專利名稱：酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種固態(tài)發(fā)酵制備酪酸梭菌的方法。
背景技術(shù)：
酪酸梭菌又稱酪酸梭狀芽孢桿菌，酪酸桿菌，酪酸菌，丁酸梭狀芽孢桿菌，丁酸梭菌，丁酸桿菌，丁酸菌，拉丁文Clostridium butyricum。本菌存在于土壤、動(dòng)物和人體的腸道中，細(xì)菌學(xué)分類歸屬于梭菌屬，為革蘭氏陽(yáng)性厭氧桿菌。菌體中常有圓形成或橢圓形芽胞，使菌體中部膨大呈梭形。該菌在37°C、PH7時(shí)為生長(zhǎng)發(fā)育的最適條件，它能利用多種糖類，如葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和果糖等，并能利用淀粉。本菌的主要代謝產(chǎn)物為丁酸、乙酸。酪酸菌是調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡的有益菌，其在人體腸道內(nèi)可體現(xiàn)五大生物特性1、促進(jìn)腸道有益菌群(雙歧桿菌，乳酸桿菌)的增殖和發(fā)育，抑制腸道內(nèi)有害菌和腐敗菌的生長(zhǎng)、繁殖，糾正腸道菌群紊亂，減少腸毒素的發(fā)生。2、在腸道內(nèi)能產(chǎn)生B族維生素、 維生素K、淀粉酶等物質(zhì)，對(duì)人體具有保健作用。3、酪酸菌的主要代謝產(chǎn)物丁酸是腸道上皮組織細(xì)胞的再生和修復(fù)主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。4、酪酸菌是厭氧芽胞桿菌，穩(wěn)定性好，在人體內(nèi)不受胃酸、膽汁酸等影響，在體外室溫下能保存三年以上。5、酪酸菌對(duì)多種抗生素有較強(qiáng)的耐受性，在臨床上可與其并用。目前酪酸梭菌的菌劑產(chǎn)品主要通過(guò)液態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)，發(fā)酵后通過(guò)固液分離獲得菌體沉淀物，而后加輔料，通過(guò)低熱干燥或冷凍干燥制成菌劑產(chǎn)品，而發(fā)酵過(guò)程中酪酸菌產(chǎn)生的各種生理活性成分，如有機(jī)酸、水解酶、維生素、天然抗菌物質(zhì)和促生長(zhǎng)因子均隨分離的上清液體排放掉。這既浪費(fèi)了發(fā)酵產(chǎn)生的有效寶貴資源，又增加了對(duì)排放廢水治理的負(fù)擔(dān)，浪費(fèi)了資源。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，本申請(qǐng)人提供了一種酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法。 本發(fā)明操作方法簡(jiǎn)單，成本低，所得到的酪酸梭菌質(zhì)量高，有效成分無(wú)損失。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法，具體步驟如下
(1)以麩皮、玉米粉、米糠為主料，添加營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽，制備成復(fù)合培養(yǎng)基，裝入發(fā)酵容器，對(duì)該復(fù)合培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；
(2)向發(fā)酵容器中通入氮?dú)?，?qū)趕發(fā)酵環(huán)境中的氧氣；同時(shí)將酪酸梭菌菌種與枯草芽孢桿菌菌種加入發(fā)酵容器中，與復(fù)合培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢杈鶆颍?br> (3)在通氮?dú)獾臈l件下將發(fā)酵容器中的混合物裝入不透氣無(wú)毒復(fù)合包裝袋，密封袋口， 在35、0°C環(huán)境中靜置，使酪酸梭菌發(fā)酵；發(fā)酵完畢后在低于50°C下烘干，粉碎，過(guò)篩，即成酪酸梭菌菌劑產(chǎn)品。所述主料的組分及各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為麩皮38飛5%，玉米粉20 30%，米糠15 35%，這三者的含水量均為12 15%;所述營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽的組分及各組分的質(zhì)量為以主料的重量為基數(shù)，葡萄糖占主料的0. 2 1%，酵母膏占主料的0. 5^0. 7%，牛骨蛋白胨占主料的0. 15 0. 35%，硫胺占主料的0. 15 0. 25%，NaCl占主料的0. 15 0. 2%，CaCO3占主料的 0. 2 0. 4%, MgSO4 · 7H20 占主料的 0. θΓθ. 03%。所述營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽的各組分先溶解在水中，然后再添加到主料中；所述水的用量為與主料中含水量加起來(lái)一共占復(fù)合培養(yǎng)基總質(zhì)量的45飛5%。所述酪酸梭菌菌種的重量為復(fù)合培養(yǎng)基總重量的1(Γ15%，所述枯草芽孢桿菌菌種的重量為復(fù)合培養(yǎng)基總重量的 0.5 1.5%。所述步驟(1)中滅菌條件為12(T130°C下3(T60min加熱滅菌。所述復(fù)合包裝袋可以為復(fù)合塑料袋或鋁箔袋。通過(guò)美蘭厭氧度指示劑觀察發(fā)酵環(huán)境中氧氣含量，當(dāng)所述美蘭厭氧度指示劑由深藍(lán)色逐漸變淺、變淡，接近無(wú)色，表明已達(dá)到無(wú)氧或微氧狀態(tài)。發(fā)酵時(shí)間可以為一周，也可以留在袋內(nèi)繼續(xù)發(fā)酵，產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量可進(jìn)一步得到提高，由于形成芽孢的酪酸梭菌很穩(wěn)定，封閉在袋內(nèi)的酪酸梭菌濕態(tài)產(chǎn)品可以在常溫下存放兩年。
本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于
本發(fā)明解決了酪酸梭菌液態(tài)發(fā)酵工藝的兩大問(wèn)題一是發(fā)酵液體經(jīng)固液分離只取菌體沉淀物制成菌劑產(chǎn)品，而發(fā)酵產(chǎn)生的多種有效活性成分，包括有機(jī)酸、消化酶、維生素、天然抗菌物質(zhì)和促生長(zhǎng)因子等，因?yàn)樗鼈兛扇?，卻隨廢液外排，寶貴資源嚴(yán)重浪費(fèi)；二是外排廢液污染程度高，COD達(dá)到了 2779ang/L，NH3-N 達(dá)到了 643. 8mg/L,形成了一種高濃度的有機(jī)廢水，為此需要加大環(huán)保治理力度，增加了企業(yè)的環(huán)保壓力。本發(fā)明使這兩個(gè)問(wèn)題得到解決，既大大提高了酪酸梭菌產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量和實(shí)際應(yīng)用效果，也可使酪酸梭菌產(chǎn)品的生產(chǎn)做到?jīng)]有發(fā)酵廢液外排，真正實(shí)現(xiàn)零排放清潔生產(chǎn)。本發(fā)明采用塑料袋(或鋁箔袋)替代厭氧發(fā)酵罐，具有下列優(yōu)點(diǎn)1、投資小，成本低；2、容量可大可??；3、容易處理達(dá)到厭氧或微氧條件；4、發(fā)酵產(chǎn)物可以干粉固態(tài)形式作產(chǎn)品，也可以濕態(tài)形式作為產(chǎn)品，后者可降低生產(chǎn)能耗；5、具有商品包裝功能。本發(fā)明發(fā)酵中通過(guò)生物耗氧體枯草芽孢桿菌，可促進(jìn)和穩(wěn)定環(huán)境厭氧，保障酪酸梭菌順利進(jìn)行發(fā)酵。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例所用酪酸梭狀芽孢桿菌的菌種源于江蘇省微生物研究所，菌種編號(hào) jsim-BCB 20040312?？莶菅挎邨U菌的菌種源于江蘇省微生物研究所，菌種編號(hào)jsim-1019。美蘭厭氧度指示劑的制備方法為(1)取3ml濃度為0. 5%的美蘭溶液，用蒸餾水稀釋至IOOml ;(2)配制6ml濃度為0. lmol/L的氫氧化鈉溶液，用蒸餾水稀釋至IOOml ； (3) 取6g試劑級(jí)葡萄糖加蒸餾水稀釋至IOOml ； (4)將上述三種溶液等體積混合即可得到美蘭厭氧度指示劑。實(shí)施例1
(1)以麩皮38kg、玉米粉30 kg、米糠32 kg為主料，其含水量為均12%，即主料的水分質(zhì)量為12kg ；添加溶于水中的營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽(營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽的組分為葡萄糖0. 2 kg，酵母膏 0.5 kg，牛骨蛋白胨 0.15 kg，硫胺 0.15 kg, NaCl 0. 15 kg, CaCO3 0.2 kg, MgSO4 ·7Η20 0.01 kg，以上組分溶解在61. Ilkg水中，與主料中水分加起來(lái)一共為73. Ilkg的水，其占復(fù)合培養(yǎng)基總質(zhì)量(162. 47kg)的45%)，制備成復(fù)合培養(yǎng)基，裝入發(fā)酵容器，對(duì)該復(fù)合培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌條件為120°C下50min加熱滅菌；
(2)向發(fā)酵容器中通入氮?dú)?，?qū)趕發(fā)酵環(huán)境中的氧氣；同時(shí)將16.247kg (占復(fù)合培養(yǎng)基總質(zhì)量的10%)的酪酸梭菌菌種與0. 81kg (占復(fù)合培養(yǎng)基總質(zhì)量的0. 5%)的枯草芽孢桿菌菌種加入發(fā)酵容器中，與復(fù)合培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢杈鶆颍?br> (3)在通氮?dú)獾臈l件下將發(fā)酵容器中的混合物裝入不透氣無(wú)毒復(fù)合塑料袋，密封袋口， 在35°C環(huán)境中靜置一周，使酪酸梭菌發(fā)酵；發(fā)酵完畢后在45°C下烘干，粉碎，過(guò)篩，即成酪酸梭菌菌劑產(chǎn)品。實(shí)施例2
(1)以麩皮陽(yáng)kg、玉米粉25kg、米糠20 kg為主料，其含水量為均15%，即主料的水分質(zhì)量為15kg ；添加溶于水中的營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽(營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽的組分為葡萄糖1 kg，酵母膏 0.7 kg，牛骨蛋白胨0.35 kg %，硫胺0.25 kg,NaCl 0.2 kg, CaCO3 0.4 kg，MgSO4 ·7Η20 0. 03 kg,以上組分溶解在92. 47kg水中，與主料中水分加起來(lái)一共為107. 47kg的水，其占復(fù)合培養(yǎng)基總質(zhì)量(195. 4kg)的55%)，制備成復(fù)合培養(yǎng)基，裝入發(fā)酵容器，對(duì)該復(fù)合培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，滅菌條件為130°C下30min加熱滅菌；
(2)向發(fā)酵容器中通入氮?dú)?，?qū)趕發(fā)酵環(huán)境中的氧氣；同時(shí)將四.31kg(占復(fù)合培養(yǎng)基總重量的15%)的酪酸梭菌菌種與2. 931kg (占復(fù)合培養(yǎng)基總重量的1. 5%)的枯草芽孢桿菌菌種加入發(fā)酵容器中，與復(fù)合培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢杈鶆颍?br> (3)在通氮?dú)獾臈l件下將發(fā)酵容器中的混合物裝入不透氣無(wú)毒鋁箔袋，密封袋口，在 40°C環(huán)境中靜置一周，使酪酸梭菌發(fā)酵；發(fā)酵完畢后在45°C下烘干，粉碎，過(guò)篩，即成酪酸梭菌菌劑產(chǎn)品。檢測(cè)與對(duì)比
實(shí)施例1和2所制備得到的發(fā)酵產(chǎn)品采用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，然后按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)NY 527-2002光合細(xì)菌菌劑標(biāo)準(zhǔn)附錄B有效活菌數(shù)的測(cè)定步驟 MPN 5管法進(jìn)行計(jì)算，實(shí)施例1中發(fā)酵產(chǎn)品中酪酸梭菌活菌數(shù)和芽孢數(shù)為1. 3*109cfu/克， 實(shí)施例2中發(fā)酵產(chǎn)品中酪酸梭菌活菌數(shù)和芽孢數(shù)為2. I^lO9Cfu/克；一般液體發(fā)酵法生產(chǎn)的酪酸梭菌的含量為3. 6 6. 4*108cfu/ ml,《天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)》2010年第二期《酪酸梭狀芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化》報(bào)道4. l*108cfu/ml,《飼料工業(yè)》2004年第25卷第2期《一株飼用酪酸菌特性和培養(yǎng)條件的研究》報(bào)道8. 2*108cfu/ml,《飼料工業(yè)》2005年第沈卷第 10期《酪酸梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)條件的研究》報(bào)道6. 5*108cfu/ml，《飼料工業(yè)》2009年第4期 《益生菌酪酸菌93-7發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的研究》報(bào)道8. 5*108cfu/ml。上述數(shù)據(jù)單位中 Iml可以約為lg。通過(guò)對(duì)比實(shí)施例及所提供的對(duì)比例，本固態(tài)發(fā)酵法的發(fā)酵活菌數(shù)和芽孢數(shù)提高了 2飛倍。
權(quán)利要求
1.一種酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于具體步驟如下(1)以麩皮、玉米粉、米糠為主料，添加營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽，制備成復(fù)合培養(yǎng)基，裝入發(fā)酵容器，對(duì)該復(fù)合培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；(2)向發(fā)酵容器中通入氮?dú)?，?qū)趕發(fā)酵環(huán)境中的氧氣；同時(shí)將酪酸梭菌菌種與枯草芽孢桿菌菌種加入發(fā)酵容器中，與復(fù)合培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢杈鶆颍?3)在通氮?dú)獾臈l件下將發(fā)酵容器中的混合物裝入不透氣無(wú)毒復(fù)合包裝袋，密封袋口， 在35、0°C環(huán)境中靜置，使酪酸梭菌發(fā)酵；發(fā)酵完畢后在低于50°C下烘干，粉碎，過(guò)篩，即成酪酸梭菌菌劑產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述主料的組分及各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為麩皮38 55%，玉米粉20 30%，米糠15 35%，這三者的含水量均為 12 15%;所述營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽的組分及各組分的質(zhì)量為以主料的重量為基數(shù)，葡萄糖占主料的0. 2 1%，酵母膏占主料的0. 5^0. 7%，牛骨蛋白胨占主料的0. 15^0. 35%，硫胺占主料的 0. 15 0. 25%, NaCl 占主料的 0. 15 0. 2%, CaCO3 占主料的 0. 2 0. 4%, MgSO4 · 7H20 占主料的 0.01 0.03%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽的各組分先溶解在水中，然后再添加到主料中；所述水的用量為與主料中含水量加起來(lái)一共占復(fù)合培養(yǎng)基總質(zhì)量的45飛5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述酪酸梭菌菌種的重量為復(fù)合培養(yǎng)基總重量的1(Γ15%，所述枯草芽孢桿菌菌種的重量為復(fù)合培養(yǎng)基總重量的 0. 5 1. 5%ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述步驟(1)中滅菌條件為12(Tl30°C下3(T60min加熱滅菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法，其特征在于，所述復(fù)合包裝袋可以為復(fù)合塑料袋或鋁箔袋。
全文摘要
一種酪酸梭菌的固態(tài)發(fā)酵方法，具體步驟如下(1)以麩皮、玉米粉、米糠為主料，添加營(yíng)養(yǎng)物和無(wú)機(jī)鹽，制備成復(fù)合培養(yǎng)基，裝入發(fā)酵容器，對(duì)該復(fù)合培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌；(2)向發(fā)酵容器中通入氮?dú)?，?qū)趕發(fā)酵環(huán)境中的氧氣；同時(shí)將酪酸梭菌菌種與枯草芽孢桿菌菌種加入發(fā)酵容器中，與復(fù)合培養(yǎng)基充分?jǐn)嚢杈鶆颍?3)在通氮?dú)獾臈l件下將發(fā)酵容器中的混合物裝入不透氣無(wú)毒復(fù)合包裝袋，密封袋口，在35~40℃環(huán)境中靜置，使酪酸梭菌發(fā)酵；發(fā)酵完畢后在低于50℃下烘干，粉碎，過(guò)篩，即成酪酸梭菌菌劑產(chǎn)品。本發(fā)明操作方法簡(jiǎn)單，成本低，所得到的酪酸梭菌質(zhì)量高，有效成分無(wú)損失。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102533597SQ20111043704
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者劉鳳琴, 薛宏基, 鄒益東 申請(qǐng)人:宜興市天石飼料有限公司