專利名稱：：一種培育抗病小麥的方法及其專用重組質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種培育抗病小麥的方法及其專用重組質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，由于小麥生產(chǎn)水平不斷提高，耕作制度的改變，以及全球氣候變暖等因素的影響，小麥全蝕病、紋枯病等土傳真菌病，已成為我國(guó)及世界小麥的重要病害，對(duì)小麥生產(chǎn)的危害日益嚴(yán)重，直接影響著小麥的最終產(chǎn)量。因此，防治小麥上述病害對(duì)于保證小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)非常重要。然而，由于小麥全蝕病、紋枯病抗性缺乏理想的小麥抗病種質(zhì)資源，均由多基因控制，常規(guī)育種方法在選育抗病品種方面的研究進(jìn)展緩慢。基因工程為植物抗病育種開辟了一條新途徑。小麥全蝕病又稱黑腳病，是小麥的毀滅性病害，其主要發(fā)生在根部、莖基部，引起植株成簇或大片枯死，降低有效穗數(shù)、穗粒數(shù)及千粒重，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。該病的病原菌為禾頂囊殼禾谷變種Gaeumannomycesgraminisvar.graminis(Sacc.)Walker禾口禾丁頁(yè)囊殼小麥變禾中Gaeumannomycesgraminis(Sacc.)ArxetOlivervar.tritici(Sacc.)Walker，其寄主范圍較廣，能侵染10多種栽培或野生的禾本科植物，如小麥、大麥、黑麥、燕麥、水稻等。小麥紋枯病又稱小麥尖眼斑病(wheatsharpeyespot)，是由禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等引起的土傳真菌病害，我國(guó)小麥紋枯病主要由禾谷絲核菌引起。70年代以來(lái)小麥紋枯病逐漸加重，到80年代已成為長(zhǎng)江流域麥區(qū)的重大病害，后蔓延到黃淮麥區(qū)，目前已成為我國(guó)江蘇、四川、安徽、河南、山東、河北、陜西、北京等麥區(qū)的主要病害。20052010年，我國(guó)每年遭受小麥紋枯病危害的麥田面積大約在670800萬(wàn)hm2，經(jīng)濟(jì)損失在10億元以上。紋枯病一般可使小麥減產(chǎn)10%-30%，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)50%以上。不僅如此，受害小麥的品質(zhì)和商品價(jià)值也有很大損失。目前，生產(chǎn)上大面積推廣品種和育種材料對(duì)全蝕病、紋枯病的抗性普遍較差，迫切需要抗病小麥新種質(zhì)和新品種。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種培育抗病小麥的方法及其專用重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供的融合蛋白，包括TiERFl蛋白和RC7蛋白；所述TiERFl蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述RC7蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。所述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蛋白的編碼基因包括TiERFl蛋白的編碼基因和RC7蛋白的編碼基因；所述TiERFl蛋白的編碼基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子；所述RC7蛋白的編碼基因是如下4)至6)中任一所述的DNA分子4)序列表中序列5所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子；6)與4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在0.IXSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述蛋白的編碼基因可依次包括RSSlP啟動(dòng)子、所述TiERFl蛋白的編碼基因和所述RC7蛋白的編碼基因；所述RSSlP啟動(dòng)子啟動(dòng)所述TiERFl蛋白的編碼基因的表達(dá)。所述蛋白的編碼基因可依次包括RSSlP啟動(dòng)子、所述TiERFl蛋白的編碼基因⑶bi啟動(dòng)子和所述RC7蛋白的編碼基因；所述RSSlP啟動(dòng)子啟動(dòng)所述TiERFl蛋白的編碼基因的表達(dá)。所述W^i啟動(dòng)子啟動(dòng)所述RC7蛋白的編碼基因的表達(dá)。含有所述融合蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體按照如下方法制備用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切重組質(zhì)粒PA25-RC7，回收小片段并插入重組質(zhì)粒pA20-TiERFl的多克隆位點(diǎn)，得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pA20-TiERFl按照如下方法制備將pAHC20質(zhì)粒SphI和BamHI酶切位點(diǎn)之間的小片段替換為序列表的序列1所示的RSSlP啟動(dòng)子、BamHI和McI酶切位點(diǎn)之間的小片段替換為序列表的序列2所示的TiERFl基因，得到重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pA25-RC7按照如下方法制備將pAHC25質(zhì)粒SmaI和McI酶切位點(diǎn)之間的小片段替換為序列表的序列5所示的RC7基因，得到重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可通過如下方法制備(1)用限制性內(nèi)切酶kpl酶切所述重組質(zhì)粒pA20_TiERFl回收約5.3kb的線性載體DNA片段；(2)用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切所述重組質(zhì)粒pA25_RC7，回收約3.3kb的DNA片段(UBI-RC7-TN0S表達(dá)盒)。(3)將步驟O)回收的DNA片段用T4DNApolymerase進(jìn)行末端平滑化處理；(4)將步驟(1)的DNA片段和步驟(3)的DNA片段進(jìn)行連接，得到所述重組表達(dá)載體(pA20-TiERFl-RC7質(zhì)粒)。本發(fā)明還保護(hù)一種培育抗病植物的方法，是將所述融合蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到抗病性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述融合蛋白的編碼基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物優(yōu)選為小麥(如揚(yáng)麥18或揚(yáng)麥19)。所述抗病可為抗紋枯病和/或抗全蝕病。所述紋枯病菌的致病菌具體可為禾谷絲核菌(Miizoctoniacerealis)R03010所述全燭病的致病菌具體可為Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt)。所述蛋白、所述基因或所述重組表達(dá)載體均可用于培育抗病植物。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物優(yōu)選為小麥(如揚(yáng)麥18或揚(yáng)麥19)。所述抗病可為抗紋枯病和/或抗全蝕病。所述紋枯病菌的致病菌具體可為禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301。所述全燭病的致病菌具體可為Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt)。本發(fā)明成功構(gòu)建了中間偃麥草轉(zhuǎn)錄因子基因(TiERFl基因)和水稻幾丁質(zhì)酶基因(RC7基因)的單子葉植物雙價(jià)表達(dá)載體pA20-TiERFl-RC7，其中TiERFl基因受韌皮部組織特異表達(dá)的水稻蔗糖合酶基因(ricesucrosesynthase,RSS1P)啟動(dòng)子的控制，RC7基因受組成型表達(dá)的玉米泛素基因(maizeubiquitin(Ubi))啟動(dòng)子的控制，將該該載體轉(zhuǎn)化到小麥中，可以顯著提高轉(zhuǎn)基因小麥的綜合抗病性。圖1為重組質(zhì)粒pA20_TiERFl的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為重組質(zhì)粒pA25-RC7的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為重組質(zhì)粒pA20_TiERFl的酶切鑒定(SspI)電泳圖。圖4為重組質(zhì)粒pA25-RC7的酶切鑒定(HindIII)電泳圖。圖5為pA20-TiERFl_RC7質(zhì)粒的酶切鑒定(SacI)電泳圖。圖6為pA20-TiERFl_RC7質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖。圖7為揚(yáng)麥19獲得的再生植株中部分植株TiERFl基因的PCR鑒定結(jié)果。圖8為揚(yáng)麥18獲得的再生植株中部分植株RC7基因的PCR鑒定結(jié)果。圖9為轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲和揚(yáng)麥19的照片(紋枯病抗性鑒定)。圖10為轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙和揚(yáng)麥18的照片(全蝕病抗性鑒定)。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。限制性內(nèi)切SlHindIII,SmaI,SacI,SspI,BamHI禾口TaqDNApolymerase,T4DNApolymerase購(gòu)自大連寶生物公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物技術(shù)公司。Ampicillin(Amp.)購(gòu)自北京拜爾迪公司。其它生化試劑為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口分析純、生化純。水稻品種“日本晴”購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。PMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。揚(yáng)麥18購(gòu)自江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。揚(yáng)麥19購(gòu)自江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。實(shí)施例中采用的小麥紋枯病菌致病菌為禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)R0301，購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。實(shí)施例中采用的小麥全蝕病致病菌為Gaeumannomycesgraminisvar.tritici(Ggt),購(gòu)自西北農(nóng)林科技大學(xué)。實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。pAHC20質(zhì)粒(5706bp)由pUC8改造而成，含有1個(gè)表達(dá)盒，具有玉米Ubiquitin啟動(dòng)子、ExonJntron、Bar、Nos終止子；pAHC20質(zhì)粒的參考文獻(xiàn)ChristensenandQuail,1996；Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,5,213-218；由作者之一贈(zèng)送，公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。pAHC25質(zhì)粒(9706bp)由pUC8改造而成，含有2個(gè)表達(dá)盒，第1個(gè)表達(dá)盒具有玉米W^iquitin啟動(dòng)子、ExonUntron、GUS、Nos終止子，6US兩端具有SmaI和SacI酶切位點(diǎn)，第2個(gè)表達(dá)盒具有玉米W^iquitin啟動(dòng)子、ExonJntron、Bar、Nos終止子；pAHC25質(zhì)粒的參考文獻(xiàn)ChristensenandQuail,1996；Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch，5，213-218；由作者之一贈(zèng)送，公眾可以從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。實(shí)施例1、雙價(jià)植物表達(dá)載體的構(gòu)建一、重組表達(dá)載體pA20_TiERFl的構(gòu)建1、提取水稻品種“日本晴”幼葉的基因組DNA。2、以步驟1提取的基因組DNA為模板，用RSS1P-F2/RSS1P-R2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。RSS1P-F25'-AGA|GCATGC|CTCCTTCATTTTCAGTGCAAATG-3‘(框中為SphI識(shí)別序列)；RSS1P-R25‘-ATA|GGATCC|CCAATGGTGGTCAGAGAC-3‘(框中為BamHI識(shí)別序列)。3、用限制性內(nèi)切酶SphI和BamHI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物(約1720bp)。4、用限制性內(nèi)切酶SphI和BamI雙酶切pAHC20質(zhì)粒，除去ubiquitin啟動(dòng)子，回收骨架載體(約3700bp)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的骨架載體用T4連接酶進(jìn)行連接(3摩爾酶切產(chǎn)物1摩爾骨架載體)，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pA20-RSSlP:bar，其骨架載體為pAHC20，將SphI和BamHI酶切位點(diǎn)之間的Ubi啟動(dòng)子替換為了序列表的序列1所示的RSSlP啟動(dòng)子。6、合成TiERFl基因(TIERF1基因的核苷酸序列如序列表的序列2所示的，編碼序列表的序列3表示的TiERFl蛋白)。7、以步驟6合成的TiERFl基因?yàn)槟０?，用TiERFl-F/TiERFl-R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。TiERFl-F5‘-TTC|GGATCC[ATGCTGCTGAACCCGGCC-3‘(框中為BamHI識(shí)別序列)；TiERFl-R5'-TCTIgAGCTCICTAGCTGACCAGCTGCTG-3‘(框中為SacI識(shí)別序列)。8、用限制性內(nèi)切酶BamHI和I雙酶切步驟7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物(約89Ibp)。9、用限制性內(nèi)切酶BamHI和MeI雙酶切重組質(zhì)粒pA20_RSSlP::bar，回收去除bar的載體骨架(約4880bp)。10、將步驟8的酶切產(chǎn)物和步驟9的載體骨架連接(3摩爾酶切產(chǎn)物1摩爾骨架載體)，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pA20-TiERFl(約5770bp)，其骨架載體為pAHC20質(zhì)粒，將SphI和BamHI酶切位點(diǎn)之間的小片段替換為了序列表的序列1所示的RSSlP啟動(dòng)子，將BamHI和I酶切位點(diǎn)之間的小片段替換為了序列表的序列2所示的TiERFl基因(編碼序列表的序列3所示的TiERFl蛋白)；RSSlP啟動(dòng)子控制TiERFl基因表達(dá)。重組質(zhì)粒pA20_TiERFl的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。二、重組表達(dá)載體pA25-RC7的構(gòu)建1、提取水稻品種“日本晴”幼葉的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2、以步驟1的cDNA為模板，用RC7-F1和RC7-R1組成的引物對(duì)進(jìn)行高保真PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。RC7-F1:5，-TAAGCATGTCGACGCCGA-3，；RC7-R1:5，-ACTGCTCCGCCAACCCAA-3，。PCR擴(kuò)增程序94°C5min,1個(gè)循環(huán)；94°Clmin、64°C35s,72°C90s，8個(gè)循環(huán)；94°Clmin、62°C35s、72°C90s,28個(gè)循環(huán)；72°C延伸9min。3、以步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用RC7-SmaF和RC7_&iCR組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。RC7-SmaF5‘-AA|CCCGGG|ATGTCGACGCCGAGAGCG-3‘(方框標(biāo)注SmaI識(shí)別序列)；RC7-SacR:5‘_TA|GAGCTC|TCACTGCTCCGCCAACCCA-3，(方框標(biāo)注SacI識(shí)別序列)。4、將步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18_T載體連接，得到重組質(zhì)粒pTRC7。5、用限制性內(nèi)切酶SmaI和&icl雙酶切重組質(zhì)粒pTRC7，回收約IOOObp的DNA片段。6、用限制性內(nèi)切酶SmaI和McI雙酶切pAHC25質(zhì)粒，回收去除⑶S基因的載體骨架(約782Obp)。7、將步驟5的DNA片段和步驟6的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒PA25-RC7，其骨架載體為PAHC25質(zhì)粒，將SmaI和Mcl酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列5所示的RC7基因(編碼序列表的序列4所示的RC7蛋白)。重組質(zhì)粒pA25-RC7的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。三、雙價(jià)植物表達(dá)載體的構(gòu)建1、用限制性內(nèi)切酶kpl(平末端)酶切重組質(zhì)粒pA20_TiERFl(37°C、5h)，酶切產(chǎn)物的電泳圖見圖3(酶切產(chǎn)物為約5.3kb的DNA片段)，回收約5.3kb的線性載體DNA片段。2、用限制性內(nèi)切酶Hindi11酶切重組質(zhì)粒pA25_RC7(37V、2h)，酶切產(chǎn)物的電泳圖見圖4(酶切產(chǎn)物為約5.5kb的DNA片段和約3.3kb的DNA片段)，回收約3.3kb的DNA片段(UBI-RC7-TN0S表達(dá)盒)。3、將步驟2回收的DNA片段用T4DNApolymerase進(jìn)行末端平滑化處理。4、將步驟1的DNA片段和步驟3的DNA片段進(jìn)行連接(16°C、20小時(shí))，得到雙價(jià)植物表達(dá)載體(pA20-TiERFl-RC7質(zhì)粒)。5、將pA20-TiERFl_RC7質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶&icl進(jìn)行酶切(30°C酶切池)，然后進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，見圖5。顯示5.9kb和2.7kb兩個(gè)DNA片段。6、將pA20-TiERFl_RC7質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI進(jìn)行酶切(30°C酶切濁)，然后進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳。顯示4.58kb和4.02kb兩個(gè)DNA片段。7、將pA20-TiERFl-RC7質(zhì)粒用RC7-ZU和RC7-ZL組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，顯示約724bp條帶的為陽(yáng)性，pA20-TiERFl-RC7質(zhì)粒的鑒定結(jié)果為陽(yáng)性。RC7-ZU:5，-CCTCCTCCACCGCAACGA-3，；RC7-ZL:5，-CTGCTCCGCCAACCCAAC-3，。RC7反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C30s,60°C30s，72°C60s，循環(huán)30次，72°C后延伸5min。8、將pA20-TiERFl-RC7質(zhì)粒用Ε379和Ε702組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)結(jié)束后擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，顯示約344bp的條帶的為陽(yáng)性，pA20-TiERFl-RC7質(zhì)粒的鑒定結(jié)果為陽(yáng)性。ΤΕ379:5，-GAGGCCACGGCGTTCATG-3，；ΤΕ702:5，-GACCCGGACGAGGAGGAG-3，。RC7反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5min，94°C30s,60°C30s，72°C30s，循環(huán)30次，72°C后延伸5min。9、根據(jù)測(cè)序結(jié)果，pA20-TiERFl-RC7質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖見圖6。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植株的獲得及其抗病性分析一、再生植株的獲得將揚(yáng)麥18或揚(yáng)麥19分別作為出發(fā)植物，進(jìn)行如下步驟1、將2000塊幼胚愈傷組織作為基因槍轟擊的受體，用PDS-1000/He基因槍(Bio-Red公司生產(chǎn))將pA20-TiERFl-RC7質(zhì)粒轟擊到愈傷組織(IlOOPsi的可裂膜，載樣距靶材料6cm進(jìn)行轟擊)。2、將愈傷組織在滲透壓培養(yǎng)基(SD2培養(yǎng)基+0.2mol/L甘露醇+0.2mol/L山梨醇)上培育16hQ6°C，暗培養(yǎng))。3、將愈傷組織轉(zhuǎn)移到SD2培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+lmg/LVB^lSOmg/L天冬門酰胺+2mg/L2，4-D)上，恢復(fù)培養(yǎng)2周(26°C，暗培養(yǎng))。4、將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化篩選培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+lmg/La_萘乙酸+lmg/L激動(dòng)素+3mg/L雙丙胺膦)中，24j6°C光照培養(yǎng)(每天光照10小時(shí))3-4周；待到愈傷組織分化出綠芽以后，轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)篩選培養(yǎng)基中(1/2MS培養(yǎng)基+3mg/L雙丙胺膦)，M-26°C光照培養(yǎng)(每天光照10小時(shí))。5、步驟4的小苗伸長(zhǎng)到l-2cm時(shí)，轉(zhuǎn)移到壯苗培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+0.5mg/La-萘乙酸)上，將苗高6-8cm的植株(再生植株)移栽到花盆，15°C左右光照培養(yǎng)(每天光照10小時(shí))。揚(yáng)麥18獲得了269株再生植株。揚(yáng)麥19獲得了101株再生植株。二、轉(zhuǎn)基因植株的獲得將步驟一得到的再生植株提取基因組DNA進(jìn)行TiERFl基因的PCR鑒定和RC7基9因的PCR鑒定。TiERFl基因的PCR鑒定相關(guān)參數(shù)所用的引物RSS1P-1038U20(針對(duì)RSSlP啟動(dòng)子):5，-CATCCCCAACCAGTCCTTTT-3，；TIET-2088L(針對(duì)TiERFl基因):5，-CTCGGTAGTGCTTCCCCCT-3；目標(biāo)片段約為1050bp；PCR擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性:3min；94°C45s,60°C50s,72°C75s，共5個(gè)循環(huán)；940C45s,58°C50s,72°C75s，共10個(gè)循環(huán)；94°C45s,56°C50s,72°C75s，共20個(gè)循環(huán)；最后72°C后延伸IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。RC7基因的PCR鑒定相關(guān)參數(shù)RC7-953U20(針對(duì)RC7基因)5，-GGCAACCTCGACTGCTACAA-3，；TN0S-L23(針對(duì)NOS終止子)5，-ATGTATAATTGCGGGACTCTAAT-3，；目標(biāo)片段約為^Obp。PCR擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性3min；94°C45s,58.7°C50s,72°C45s，共10個(gè)循環(huán)；94°C45s，56.5°C50s,72V45s，共25個(gè)循環(huán)；最后72°C后延伸IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。揚(yáng)麥19獲得的再生植株中部分植株TiERFl基因的PCR鑒定結(jié)果見圖7。M為IOObpDNAladder；CK為水；P為pA20_TiERFl_RC7質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照)；WT為揚(yáng)麥19；1、2、4、6、7、8、9為鑒定陽(yáng)性的植株。揚(yáng)麥19獲得的再生植株中RC7基因的PCR鑒定結(jié)果與TiERFl基因的鑒定結(jié)果一致，即所有TiERFl基因PCR鑒定為陽(yáng)性的植株，RC7基因PCR鑒定也為陽(yáng)性。101株再生植株中，PCR鑒定(兩個(gè)基因均為陽(yáng)性)為陽(yáng)性的植株35株，即為TO代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率約為1.75%。將TO代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲進(jìn)行自交，獲得的種子及其長(zhǎng)成的植株為Tl代植株，獲得Tl代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲。將Tl代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲進(jìn)行自交，獲得的種子及其長(zhǎng)成的植株為T2代植株，獲得T2代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲。揚(yáng)麥18獲得的再生植株中部分植株RC7基因的PCR鑒定結(jié)果見圖8。P為pA20-TiERFl-RC7質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照)；WT為揚(yáng)麥19;1至9為鑒定陽(yáng)性的植株。揚(yáng)麥18獲得再生植株TiERFl基因的PCR鑒定結(jié)果與RC7基因的鑒定結(jié)果一致，即所有RC7基因PCR鑒定為陽(yáng)性的植株，TiERFl基因PCR鑒定也為陽(yáng)性。269株再生植株中，PCR鑒定(兩個(gè)基因均為陽(yáng)性)為陽(yáng)性的植株27株，即為TO代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙，轉(zhuǎn)化率為1.35%。將TO代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙進(jìn)行自交，獲得的種子及其長(zhǎng)成的植株為Tl代植株，獲得Tl代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙。將Tl代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙進(jìn)行自交，獲得的種子及其長(zhǎng)成的植株為T2代植株，獲得T2代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙。三、對(duì)照植株的獲得用重組質(zhì)粒pA20-TiERFl代替pA20_TiERFl-RC7質(zhì)粒，依次進(jìn)行步驟一和步驟二的操作。以揚(yáng)麥19為出發(fā)植株得到TO代轉(zhuǎn)pA20-TiERFl對(duì)照植株甲、Tl代轉(zhuǎn)pA20_TiERFl對(duì)照植株甲和T2代轉(zhuǎn)pA20-TiERFl對(duì)照植株甲。以揚(yáng)麥18為出發(fā)植株得到TO代轉(zhuǎn)pA20-TiERFl對(duì)照植株乙、Tl代轉(zhuǎn)pA20_TiERFl對(duì)照植株乙和T2代轉(zhuǎn)pA20_TiERFl對(duì)照植株乙。用重組質(zhì)粒pA25-RC7質(zhì)粒代替pA20_TiERFl-RC7質(zhì)粒，依次進(jìn)行步驟一和步驟二的操作。以揚(yáng)麥19為出發(fā)植株得到TO代轉(zhuǎn)pA25-RC7對(duì)照植株甲、Tl代轉(zhuǎn)pA25_RC7對(duì)照植株甲和T2代轉(zhuǎn)pA25-RC7對(duì)照植株甲。以揚(yáng)麥18為出發(fā)植株得到TO代轉(zhuǎn)pA25_RC7對(duì)照植株乙、Tl代轉(zhuǎn)pA25-RC7對(duì)照植株乙和T2代轉(zhuǎn)pA25_RC7對(duì)照植株乙。四、轉(zhuǎn)基因植株甲及其對(duì)照植株的紋枯病菌抗性鑒定1、在網(wǎng)室田間種植Tl代轉(zhuǎn)RCi-TiERF1基因植株甲(6行，前5行每行20株，第6行9株)、T1代轉(zhuǎn)pA20-TiERFl對(duì)照植株甲(1行，20株)、T1代轉(zhuǎn)pA25_RC7對(duì)照植株甲(1行，20株)和揚(yáng)麥19(2行，每行20株)。2、8周后(拔節(jié)期)，采用蔡士賓等的牙簽培養(yǎng)法(蔡士賓，任麗娟，顏偉，吳紀(jì)中，陳懷谷，吳小有，張仙義·2006,Germplasmdevelopmentandmappingofresistancetosharpeyespot(Rhizoctoniacerealis)inwheat.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),39(5):汜8_934)接種禾谷絲核菌R0301的菌絲到小麥葉鞘部，澆水保濕5-7天，隔一周噴2-3次水。3、在收獲時(shí)拍照并考察葉鞘和莖稈的發(fā)病情況。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照李斯深等方法進(jìn)行(李斯深，李安飛，李憲彬等.1997，小麥種質(zhì)對(duì)紋枯病抗性鑒定初報(bào).作物品種資源.⑷31-33)=IT0:無(wú)病；1級(jí)第1、2葉鞘發(fā)病，但莖稈無(wú)??；2級(jí)第1、2葉鞘發(fā)病，但病斑繞莖稈小于1/3；3級(jí)第3、4葉鞘發(fā)病，或病斑繞莖稈1/3-2/3；4級(jí)第5、6葉鞘發(fā)病，或病斑繞莖稈2/3-1周；5級(jí)出現(xiàn)枯、白穗或整株枯死。轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲中，68株(62%)ΙΤ彡1，109株植株的平均IT為1.1，轉(zhuǎn)pA20-TiERFl對(duì)照植株甲的平均IT為1.5，轉(zhuǎn)pA25_RC7對(duì)照植株甲的平均IT為1.6，揚(yáng)麥19的平均IT為2.70。對(duì)紋枯病抗病性鑒定結(jié)果表明，大多數(shù)轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲對(duì)紋枯病抗性強(qiáng)于轉(zhuǎn)pA20-TiERFl對(duì)照植株甲、轉(zhuǎn)pA25_RC7對(duì)照植株甲以及揚(yáng)麥19(受體小麥)。轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲和揚(yáng)麥19的照片見圖9(1和2為轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株甲，3為揚(yáng)麥19)。五、轉(zhuǎn)基因植株乙及其對(duì)照植株的紋枯病菌抗性鑒定1、在網(wǎng)室田間種植Tl代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙(6行，前5行每行20株，第6行9株)、T1代轉(zhuǎn)pA20-TiERFl對(duì)照植株乙(1行，20株)、T1代轉(zhuǎn)pA25_RC7對(duì)照植株乙(1行，20株)和揚(yáng)麥18(2行，每行20株)。步驟2和步驟3同步驟四的步驟2和步驟3。轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙中，58株(65%)IT彡1，109株植株的平均IT為1.05，轉(zhuǎn)pA20-TiERFl對(duì)照植株乙的平均IT為1.4，轉(zhuǎn)pA25_RC7對(duì)照植株乙的平均IT為1.5，揚(yáng)麥18的平均IT為2.58。對(duì)紋枯病抗病性鑒定結(jié)果表明，大多數(shù)轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙對(duì)紋枯病抗性強(qiáng)于轉(zhuǎn)pA20-TiERFl對(duì)照植株乙、轉(zhuǎn)PA25-RC7對(duì)照植株乙以及揚(yáng)麥18(受體小麥)。六、轉(zhuǎn)基因植株乙及其對(duì)照植株的全蝕病抗性鑒定將T2代轉(zhuǎn)RCT-TiERF1基因植株乙種子(15粒)、T2代轉(zhuǎn)pA20_TiERFl對(duì)照植株乙種子(15粒)、T2代轉(zhuǎn)pA25-RC7對(duì)照植株乙種子(15粒)和揚(yáng)麥18(15粒)消毒、催芽后，移至已放入小麥全蝕病致病菌菌餅的花盆中(每粒種子一個(gè)花盆)，人工氣候箱培養(yǎng)3個(gè)星期，然后對(duì)如下指標(biāo)進(jìn)行鑒定黑莖比(BS%)、黑根比(B1R%)、黃葉比(YLR%)0根據(jù)以上數(shù)據(jù)，將植株的整體抗病性劃分為高抗(1級(jí))、中感0級(jí))、高感(3級(jí))三個(gè)等級(jí)。結(jié)果見表1。表1各個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果權(quán)利要求1.一種融合蛋白，包括TiERFl蛋白和RC7蛋白；所述TiERFl蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列3的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述RC7蛋白是如下(c)或(d)(c)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(d)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述融合蛋白的編碼基因。3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因包括TiERFl蛋白的編碼基因和RC7蛋白的編碼基因；所述TiERFl蛋白的編碼基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子；所述RC7蛋白的編碼基因是如下4)至6)中任一所述的DNA分子4)序列表中序列5所示的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與4)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子；6)與4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗病相關(guān)蛋白的DNA分子。4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因依次包括RSSlP啟動(dòng)子、所述TiERFl蛋白的編碼基因和所述RC7蛋白的編碼基因；所述RSSlP啟動(dòng)子如序列表的序列1所示；所述RSSlP啟動(dòng)子啟動(dòng)所述TiERFl蛋白的編碼基因的表達(dá)。5.含有權(quán)利要求2或3或4所述融合蛋白的編碼基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6.如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體按照如下方法制備用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切重組質(zhì)粒pA25-RC7，回收小片段并插入重組質(zhì)粒pA20-TiERFl的多克隆位點(diǎn)，得到的重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒pA20-TiERFl按照如下方法制備將pAHC20質(zhì)粒SphI和BamHI酶切位點(diǎn)之間的小片段替換為序列表的序列1所示的RSSlP啟動(dòng)子、BamHI和McI酶切位點(diǎn)之間的小片段替換為序列表的序列2所示的TiERFl基因，得到重組質(zhì)粒；所述重組質(zhì)粒PA25-RC7按照如下方法制備將pAHC25質(zhì)粒SmaI和McI酶切位點(diǎn)之間的小片段替換為序列表的序列5所示的RC7基因，得到重組質(zhì)粒。7.一種培育抗病植物的方法，是將權(quán)利要求2或3或4所述融合蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到抗病性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述融合蛋白的編碼基因通過權(quán)利要求5或6所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物優(yōu)選為小麥；所述抗病為抗紋枯病和/或抗全蝕病。10.權(quán)利要求1所述蛋白，或權(quán)利要求2或3或4所述基因，或權(quán)利要求5或6所述重組表達(dá)載體在培育抗病植物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種培育抗病小麥的方法及其專用重組質(zhì)粒。本發(fā)明提供了一種融合蛋白、含有所述融合蛋白的編碼基因的重組質(zhì)粒，及所述重組質(zhì)粒在培育抗病植物中的應(yīng)用。所述融合蛋白包括TiERF1蛋白和RC7蛋白；所述TiERF1蛋白是由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。所述RC7蛋白是由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。將含有所述融合蛋白的編碼基因的載體轉(zhuǎn)化到小麥中，可以顯著提高轉(zhuǎn)基因小麥的綜合抗病性。文檔編號(hào)C12N5/10GK102367278SQ20111031855公開日2012年3月7日申請(qǐng)日期2011年10月19日優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日發(fā)明者劉欣,莊洪濤,張?jiān)銎G,徐惠君,李釗,杜麗璞,王愛云,祝秀亮,馬翎健申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所