專利名稱：固定化全細(xì)胞催化劑合成非天然氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于制藥工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種固定化全細(xì)胞催化劑合成非天然氨基酸的方法。
背景技術(shù)：
非天然氨基酸結(jié)構(gòu)和功能多樣，是很多藥物合成中常用的中間體，例如L-叔亮氨酸。α -酮酸(化合物式1)通過生物催化可生成非天然氨基酸(化合物2和化合物 3) ο
權(quán)利要求
1.固定化全細(xì)胞催化劑合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將固定化全細(xì)胞催化劑、α-酮酸鹽、甲酸銨及磷酸緩沖液混合，在PH6.0 9.0、 25 40°C條件下反應(yīng)5 20小時(shí)；反應(yīng)混合液中固定化全細(xì)胞催化劑濕重濃度為10 200g/L, α -酮酸鹽濃度為100 1000mmol/L,甲酸銨濃度為500 1500mmol/L ；所述的固定化全細(xì)胞催化劑中含有重組細(xì)胞，重組細(xì)胞中含有甲酸脫氫酶基因和亮氨酸脫氫酶基因；(2)回收固定化全細(xì)胞催化劑，反應(yīng)液降溫至5 15°C，ph調(diào)節(jié)至13 14;5 15°C 下，滴加氯甲酸甲酯，攪拌反應(yīng)8 16小時(shí)；ph調(diào)節(jié)至1.5 3，5 15°C下，萃取洗滌干O
2.權(quán)利要求1所述固定化全細(xì)胞催化劑合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，步驟 (1)中還加入NAD+，濃度為0. 05 0. 5g/L。
3.權(quán)利要求1所述固定化全細(xì)胞催化劑合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，所述固定化全細(xì)胞催化劑的制備方法為(1)將含有亮氨酸脫氫酶基因和甲酸脫氫酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主菌，得到重組細(xì)胞；(2)將重組細(xì)胞與固定劑溶液混合，鋪于平面上，25 35°C下保溫1 1.5小時(shí)，并用鹽溶液穩(wěn)定后洗滌；固定劑為聚乙二醇與聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸鈣中至少一種的混合物；聚乙二醇的濃度為0. 08 0. lg/ml ；聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或海藻酸鈣濃度為0. 1 0.2g/ml。
4.權(quán)利要求1所述固定化全細(xì)胞催化劑合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，所述 α-酮酸鹽結(jié)構(gòu)如式1所示，R為脂肪側(cè)鏈、苯基或芐基。
5.權(quán)利要求1或4所述合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，步驟(1)中的α-酮酸鹽為三甲基丙酮酸鈉鹽。
6.權(quán)利要求1所述固定化全細(xì)胞催化劑合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，所述亮氨酸脫氫酶基因序列和甲酸脫氫酶基因序列分別如SEQ ID No. 1及SEQ ID No. 2所示。
7.權(quán)利要求1或6所述固定化全細(xì)胞催化劑合成非天然氨基酸的方法，其特征在于，所述亮氨酸脫氫酶基因選自球形芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌；甲酸脫氫酶基因選自路德酵母或博伊丁假絲酵母。
全文摘要
本發(fā)明涉及制藥和生物技術(shù)領(lǐng)域，利用包含亮氨酸脫氫酶及能使輔因子再生的甲酸脫氫酶的全細(xì)胞催化劑還原α-酮酸制備非天然氨基酸；尤其是以三甲基丙酮酸為底物酶法合成L-叔亮氨酸，將亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶克隆到重組大腸桿菌中共表達(dá)，并將細(xì)胞固定化；利用固定化全細(xì)胞催化，不用加入“外來”輔因子而對(duì)底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。且固定化全細(xì)胞催化具有成本低，操作方便的優(yōu)點(diǎn)，本方法屬于生物合成法，反應(yīng)條件溫和，作用專一，無副產(chǎn)物，在醫(yī)藥及食品等行業(yè)中均有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12P13/04GK102352387SQ201110277030
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者孫勇, 張淑蓉, 文軍, 曾聰明, 梁曉亮, 王波, 王玉全 申請(qǐng)人:尚科生物醫(yī)藥(上海)有限公司