專利名稱：一種治療腫瘤的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)，具體涉及一種用于治療腫瘤的蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類健康的最主要原因之一。腫瘤的發(fā)病率和死亡率均是每年在世界范圍造成死亡人數(shù)較高的疾病，至今尚沒有特效的治療方法。目前有多種治療腫瘤的方法， 而手術(shù)、放療和化療是最常用的方法。然而，手術(shù)后的腫瘤常常復(fù)發(fā)；而放療和化療不僅殺傷腫瘤細(xì)胞，也同時(shí)殺傷機(jī)體的正常細(xì)胞，副作用甚大。尋找低性和高療效的抗癌藥物一直是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。固體腫瘤的發(fā)展需要血管而為腫瘤提供營養(yǎng)。如果抑制腫瘤的血管新生，那么將能餓死腫瘤。血管生成抑制因子是一類抑制血管生成的蛋白質(zhì)，血管生成抑制因子抗癌的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，血管生成抑制因子對人體無毒性或毒性輕微。研究血管生成抑制因子抗癌是當(dāng)前抗癌研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療腫瘤的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)具有抑制血管新生的功能，具有血管生成抑制因子的特性。是通過DNA序列合成方法合成一段DNA序列，將這段DNA 序列重組于畢赤酵母中表達(dá)，并將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，表達(dá)產(chǎn)物活性分析證明，所合成基因編碼的蛋白具有抑制血管新生和抑制腫瘤發(fā)展的生物學(xué)活性。其核苷酸序列和它的氨基酸序列如序列表中所述。本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)1.DNA序列的合成設(shè)計(jì)如下DNA序列，并用套疊PCR方法進(jìn)行其序列合成。將其序列命名為scl。ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTT CATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACA CCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCATCATCATCATCATCATTAG2. DNA序列編碼蛋白功能的證明(1) DNA序列重組于酵母中表達(dá)通過DNA內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K的多克隆位點(diǎn)，將其表達(dá)載體命名為pPIC9K-scl (附圖1)。用電轉(zhuǎn)法將pPIC9K-scl轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，獲得工程菌GSl 15 (pPIC9K_scl)。用BMGY-BMMY發(fā)酵 GS115(pPICP9K-scl)誘導(dǎo)表達(dá) Scl 蛋白。(2)表達(dá)產(chǎn)物活性分析發(fā)酵液上清過Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化柱進(jìn)行純化(附圖幻，收獲的含目標(biāo)蛋白的液體經(jīng)過抽濾除鹽后，進(jìn)行抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成試驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)小鼠黑色素瘤模型試驗(yàn)。結(jié)果是Scl蛋白抑制雞胚絨毛尿囊新生血管生成，其對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用強(qiáng)于Angiostatin (附圖3)，顯著地抑制實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤在機(jī)體內(nèi)的發(fā)展(附圖4)，具有治療腫瘤的作用。利用上述蛋白質(zhì)制備藥物，可用于治療腫瘤，是一種治療腫瘤的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明人工合成scl基因，將scl基因重組于畢赤酵母基因組進(jìn)行表達(dá)獲得的Scl 蛋白，將表達(dá)產(chǎn)物純化后獲得的Scl蛋白能有效地抑制雞胚絨毛尿囊膜血管新生，具有治療腫瘤的功能。血管生成抑制因子在通過抑制腫瘤的血管新生而治療腫瘤中有著重要的用途。雖然已發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子有多種，但是本發(fā)明的血管生成抑制因子基因序列小，分子量小的藥物有利于在機(jī)體內(nèi)的傳輸，并且Scl蛋白抑制血管生成的作用較強(qiáng)。為生產(chǎn)特效的治療腫瘤的藥物的研究和開發(fā)應(yīng)用創(chuàng)造了必要的條件，具有重要的理論和實(shí)踐意義。


附圖1.構(gòu)建含scl基因的畢赤酵母表達(dá)載體附圖2.純化重組蛋白M.蛋白Marker ；1.純化的重組蛋白。附圖3. Scl蛋白抑制雞胚絨毛尿囊膜新血管生成試驗(yàn)A. PBS ；B. Scl 蛋白(20 μ g) ；C. Angiostatin 蛋白(20 μ g)附圖4. Scl蛋白治療試驗(yàn)小鼠腫瘤a. PBS ;b. Scl 蛋白
具體實(shí)施例方式1. DNA序列的合成(1)設(shè)計(jì)如下DNA序列。ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTT CATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACA CCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCATCATCATCATCATCATTAG(2)合成如下引物pi.5’ ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC3’ρ2·5’ TTCTTGCCCTTGTAGTTGAAGATGACATGAACCTTCTTGGTGCCAGGGCCACAGATGTC3’ρ3· 5 ’ TTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGA3’ρ4·5 ’ TGGTTGTCTGGCCGCACAATCAGTGTAAGGTGTGTAAACTCATCATCCTTGCAACGGAT3’p5. CTAATGATGATGATGATGATGGTTGTCTGGCCGCACAA3，(3)用如下套疊PCR法進(jìn)行以上序列的合成，其步驟是①應(yīng)用Pl和ρ2引物進(jìn)行PCR，獲得產(chǎn)物1。②用Ρ3和ρ4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物2。
③以上獲得的產(chǎn)物1和產(chǎn)物2的混合物為底物，用引物Pl和p5進(jìn)行擴(kuò)增，獲得產(chǎn)物3。(4)將以上PCR產(chǎn)物3連接于T載體，進(jìn)行DNA序列分析證明所獲的DNA序列與設(shè)計(jì)的一致ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTT CATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACA CCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCATCATCATCATCATCATTAG2.核苷酸序列編碼蛋白功能的證明(I)DNA序列重組于酵母中表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化通過DNA內(nèi)切酶和T4DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K的多克隆位點(diǎn)，將其表達(dá)載體命名為pPPIC9K-scl (附圖1)。用電轉(zhuǎn)法將 pPIC9K-scl轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得工程菌GS115(pPIC9K-scl)。用BMGY-BMMY培養(yǎng)基發(fā)酵GS115(pIPIC9K-scl)誘導(dǎo)表達(dá)Scl蛋白。將發(fā)酵液上清過Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化柱，獲得符合標(biāo)準(zhǔn)分子量的目標(biāo)蛋白(附圖2)。(2) Scl蛋白抑制血管新生活性分析將以上收獲的含蛋白的液體經(jīng)過抽濾除鹽后，通過抑制雞胚絨毛血管生成試驗(yàn)。證明純化的Scl蛋白具有抑制新生血管生成的活性(附圖3)。(3) Scl蛋白治療腫瘤試驗(yàn)1)實(shí)用例一在7周雄性C57BL6/J小鼠的背部接種3X 106B16黑色素瘤細(xì)胞/0. 2ml/每只小鼠。一共接種20只小鼠。根據(jù)公式腫瘤體積V = O. 52X長X寬計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤達(dá)到平均IOOmm3時(shí)，將動物分為A、B兩組，每組10只。A組注射PBS溶液，B組每天注射 Scl蛋白(5mg/kg/d)，每天用藥一次，連續(xù)用藥12d。每天記錄腫瘤的體積。將A組和B組在用藥期間的腫瘤體積變化結(jié)果記錄于表1。兩組的腫瘤的體積呈顯著性差異(P < 0. 01)。表1.用藥期間A組和B組腫瘤的體積變化的平均值
權(quán)利要求
1.一種治療腫瘤的蛋白質(zhì)，其特征在于編碼這種蛋白質(zhì)的核苷酸序列是 atgcacggag actcagaata caacatcatg tttggtcccg acatctgtgg ccctggcacc aagaaggttc atgtcatctt caactacaag ggcaagaacg tgctgatcaa caaggacatc cgttgcaagg atgatgagtt tacacacctt acactgattg tgcggccaga caaccatcat catcatcatc attag
2.一種治療腫瘤的蛋白質(zhì)，其特征在于這種蛋白質(zhì)的氨基酸序列是 Met His Gly Asp Ser Glu Tyr Asn lie Met Phe Gly Pro Asp lie 151015 Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val His Val lie Phe Asn Tyr Lys202530Gly Lys Asn Val Leu lie Asn Lys Asp lie Arg Cys Lys Asp Asp 354045Glu Phe Thr His Leu Thr Leu lie Val Arg Pro Asp Asn His His 505560His His His His。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療腫瘤的蛋白質(zhì)的核苷酸序列和權(quán)利要求2所述的一種治療腫瘤的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其特征在于利用所述的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)制備治療腫瘤的藥物和醫(yī)藥制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療腫瘤的蛋白質(zhì)的核苷酸序列和氨基酸序列。是人工合成的DNA序列。具體核苷酸序列是序列表中1項(xiàng)下的序列，具體氨基酸序列是序列表中2項(xiàng)下的序列。將這一人工合成的DNA序列重組于畢赤酵母基因組，在畢赤酵母中表達(dá)重組蛋白，經(jīng)過純化的這種蛋白質(zhì)能效地抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，能有效地治療腫瘤。本發(fā)明為生產(chǎn)特效的治療腫瘤的藥物的研究和開發(fā)應(yīng)用創(chuàng)造了必要的條件，具有重要的理論和實(shí)際意義。
文檔編號C12N15/12GK102443586SQ20111031963
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者劉振旺, 張澤華, 張?zhí)碓? 張愛聯(lián), 沈錦城, 羅進(jìn)賢 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 海南金寶正誠礦業(yè)有限公司