重組食品級乳酸菌，及其制備方法及所述重組食品級乳酸菌在制備用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著中國各產(chǎn)業(yè)工業(yè)化的發(fā)展，重金屬污染已成為社會十分關(guān)注的問題。大量的有毒重金屬離子通過水、空氣、土壤以及生物鏈污染到人類賴于生存的動植物產(chǎn)品及水源上，給人們的健康帶來潛在的危害。一般來說，重金屬污染是指鉛、汞、鎘、砷等重金屬離子的污染，常以慢性中毒的方式危害于人類，而這種危害又往往容易被人們所忽視。重金屬污染的主要來源一方面是未經(jīng)處理的工業(yè)廢水、廢氣、廢渣的隨意排放。另一方面則是農(nóng)業(yè)上濫用的農(nóng)藥和化肥。有毒重金屬可以隨著各種食物和水進入人體并造成極大危害[Rusyniak DE, et al.，2010，EXS, 100 :365-396 Johri N, et al.，2010，Biometals, 23 (5) :783-792]。1)鉛對人體各系統(tǒng)均有毒害作用，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，鉛中毒早期可出現(xiàn)高級神經(jīng)機能障礙，而晚期則可造成器質(zhì)性腦病及神經(jīng)麻痹；在造血系統(tǒng)方面，鉛可以干擾血紅素的合成而造成貧血。此外，鉛對兒童的生長發(fā)育影響極大，過量的鉛可以嚴(yán)重妨礙兒童智力正常發(fā)育?；蒙樵诃h(huán)境中大都以無機砷和烷基砷的形態(tài)存在，其中三價砷化合物，如三氧化二砷，具有很大的毒性。人體如果長期接觸砷，會引起細胞中毒，甚至?xí)T發(fā)惡性腫瘤。此外，砷還能透過胎盤損害胎兒的正常發(fā)育。3)汞離子早已成為大眾健康的公害， 可以在動物體內(nèi)蓄積，其對人體的神經(jīng)系統(tǒng)、腎、肝臟等器官均可產(chǎn)生不可逆的損害。4)鎘進入體內(nèi)可損害血管，導(dǎo)致組織缺血，引起多系統(tǒng)損傷；還可干擾銅、鈷、鋅等微量元素的代謝，阻礙腸道吸收鐵，并能抑制血紅蛋白的合成和肺泡巨噬細胞的氧化磷?；拇x過程， 進而引起肺、腎、肝損害，同時也具有致癌、致畸和致突變作用。從上述資料可知，重金屬污染的問題實際也是食品安全的重大問題。受到重金屬污染的蔬菜、水果、糧食、魚肉等并不能通過多浸泡、多清洗或多煮來去除。相反，在食物鏈的生物放大作用下，其能成千上萬倍地富集，最后進入人體。隨著蓄積量的增加，機體便出現(xiàn)各種病態(tài)反應(yīng)。目前，防治重金屬污染主要還是預(yù)防為主，臨床上治療重金屬中毒首選藥物是依地酸二鈉鈣，其次是二已烯二胺五乙醇三鈉鈣和二硫醇鈉，但這些學(xué)藥物只能靜脈給藥，不能口服，而且不能長期使用。另外，這些藥物對幾乎所有金屬都具有絡(luò)合作用，為非特異性吸附，故對人體有益的金屬也因此喪失，如鋅、鐵等[Flora SJ和I^chauri V, 2010, Int. J. Environ. Res. PublicHealth,7(7) :2745-2788]。金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類廣泛存在于動物、植物以及微生物中富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，具有非常保守的一級結(jié)構(gòu)和相似的空間結(jié)構(gòu)。由于具有結(jié)合重金屬離子、清除自由基、抗輻射以及調(diào)節(jié)微量元素平衡等重要生理功能，且與動物機體的生長發(fā)育及部分疾病的發(fā)病機理有著密切的關(guān)系，因此，MT 一直是生物學(xué)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的熱點之一 (Liu et al.，1998，Toxicol. Sci. ,46 :197-203 ；Zeng et al.，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 :9984-9988 ；Zangger et al.，2001，F(xiàn)ASEB J,15 1303-1305 ；Li et al.，1998，Nucleic Acids Res.，26 :5182-518 。MT富含巰基及其重金屬結(jié)合能力決定了它在重金屬解毒方面起著重要的作用。MT 的巰基基團(-SH)能強烈螯合有毒金屬HgllKCcUAs等，其螯合1 的強度比Si大200倍， 而螯合Cd的強度又比1 大10倍。實驗證明，MT的解毒機理主要是螯合進入細胞內(nèi)的重金屬離子，形成無活性的重金屬-MT復(fù)合物，隨后將之排出體外。在臨床應(yīng)用上，MT已被醫(yī)療科研人員視為最理想的生物整合解毒劑[Flora SJ和I^achauri V, 2010, Int. J. Environ. Res. Public Health,7 (7) :2745-2788]。利用哺乳動物、酵母以及大腸桿菌表達MT的生產(chǎn)方法已有許多報道 (CN101144093B ；ZL96100897. 0 ；CN1803840A ；CN1348010A ；CN1376719A)。然而，利用動物生產(chǎn)以及重金屬誘導(dǎo)獲得的可溶性MT，產(chǎn)量極低且提純步驟繁復(fù)。而在利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)MT方面，則主要以大腸桿菌作為優(yōu)選宿主細胞(Hong et al. , 2001,Protein Expression andPurification,21 :243-250)。盡管大腸桿菌表達系統(tǒng)具有表達量高、易于培養(yǎng)和操作以及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，然而，大腸桿菌所具有細菌內(nèi)毒素以及具有致病性，又大大限制了重組蛋白，例如MT，在醫(yī)藥、食品以及化妝品等方面的廣泛應(yīng)用。為此，尋找一種理想的食品級表達載體表達MT就具有十分重要的研究意義和應(yīng)用價值。乳酸菌(lactis acid bacteria, LAB)是一類能大量發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性細菌，其包括乳酸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌等十幾個屬，在食品工業(yè)各個領(lǐng)域中的長期應(yīng)用已證明其無致病性，被公認(rèn)為安全級(generally recognized as safe, GRAS)微生物。在人和大多數(shù)動物體內(nèi)，乳酸菌廣泛分布于消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、 口腔系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)和糞便當(dāng)中。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌具有提供人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)、維持泌尿生殖系統(tǒng)健康、增強機體免疫作用、降低膽固醇含量、改善胃腸道功能以及抗腫瘤作用等多種重要的生理功能。而在這些功能中，后兩種研究得最多，也最有應(yīng)用價值。乳酸菌在人體消化道和生殖道中大量存在，其它部位比較少。一般情況下，從口腔、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸到直腸，其數(shù)量會逐漸增加(IO3-IO12/每克細菌)。其改善胃腸道功能的機理在于一方面，其通過自身及其代謝產(chǎn)物和其它細菌之間的相互作用，維持和保證菌群最佳優(yōu)勢組合以及這種組合的穩(wěn)定，抑制有害菌的增殖，降低了有害菌毒素的產(chǎn)生；另一方面，通過產(chǎn)酸、表達酶類和細菌素、合成維生素以及分解膽鹽維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。而在抗腫瘤活性方面，乳酸菌可以通過降解或者吸附致癌物、阻止腸內(nèi)致癌物的形成、增強宿主免疫系統(tǒng)、產(chǎn)生抗突變的物質(zhì)、改變腸道的生理生化環(huán)境以及通過增加NADPH還原酶的活性等方面來顯著改善人體的生理機能，抑制腫瘤細胞的增殖[賈士芳郭興華，1996，生物工程進展，16 ⑵:16-20]。有鑒于其具有極其重要應(yīng)用價值，從20世紀(jì)80年代開始，人們就開始致力于對各種乳酸菌，尤其是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的生物學(xué)特性和分子機制研究。乳球菌作為表達外源蛋白的理想菌株有其獨特的優(yōu)勢首先，該菌已經(jīng)進行全基因組測序，其所有的功能基因以及生化途徑一清二楚；其次，乳球菌抗原性弱，不會產(chǎn)生內(nèi)毒素，宿主本身不會引起強烈的免疫應(yīng)答；再次，乳球菌本身分泌蛋白較少，Usp45(—種分子量為45kDa的未知蛋白)是迄今唯一可檢測由乳酸乳球菌分泌的蛋白。這一特點減少了載體自身蛋白對外源分泌蛋白的干擾；最后，乳球菌不在胃腸道內(nèi)定殖，這一特點可以避免因其長期定殖而導(dǎo)致的免疫耐受。目前，乳球菌已作為一種食品級表達宿主用于表達各種抗原、生長因子以及功能蛋白。乳球菌屬中的質(zhì)粒是研究最多的乳酸菌質(zhì)粒，作為理想的表達載體，現(xiàn)時已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)的乳酸菌載體都帶有一個或多個編碼特定抗生素(如紅霉素、氯霉素等)抗性的基因，如果將抗生素抗性基因投放到環(huán)境中或人和動物體內(nèi)，由于抗性因子的轉(zhuǎn)移，將會對生物安全性產(chǎn)生嚴(yán)重后果。為了構(gòu)建一個食品級的表達載體，最有效的辦法就是用安全的食品級標(biāo)記替代抗生素抗性標(biāo)記?，F(xiàn)時，用于乳球菌表達系統(tǒng)的食品級選擇性標(biāo)記主要有三類糖類利用標(biāo)記、營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記和編碼細菌素抗性。1)糖類作為選擇標(biāo)記，主要是利用某種糖(如蜜二糖、乳糖、D-木糖等)作為發(fā)酵底物，將能發(fā)酵這種物質(zhì)的酶基因(例如，α-半乳糖苷酶)克隆并與表達載體連接，然后轉(zhuǎn)化到不能利用這種物質(zhì)的乳球菌中進行表達，這樣就可通過該物質(zhì)作為底物來篩選；幻營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。這是一類為以細菌管家基因缺陷株為受體菌，在質(zhì)粒上克隆入同源或異源的受體菌缺陷基因(如胸苷酸合成酶、氨基酸消旋酶、赭石突變抑制基因等)作為外源基因穩(wěn)定表達的選擇標(biāo)記；幻細菌素抗性或免疫性標(biāo)記。某些細菌通過核糖體機制可以產(chǎn)生具有抑菌活性的蛋白質(zhì)，而其本身對所產(chǎn)這類細菌素具有免疫性。對于一些不能產(chǎn)生這類物質(zhì)的乳酸菌， 細菌素(如nisin)就可以作為篩選標(biāo)記。本發(fā)明的主要目的就是實現(xiàn)MT融合蛋白在乳酸菌中持續(xù)表達，由于重金屬離子可以自由通過乳酸菌的細胞膜，因此，乳酸菌內(nèi)的MT可以將人體胃腸道內(nèi)所含的有毒重金屬離子結(jié)合，形成無毒的復(fù)合物。最后，該工程菌從人體內(nèi)排出，從而有效預(yù)防人體慢性重
金屬中毒。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述研究背景，本發(fā)明涉及一種含人IA型金屬硫蛋白 (Humanmetallothionein-LhMT-IA)融合蛋白的重組食品級乳酸菌，及其制備方法，特別是涉及利用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽(Small Ubiquitin-related Modifier, SUMO)和 hMT-IA 進行融合表達的方法。 本發(fā)明將編碼上述融合蛋白的基因克隆到乳酸菌組成型食品級表達載體pMG36m中，然后轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌MG1363，并利用蜜二糖作為碳源進行重組子篩選。重組乳酸工程菌在發(fā)酵過程中能持續(xù)表達含IA型金屬硫蛋白的融合蛋白，且該蛋白具有結(jié)合生活環(huán)境中重金屬Pb、Cd以及Hg的能力。本發(fā)明還涉及所述重組食品級乳酸菌在制備用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明涉及以下各項1. 一種表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌，其通過下述方法制備構(gòu)建一種以α-半乳糖苷酶為抗性篩選標(biāo)記的表達含人IA型金屬硫蛋白融合蛋白的重組表達載體，并轉(zhuǎn)化到乳酸菌宿主細胞中。2.上述1中所述的重組食品級乳酸菌，其中所述的融合蛋白由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽和人IA型金屬硫蛋白組成，且三種蛋白是按所述順序從融合蛋白的N端到C端依次編碼(圖2)。3.上述2中所述的重組食品級乳酸菌，其中所述谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示；所述小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No 2 所示；人IA型金屬硫蛋白相關(guān)修飾蛋因子蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。4.上述1中所述的重組食品級乳酸菌，其中所述抗性篩選標(biāo)記為α -半乳糖苷酶 (SEQ ID No :4)。5.上述1-4中任何一項的重組食品級乳酸菌，其中所述融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No 5 所示。6上述1-4中任何一項的重組食品級乳酸菌，其中所述重組表達載體衍生于 pMG36e(圖 1，SEQ ID No :6)。7.上述1中的重組食品級乳酸菌，其中所述的乳酸菌宿主細胞選自乳球菌(例如，乳球菌MG1363、LM0230、MG1614)，糞腸球菌(例如，糞腸球菌OGIX、FA2-2)，或植物乳桿菌(例如，ATCC 8014)，優(yōu)選乳酸乳球菌MG1363。8. 一種制備表達含人IA型金屬硫蛋白融合蛋白的重組食品級乳酸菌的方法，該方法包括以下步驟1)構(gòu)建以α -半乳糖苷酶為抗性篩選標(biāo)記的表達含人IA型金屬硫蛋白融合蛋白的重組表達載體；2)將1)中構(gòu)建的重組表達載體轉(zhuǎn)化乳酸菌宿主細胞中，并且用含蜜二糖的乳酸菌培養(yǎng)基(成分2%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.4%氯化鈉，0. 15%乙酸鈉，0.5%蜜二糖和 1.5%瓊脂粉)篩選轉(zhuǎn)化成功的重組乳酸菌。9.上述8中所述的方法，其還包括下述步驟3)在適于以可溶形式表達融合蛋白的條件下培養(yǎng)步驟幻中被轉(zhuǎn)化的重組乳酸菌；和4)在幻的重組乳酸菌內(nèi)表達出所述含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白。10.根據(jù)上述8所述的方法，其中所述的乳酸菌宿主細胞選自乳球菌(例如，乳球菌MG1363、LM0230、MG1614)，糞腸球菌(例如，糞腸球菌0GIX、FA2_2)，或植物乳桿菌(例如，ATCC 8014)，優(yōu)選乳酸乳球菌MG1363。11.根據(jù)上述9的方法，其中所述適于以可溶形式表達融合蛋白的條件是指在含有0. 5%蜜二糖的乳酸菌培養(yǎng)基(成分2%蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 4%氯化鈉，0. 15%乙酸鈉和0. 5%蜜二糖)中，37°C厭氧靜置培養(yǎng)M小時。12.上述1中表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌在制備用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用。13.上述12中所述的應(yīng)用，其中所述的重金屬是指鉛(Pb)、鎘(Cd)、汞(Hg)或它們的任意組合。14. 一種用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的藥物，其包含藥效學(xué)有效量的上述1-7中任一項所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌。15. 一種用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的食品，其包含有效量的上述1-7中任一項所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌。16. 一種用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的化妝品，其包含有效量的上述1-7中任一項所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌。更具體地，在本發(fā)明的重組表達載體中，其中所述融合蛋白中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(SEQ ID No :7)、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽的核苷酸序列(SEQ ID No :8)、人IA型金屬硫蛋白的核苷酸序列(SEQ ID No 9)以及α -半乳糖苷酶的核苷酸序列(SEQ ID No 10)可以是天然來源中篩選的野生序列或人工化學(xué)合成的序列。在本發(fā)明的一個方面中，其中所述小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽是指釀酒酵母泛素相關(guān)修飾因子(Smt3 or yeast Small Ubiquitin-relatedModifier)成熟肽。在本發(fā)明的一個方面中，其中所述的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是指日本血吸蟲 (Schistosoma japonicum)谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的一個方面中，其中所述的α-半乳糖苷酶是指植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum) α -半乳糖昔醇。得到編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽以及人IA型金屬硫蛋白融合蛋白基因的優(yōu)選方法是人工合成方法，因為這樣可以避免氨基酸密碼子偏好性的影響，從而增加目的蛋白的表達量?？梢园凑誌tatura等人所述的技術(shù)(Science，1977， 198 =1056-1063)來合成基因，也可以利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)從宿主基因組中獲得和鑒定基因。而本領(lǐng)域已知的技術(shù)包括進行基因的合成、克隆和表達載體的構(gòu)建、DNA序列分析及鑒定、宿主細胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)以及表達產(chǎn)物的分離鑒定等操作(參見Sambrook et al., Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY,1989)?？梢允褂萌魏我环N適于在其中以高效表達所需蛋白質(zhì)(由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽以及人IA型金屬硫蛋白組成的融合蛋白)的乳酸菌作為宿主，這樣的菌株包括乳球菌(例如，MG1363、LM0230、MG1614)、糞腸球菌(例如，0GIX、FA2_2) 以及植物乳桿菌(例如，ATCC 8014)等。本發(fā)明優(yōu)選的宿主是乳酸乳球菌MG1363(購自 NIZO Co. Ltd. , Netherlands)。本發(fā)明涉及一種制備表達含人IA型金屬硫蛋白融合蛋白的重組食品級乳酸菌的方法，該方法包括以下步驟1)構(gòu)建以α -半乳糖苷酶(a -galactosidase)為抗性篩選標(biāo)記的表達含人IA型金屬硫蛋白融合蛋白的重組表達載體；2)將1)中構(gòu)建的重組表達載體轉(zhuǎn)化乳酸菌宿主細胞中，并且用含蜜二糖的乳酸菌培養(yǎng)基(成分2%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.4%氯化鈉，0. 15%乙酸鈉，0.5%蜜二糖和 1.5%瓊脂粉)篩選轉(zhuǎn)化成功的重組乳酸菌。優(yōu)選地，上述方法還可以包括下述步驟3)在適于以可溶形式表達融合蛋白的條件下培養(yǎng)步驟幻中被轉(zhuǎn)化的重組乳酸菌；4)在幻的重組乳酸菌內(nèi)表達出由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽和人IA型金屬硫蛋白組成的融合蛋白。優(yōu)選地，其中所述的乳酸菌宿主細胞選自乳球菌(例如，MG1363、LM0230、 MG1614)，糞腸球菌(例如，0GIX、FA2-2)，或植物乳桿菌(例如，ATCC 8014)，優(yōu)選乳酸乳球菌 MG1363。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明涉及一種制備含人IA型金屬硫蛋白 (Human metallothionein-IA, hMT-IA)融合蛋白的重組食品級乳酸菌的方法，該方法包括以下步驟1)人工合成編碼由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽、人IA型金屬硫蛋白組成的融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID No=Il)；2)提供編碼α-半乳糖苷酶的核苷酸序列(SEQ ID No 10)；3)從植物乳桿菌(LactcAacillus ρlantarum)中獲得編碼α -半乳糖苷酶的核苷酸序列，然后用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Nsi I對編碼α-半乳糖苷酶的核苷酸序列進行酶切反應(yīng)；4)將步驟(3)中核苷酸序列連接到用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Nsi I處理過的乳酸菌組成型表達載體pMG36e上，獲得重組表達質(zhì)粒pMG36m ；5)用步驟(4)的重組表達載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)娜樗峋拗骷毎鸐G1363中，蜜二糖作為碳源篩選重組子；6)從陽性重組子中抽提重組表達質(zhì)粒pMG36m，然后利用限制性內(nèi)切酶Mc I以及 Sph I對該重組質(zhì)粒進行酶切，然后與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的步驟(1)中核苷酸序列相連，獲得重組表達質(zhì)粒pMG36m-GSMT ；7)用步驟(6)的重組表達載體轉(zhuǎn)化乳酸菌宿主細胞MG1363中，蜜二糖作為碳源篩
選重組子；8)在適于以可溶形式表達融合蛋白的條件下培養(yǎng)步驟7)中被轉(zhuǎn)化的乳酸菌宿主細胞；9)通過分子生物學(xué)技術(shù)，例如鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(Polymerase chainreaction， PCR)、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以及蛋白質(zhì)雜交技術(shù)(Western blot，WB)，篩選和分析高效表達目的融合蛋白的重組乳酸菌表達菌株。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所述適于以可溶形式表達融合蛋白的條件是指在含有 0.5%蜜二糖的乳酸菌培養(yǎng)基(成分2%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.4%氯化鈉，0. 15%乙酸鈉和0.5%蜜二糖)中，37°C厭氧靜置培養(yǎng)M小時。毋庸置疑地，本發(fā)明所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌可以用于制備食品，所述食品包括可以含有食品級乳酸菌的所有種類的食品，例如， 酸奶，諸如純酸奶、調(diào)味酸奶或果肉酸奶等。并且，包含本發(fā)明所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌的食品還具備預(yù)防人慢性重金屬中毒的功效。因此，本發(fā)明提供一種預(yù)防人慢性重金屬中毒的食品，其包含有效量的本發(fā)明所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌。本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌用于制備用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的食品的應(yīng)用。本發(fā)明還提供所述表達由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽、人IA型金屬硫蛋白組成的融合蛋白的重組食品級乳酸菌可以在藥品及化妝品制劑方面應(yīng)用包括將上述的重組食品級乳酸菌加入本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的藥物載體或賦形劑，按照化妝品領(lǐng)域的常規(guī)方法制成適于外用的霜劑、乳化劑或者水劑等劑型；也可以將上述的重組食品級乳酸菌加入藥品領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的載體或賦形劑并按照藥品領(lǐng)域的常規(guī)方法制成適于口服的固態(tài)或者液態(tài)藥品。本發(fā)明優(yōu)選藥品方面的應(yīng)用。本發(fā)明的重組食品級乳酸菌可以單獨或組合物的形式用作預(yù)防人類重金屬中毒的藥品，其中所述的組合物形式，包括片劑、包衣片劑、糖錠劑、硬和軟明膠膠囊、溶液、乳劑或混懸劑。上述藥物組合物可以通過用藥用惰性的無機或有機載體加工本發(fā)明的重組乳酸菌來獲得。例如可以將乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其鹽等用作這些用于片劑、包衣片劑、糖錠劑、和硬明膠膠囊的載體。軟明膠膠囊的適當(dāng)載體有，例如，植物油，蠟， 脂肪，半固體和液體多元醇等。然而，取決于活性物質(zhì)的性質(zhì)，在軟明膠膠囊的情形中通常不需要載體。生產(chǎn)溶液和糖漿的適當(dāng)載體有，例如，水，多元醇，甘油，植物油等。栓劑的適當(dāng)載體有，例如，天然或硬化油，蠟，脂肪，半液體或液體多元醇等。此外，藥物組合物可以含有防腐劑，增溶劑，穩(wěn)定劑，潤濕劑，乳化劑，甜味劑，著色劑，調(diào)味劑，改變滲透壓的鹽，緩沖液，掩蔽劑或抗氧化劑。它們也可以還含有其它的在重金屬中毒治療上有價值的藥用物質(zhì)，例如二己烯二胺五乙醇三鈉鈣和二硫醇鈉。因此，本發(fā)明提供本發(fā)明所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌在制備用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用，其中所述的重金屬是指鉛0 )、鎘(Cd)、汞(Hg)或它們的任意組合。本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的藥物或化妝品，其包含藥效學(xué)有效量的本發(fā)明所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該注意，上述“藥學(xué)有效量”或“有效量”意指治療有效量，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)、經(jīng)過簡單的、有限次的實驗即可確定其具體的數(shù)值。


從下面結(jié)合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中圖1.乳酸菌表達質(zhì)粒pMG36e圖譜；圖2.融合蛋白結(jié)構(gòu)圖；圖3.融合蛋白Western Blot檢測(1.表示空白對照；2-3.融合蛋白與谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶抗體反應(yīng)；4-6.融合蛋白與小鼠MT抗體反應(yīng))；圖4.不同劑量的重組乳酸菌對染鎘大鼠肝組織影響的病理切片分析，圖中數(shù)字說明1、2為對照組(生理鹽水組)；3、4為模型組(氯化鎘溶液處理組，0.65mg/ml/d) ；5、 6為含空載體乳酸菌組(0. 65mg/ml/d氯化鎘溶液+IxlO8個細胞/ml/d含pGM36m空載體的乳酸菌)；7、8為高劑量乳酸菌組(0. 65mg/ml/d氯化鎘溶液+IxlO8個細胞/ml/d重組乳酸菌)；9、10為中劑量乳酸菌組(0.65mg/ml/d氯化鎘溶液+IxlO7個細胞/ml/d重組乳酸菌)； 11、12為低劑量乳酸菌組(0. 65mg/ml/d氯化鎘溶液+IxlO6個細胞/ml/d重組乳酸菌)。序列表說明為了清楚起見，以下對后附序列表中各個序列作簡要說明SEQ ID NO. 1 日本血吸蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列(參見AAC00518 ；N 端-C端，共211個氨基酸)；SEQ ID NO. 2 釀酒酵母泛素相關(guān)修飾因子成熟肽的氨基酸序列(參見AAB01675 以及 Johnson，Ε. S. 2004，Annu. Rev. Biochem.，73，355-382 ；N 端-C 端，共 98 個氨基酸)；
SEQ ID NO. 3 人IA型金屬硫蛋白的氨基酸序列(參見NP_005937 ；N端-C端，共 61個氨基酸)；SEQ ID NO. 4 植物乳桿菌α -半乳糖苷酶的氨基酸序列(參見CAI60220，N端-C 端，共738個氨基酸)；SEQ ID NO. 5 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽和人IA型金屬硫蛋白組成的融合蛋白的氨基酸序列(N端-C端，共370個氨基酸)；SEQ ID NO. 6 乳酸乳球菌表達質(zhì)粒pMG36e的核苷酸序列(5，_3，，共3611個堿基)SEQ ID NO. 7 編碼日本血吸蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列(參見AF044411， 5，-3，，共636個堿基)；SEQ ID N0. 8 編碼釀酒酵母小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽的核苷酸序列(參見 Schwartz D. C. et al. ,2003, Trends Biochem. ki.，28 :321-328 ;5，-3，，共 294 個堿基)；SEQ ID NO. 9 編碼人IA型金屬硫蛋白的核苷酸序列(參見NM_005946，5，_3，，共 186個堿基)；SEQ ID N0. 10 含有EcoR I和Nsi I限制性內(nèi)切酶酶切位點的編碼植物乳桿菌 α-半乳糖苷酶(Mel Α)的核苷酸序列(參見AJ888516，5，-3，，共2235個堿基)；SEQ ID NO. 11 編碼由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽和人 IA型金屬硫蛋白組成的融合蛋白的核苷酸序列(5’ _3’，共1113個堿基)；SEQ ID N0. 12 :mel AF(5，_3，，共 32 個堿基)SEQ ID N0. 13 :mel AR(5，_3，，共 29 個堿基)SEQ ID N0. 14 =GSMT-F(5‘ _3，，共 35 個堿基)SEQ ID N0. 15 =GSMT-R(5‘ _3，，共 36 個堿基)SEQ ID N0. 16 經(jīng)EcoR I和Nsi I雙酶切表達質(zhì)粒pMG36e后得到的載體DNA大片段(5，-3，，共2589個堿基)SEQ ID N0. 17 含Sac I和Sph I限制性內(nèi)切酶酶切位點的編碼由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽和人IA型金屬硫蛋白組成的融合蛋白的核苷酸序列，GSMT(5，-3’，共 1131 個堿基)
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。需要說明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，下述實施例中所用的試劑、酶類等除特別說明外，均為可從試劑公司商購的分析純級別的試劑或酶類。實施例1 植物乳桿菌中編碼α -半乳糖苷酶基因的獲得將植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum(Orla-Jehsen)Holland, ATCCl 1095, 廣東省微生物菌種保藏中心，編號GIM1. 191)菌株在GM17平板[成分3. 725% M17肉湯 (M17Broth，購自 Biokar Diagnostics, France)，0. 5 %葡萄糖，1. 5 %瓊脂粉]上進行菌種活化，37°C厭氧培養(yǎng)48h。然后，挑取單克隆轉(zhuǎn)接至GM17液體培養(yǎng)基[成分3. 725% M17 肉湯，0. 5%葡萄糖]，37°C厭氧靜置培養(yǎng)直至0D_ = 0. 6，離心收集菌體并利用細菌基因組提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction KitVer. 2· 0，購自大連寶生物工程有限公司，大連，中國)抽提基因組DNA。以該基因組DNA為模板，加入mel AF (SEQ ID NO. 12)和mel AR(SEQID NO. 13)(均由中國上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)作為上下游引物，再加入dNTP (各2.5 μ mol · LllO μ 1，IOx PCR pfu緩沖液 10 μ 1以及pfu Taq DNA聚合酶1 μ 1 (5U/μ 1)，加水至總體積為100 μ 1，按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件(94°C變性4分鐘后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸180秒，共30個循環(huán))進行目的片段的擴增。電泳檢測并回收目的DNA片段(Agarose Gel DNAFragment RecoveryKit Ver. 2. 0，購自大連寶生物工程有限公司，大連，中國)并命名為Mel A (SEQ ID N0. 10)。該片段包含植物乳桿菌的α -半乳糖苷酶基因，兩端分別含有 EcoR I (GAATTC)和Nsi I (ATGCAT)限制性內(nèi)切酶酶切位點。實施例2 重組食品級乳酸菌表達載體pMG36m的構(gòu)建將含有pMG36e質(zhì)粒的野生型乳酸乳球菌MG1363 (購自NIZO Co. Ltd.，Catalog ELS09000-01, Netherlands)在含紅霉素抗生素的EGM17固體培養(yǎng)平板(成分3. 725% M17肉湯，0.5%葡萄糖，1.5%瓊脂粉，終濃度為10yg/ml的紅霉素)上劃線培養(yǎng)。37°C 厭氧培養(yǎng)36小時后，從平板培養(yǎng)基上挑單菌落接種至含紅霉素抗生素的EGM17液體培養(yǎng)基(成分3.725%M17肉湯，0.5%葡萄糖，終濃度為10 μ g/ml的紅霉素)中，37°C厭氧靜置培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6。離心收集菌體并利用質(zhì)粒抽提試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0，購自大連寶生物工程有限公司，大連，中國)獲得質(zhì)粒pMG36e。 按照已有的方法建立標(biāo)準(zhǔn)的限制性內(nèi)切酶消化體系，然后利用EcoR 1(購自New England Biolabs, Inc. ，Catalog :R0101L, USA)禾口 Nsi I (購自 New England Biolabs, Inc.， Catalog :R0127L,USA)處理 pMG36e (具體操作參考 Sambrook et al. ,MolecularCloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, 1989)，回收分子量約2. 61Λ的大片段(SEQ ID NO. 16)。利用相同的限制性內(nèi)切酶處理并回收實施例1中得到的Mel A，然后與上述約2.61Λ的載體大片段相連，構(gòu)建出重組乳酸菌組成型表達質(zhì)粒pMG36m。將該重組質(zhì)粒利用電轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)化宿主菌NZ9000 (購自NIZO Co. Ltd.，Catalog :ELS09000, Netherlands)中，蜜二糖為碳源的培養(yǎng)平板(成分蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 4%氯化鈉，0. 15%乙酸鈉，1. 5%瓊脂粉和0. 5%蜜二糖)篩選重組子。 培養(yǎng)增殖后從轉(zhuǎn)化株中抽提重組質(zhì)粒pMG36m，按本領(lǐng)域工作人員熟知的方法測序確定片段插入的方向以及編碼的氨基酸都是正確的(參見Sambrook et al.，Molecular Cloning A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)。抽取測序正確的重組載體質(zhì)粒備用。實施例3 重組表達質(zhì)粒pMG36m_GSMT的構(gòu)建將編碼由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽和人IA型金屬硫蛋白組成融合蛋白的DNA片段送到廣州杰特偉生物科技有限公司(Guangzhou Jetway Biotech Co. Ltd. ,China)進行全基因合成。以此 DNA 片段為模板，GSMT-F(SEQ ID NO. 14) ^P GSMT-R(SEQ ID NO. 15)為上下游引物，再加入 dNTP (各 2. 5 μ mol · Γ1) 10 μ 1，IOx PCR Pfu緩沖液10 μ 1以及pfu Taq DNA聚合酶1 μ 1 (5U/ μ 1)，加水至總體積為100 μ 1，按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件(94°C變性^iin后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94°C變性30秒，58°C退火 30秒，72°C延伸180秒，共25個循環(huán))進行目的片段的擴增。電泳檢測并回收目的DNA片段并命名為GSMT (SEQ ID NO. 17)。該片段兩端分別含有&ic I (GAGCTC)和Sph I (GCATGC) 的限制性內(nèi)切酶酶切位點。建立標(biāo)準(zhǔn)的限制性內(nèi)切酶消化體系，然后利用Me 1(購自New England Biolabs，he.，Catalog :R0156L，USA)和 Sph I (購自 New England Biolabs,Inc., Catalog :R0182L, USA)處理GSMT?；厥掌魏螅c利用相同限制性內(nèi)切酶處理并回收的實施例2中得到的pMG36m相連，構(gòu)建重組食品級乳酸菌表達質(zhì)粒pMG36m_GSMT。實施例4 重組食品級乳酸菌的制備及融合蛋白的表達將乳酸乳球菌MG1363在GM17固體培養(yǎng)平板(成分3. 725% M17肉湯，0.5%葡萄糖，1.5%瓊脂粉)上劃線培養(yǎng)。37°C厭氧培養(yǎng)3 后，從平板培養(yǎng)基上挑單菌落接種至GSGM17B肉湯液體培養(yǎng)基(成分3. 725 % M17，0. 5 %葡萄糖，17 %蔗糖，2 %甘氨酸) 中，37°C厭氧靜置培養(yǎng)至OD6tltl = 0.3。4°C，6000rpm離心20分鐘，棄上清。然后用預(yù)冷的GSGM17B洗滌2次后置于冰上，制備成乳酸菌感受態(tài)細胞。取出5 μ g重組乳酸菌表達質(zhì)粒pMG36m-GSMT，加入到上述制備好的乳酸菌感受態(tài)細胞中。在電壓為2000V，脈沖時間為-S的條件下進行電轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)后，取100 200 μ 1菌液涂布于篩選培養(yǎng)平板(成分 2%蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 4%氯化鈉，0. 15%乙酸鈉，1. 5%瓊脂粉和0. 5%蜜二糖)上， 37°C、厭氧靜置培養(yǎng)1 2天。利用PCR技術(shù)鑒定陽性重組子。挑取陽性重組子接種到表達培養(yǎng)基(成分2%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.4%氯化鈉，0. 15%乙酸鈉和0.5%蜜二糖) 中，37°C、厭氧靜置培養(yǎng)1天。發(fā)酵結(jié)束后，12000rpm離心收集菌體，按1 10的比例(ν/ w)加入0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)重懸菌體。然后，利用超聲波破碎儀破碎細胞。18000rpm離心30分鐘，收集上清。SDS-PAGE以及flfestern-blot檢測和分析融合蛋白的表達(具體操作參見 Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY, 1989)。通過薄層凝膠掃描以及灰度分析結(jié)果表明，重組融合蛋白在乳酸菌中得到表達(融合蛋白結(jié)構(gòu)如圖2)，其分子量約為41kDa，表達量約為20mg/L。此外，融合蛋白可以與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抗體以及小鼠MT抗體產(chǎn)生陽性反應(yīng)(圖3)。實施例5 重組食品級乳酸菌以及含hMT-lA融合蛋白的金屬耐受能力在表達培養(yǎng)平板中(成分2%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.4%氯化鈉，0. 15%乙酸鈉，1. 5%瓊脂粉和0. 5%蜜二糖)添加不同濃度的0(12 200μΜ、300μΜ、400μΜ、500μΜ) 和Si2+(4. 0mM、4. 5mM、5. OmM,5. 5mM)，然后在平板上接種表達MT融合蛋白的重組乳酸菌，以含空載體的乳酸菌作為對照，37°C厭氧靜置培養(yǎng)1天。實驗結(jié)果表明，重組乳酸菌對Cd2+和 Zn2+的最高耐受濃度分別為400 μ M和5. OmM。收集菌體并利用原子吸收光譜法分析MT融合蛋白具有結(jié)合重金屬離子的能力，結(jié)果表明，其對Cd2+和Si2+的結(jié)合能力分別高于對照菌的4. 7倍和4. 3倍。實施例6 重組食品級乳酸菌制劑對預(yù)防大鼠亞慢性鎘中毒的應(yīng)用在5ml的表達培養(yǎng)基接種上述能表達重組融合蛋白的乳酸工程菌，然后，37°C、厭氧靜置培養(yǎng)2天。將所有的培養(yǎng)液全部接入到50ml新鮮表達培養(yǎng)基中，37°C、厭氧靜置培養(yǎng)1天。取200 μ 1菌液接種到固體培養(yǎng)基(成分2%蛋白胨、0. 5%酵母粉、0. 4%氯化鈉，0. 15%乙酸鈉，1. 5%瓊脂粉和0. 5%蜜二糖)中進行菌落計數(shù)，其余部分通過5°C， 12000rpm離心30分鐘后，收集菌體并利用常規(guī)的方法凍干，置于5°C保存[周華偉等， 2005，生命科學(xué)研究，9 ) :72.]。通過平板計數(shù)的方式得到原來菌液中乳酸菌的含量后，用生理鹽水稀釋凍干的乳酸菌，分別調(diào)整為IxlO6UxIO7以及IxlO8個細胞/ml的不同劑量。從廣東省實驗動物中心購買SPF級雄性Wistar大鼠(8周齡，體重130士 IOg)，適應(yīng)性喂飼7天后，每周一至周五上午通過灌胃方式服用氯化鎘溶液(配制0. 65mg/ml的工作溶液，服用劑量為5mg/kg/d，每天一次，每次Iml)，周末2天正常飼養(yǎng)，連續(xù)飼養(yǎng)8周。對于實驗組，在服用氯化鎘溶液同時，分別服用不同劑量的重組乳酸菌制劑(分別含重組乳酸菌低劑量IxlO6個細胞/ml/d,中劑量IxlO7個細胞/ml/d,高劑量IxlO8個細胞/ml/d, 每天1次，每次Iml)。以含空載體的乳酸工程菌溶液(IxlO8個細胞/ml/d，每天1次，每次 Iml)作為對照。實驗結(jié)束后，采集各組動物的肝臟、腎臟、腦、睪丸以及血液進行分析。結(jié)果顯示， 重組乳酸菌可以顯著降低鎘在體內(nèi)各臟器中的蓄積，且呈劑量依賴性。在肝臟組織中，模型組大鼠肝臟外觀顏色變暗，肝細胞呈現(xiàn)疏松腫脹，部分變性，有部分肝小梁擁擠，排列受破壞，肝竇受壓變窄，中央靜脈充血。乳酸菌中低劑量組可見肝細胞的病變有所改善，但仍有明顯的疏松腫脹及中央靜脈充血。乳酸菌高劑量組則顯著改善鎘對肝細胞的毒害作用，與空白對照組相比，肝損傷沒有明顯的差異(圖4)。實施例7 香蕉酸牛奶的制備工藝及食用方法首先制備復(fù)原乳溶液稱取IOg脫脂奶粉(市售)并置于IL三角瓶中，加入190mL 蒸餾水溶解后，95°C處理15min，然后冷卻至4°C保存。將本發(fā)明能高效表達重組融合蛋白的食品級乳酸工程菌單克隆接種到5ml復(fù)原乳溶液中，37°C厭氧培養(yǎng)Mhr后，按5% (ν/ν) 的比例加入到新鮮復(fù)原乳溶液中備用。其次制備香蕉果肉泥根據(jù)已有文獻資料[鄭亞琴，2010，食品科學(xué)，31 (M) 498]，將香蕉(市售)去皮稱重后，用微波(800瓦，普通市售家用微波爐即可)處理30 秒，然后按香蕉果肉的質(zhì)量加入0.5%的檸檬酸(w/w)和0. 25%的維生素((《/^)，室溫下 SOOOrpm勻漿攪拌2分鐘成香蕉果肉泥。取IOg香蕉果肉泥與90ml上述含重組乳酸工程菌的復(fù)原乳混合均質(zhì)，再加入6% 的蔗糖(w/v)、0. 明膠(w/v)和0. 的羧甲基纖維素鈉(w/v)攪拌混勻，95°C水浴條件下處理5分鐘后，接種到小燒杯中，覆蓋保鮮膜，37°C發(fā)酵8小時，然后置4°C保存。按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法檢測可知，這種酸奶每IOOml中含有活乳酸工程菌達到lxlO"1個以上，且能在4°C條件下穩(wěn)定儲存1周[陳廷續(xù)，2011，農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，208 :36]。食用方法餐后0.5-2小時內(nèi)服用100ml，每2-3天服用1次。應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進行具體地顯示和描述， 但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節(jié)的變化，可以進行各種實施方案的任意組合。等同實施方案本發(fā)明可以體現(xiàn)為其他具體的但不偏離其精神或基本特征的形式，因此認(rèn)為前述實施方案是在所有方面說明而不是限制本文所描述的發(fā)明。因此，本發(fā)明的范圍包括在權(quán)利說明書等同目的和范圍內(nèi)的所有修改和組合。
權(quán)利要求
1.一種表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌，其通過下述方法制備構(gòu)建一種以α-半乳糖苷酶為抗性篩選標(biāo)記的表達含人IA型金屬硫蛋白融合蛋白的重組表達載體，并轉(zhuǎn)化到乳酸菌宿主細胞中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組食品級乳酸菌，其中所述融合蛋白由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽和人IA型金屬硫蛋白組成，其氨基酸序列如SEQ ID No 5所示，所用的重組表達載體衍生于pMG36e。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組食品級乳酸菌，其中所述的乳酸菌宿主細胞選自乳球菌，例如，乳球菌MG1363、LM0230、MG1614，糞腸球菌，例如，糞腸球菌OGIX、FA2-2，或植物乳桿菌，優(yōu)選乳酸乳球菌MG1363。
4.一種制備表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌的方法，該方法包括以下步驟1)構(gòu)建以α-半乳糖苷酶為抗性篩選標(biāo)記的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組表達載體；2)將1)中構(gòu)建的重組表達載體轉(zhuǎn)化乳酸菌宿主細胞中，并且用含蜜二糖的乳酸菌培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化成功的重組乳酸菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其還包括下述步驟3)在適于以可溶形式表達融合蛋白的條件下培養(yǎng)步驟幻中被轉(zhuǎn)化的重組乳酸菌；4)在幻的重組乳酸菌內(nèi)表達出所述含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的乳酸菌宿主細胞選自乳球菌，例如乳球菌 MG1363、LM0230、MG1614，糞腸球菌，例如，糞腸球菌0GIX、FA2_2，或植物乳桿菌，優(yōu)選乳酸乳球菌 MG1363。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述融合蛋白由谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽和人IA型金屬硫蛋白組成，其氨基酸序列如SEQ ID No :5所示，所用的重組表達載體衍生于pMG36e。
8.權(quán)利要求1-3中任一項的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白重組的食品級乳酸菌在制備用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求8中所述的應(yīng)用，其中所述的重金屬是指鉛、鎘、汞或它們的任意組合。
10.一種用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的藥物、食品或化妝品，其包含有效量的權(quán)利要求 1-3中任一項所述的表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白的重組食品級乳酸菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含人IA型金屬硫蛋白融合蛋白的重組食品級乳酸菌，及其制備方法，特別是涉及利用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、小分子泛素相關(guān)修飾因子成熟肽和人IA型金屬硫蛋白進行融合表達的方法。本發(fā)明將編碼上述融合蛋白的基因克隆到乳酸菌組成型食品級表達載體pMG36m中，然后轉(zhuǎn)化至乳酸乳球菌MG1363，并利用蜜二糖作為碳源進行重組子篩選。重組乳酸工程菌在發(fā)酵過程中能持續(xù)表達含人IA型金屬硫蛋白的融合蛋白，且該蛋白具有結(jié)合生活環(huán)境中重金屬Pb、Cd以及Hg的能力。本發(fā)明還涉及所述重組食品級乳酸菌在制備用于預(yù)防人慢性重金屬中毒的藥物、食品或化妝品中的應(yīng)用。
文檔編號C12N1/21GK102296046SQ20111027536
公開日2011年12月28日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者馮婭, 張齊好, 肖巧學(xué), 蘇志堅, 項琪, 黃亞東 申請人:廣州市暨源生物科技有限公司, 暨南大學(xué)