專利名稱：抗銅綠假單胞菌的i血清型脂多糖的抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗銅綠假單胞菌的I血清型脂多糖的抗體及其應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及特異性地結(jié)合銅綠假單胞菌菌株的I血清型脂多糖的抗體，以及包含任何所述抗體的藥物組合物、用于銅綠假單胞菌感染的診斷劑和銅綠假單胞菌檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種廣泛且通常分布在自然環(huán)境中如土壌和水中的革蘭氏陰性需氧桿菌。銅綠假單胞菌是ー種無(wú)毒性細(xì)菌，其對(duì)于健康受試者通常是不致病的，所述健康受試者對(duì)于銅綠假單胞菌具有中等抗體效價(jià)和足夠的免疫功能。但是，一旦體弱患者感染了銅綠假單胞菌，銅綠假單胞菌可導(dǎo)致嚴(yán)重的癥狀，所述癥狀可導(dǎo)致所述患者死亡。為此，銅綠假單胞菌作為醫(yī)院感染和機(jī)會(huì)感染的主要病原菌已引起關(guān)注，因此銅綠假單胞菌感染的預(yù)防和治療在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已是重要的問(wèn)題。 對(duì)于銅綠假單胞菌感染的預(yù)防或治療，主要使用抗生素或合成抗細(xì)菌劑。但是，銅綠假單胞菌對(duì)這些藥物產(chǎn)生抗性，因此這些藥物在許多情況下無(wú)法提供足夠的治療效果。特別地，使用抗生素等治療耐多藥銅綠假單胞菌(MDRP)的感染很困難，并且有限制。為此，作為其替代方法，已開(kāi)始使用免疫球蛋白制劑的治療。同吋，也檢驗(yàn)了使用抗銅綠假單胞菌的抗體預(yù)防或治療銅綠假單胞菌感染。例如，已開(kāi)發(fā)了抗體，其各自特異性地結(jié)合具體血清型銅綠假單胞菌菌株上(專利文獻(xiàn)I至5，非專利文獻(xiàn)I和2)。但是，目前開(kāi)發(fā)的抗銅綠假單胞菌的抗體在銅綠假單胞菌感染的預(yù)防或治療中尚未提供足夠的效果。引文列表專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I日本未審查專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No. Hei 6-178688專利文獻(xiàn)2日本未審查專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No. Hei 6-178689專利文獻(xiàn)3日本未審查專利申請(qǐng)公開(kāi)文本No. Hei 7-327677專利文獻(xiàn)4國(guó)際公開(kāi)文本No. WO 2004/101622
專利文獻(xiàn)5國(guó)際公開(kāi)文本No. WO 2006/084758非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I The Journal of Infectious Diseases, 152，6，1985，1290-1299。非專利文獻(xiàn)2 Journal of General Microbiology, 133，1987，3581-3590。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題考慮到上述情況而作出本發(fā)明，并且本發(fā)明的目的是提供ー種具有對(duì)銅綠假單胞菌的優(yōu)良抗細(xì)菌活性的新抗體。本發(fā)明的ー個(gè)主要目的是提供ー種對(duì)銅綠假單胞菌具有優(yōu)良的抗細(xì)菌活性并且可用作多克隆抗體制劑的組分的新抗體。作為這種新抗體的ー個(gè)方面，本發(fā)明的目的是提供一種特異性地結(jié)合銅綠假單胞菌菌株的I血清型脂多糖的抗體。技術(shù)方案為達(dá)到上述目的，本發(fā)明人采用了以下方法。首先，從患有慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊腫性纖維化患者和健康志愿者中采集血液樣本。將具有高比例的對(duì)于脂多糖(下文中有時(shí)簡(jiǎn)稱為“LPS”)具有特異性的成漿細(xì)胞的供體樣本通過(guò)以下方法進(jìn)行鑒定(I)測(cè)定在循環(huán)血液中成漿細(xì)胞和漿細(xì)胞的量的FACS分析；(2)測(cè)定在循環(huán)血液中產(chǎn)生對(duì)具體LPS抗原具有特異性的抗體的細(xì)胞的量的ELISP0T分析；以及(3)測(cè)定對(duì)具體LPS抗原具有特異性的免疫球蛋白存在或不存在的ELISA分析。然后，從由此鑒定的供體樣本制備識(shí)別LPS的抗體。 具體地，通過(guò)染色⑶19、⑶38、A輕鏈和死細(xì)胞來(lái)選擇活成漿細(xì)胞。在選出的成漿細(xì)胞上，來(lái)源于相同的B細(xì)胞的編碼重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的DNA序列通過(guò)兩步PCR——包括多重重疊延伸RT-PCR和隨后的巢式PCR——而配對(duì)(圖I)。隨后，將擴(kuò)增DNA插入到篩選載體中,然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichia coli)中。從所述大腸桿菌中純化出擴(kuò)增載體集合。將所得的抗體庫(kù)在動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)ELISA篩選編碼可結(jié)合純化的LPS分子的抗體的克隆體，并選擇LPS特異性克隆。然后，測(cè)定所選克隆的堿基序列。其后，檢測(cè)由如此得到的克隆編碼的抗體的多種活性、其血清型特異性和抗原表位。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了鑒定的抗體可結(jié)合銅綠假單胞菌的I血清型LPS，且在體外和體內(nèi)具有優(yōu)良的抗細(xì)菌活性。具體地，本發(fā)明涉及可結(jié)合銅綠假單胞菌的I血清型LPS的抗體，展現(xiàn)出優(yōu)良的抗細(xì)菌活性。本發(fā)明還涉及所述抗體的用途。更具體地，本發(fā)明提供了[I] ー種抗體，其可識(shí)別銅綠假單胞菌的脂多糖的B帶LPS，且其實(shí)質(zhì)上可與I血清型的銅綠假單胞菌菌株的表面結(jié)合，但實(shí)質(zhì)上不與A、B、E、G和M血清型銅綠假單胞菌菌株的任一表面結(jié)合。[2]根據(jù)第I條所述的抗體，其具有對(duì)I血清型的銅綠假單胞菌菌株的調(diào)理素活性。[3]根據(jù)第2條所述的抗體，其中對(duì)由ATCC 27586標(biāo)識(shí)的銅綠假單胞菌菌株的調(diào)理素活性的EC50為0. 5 ii g/ml或更小。[4]根據(jù)第I至3條的任一項(xiàng)所述的抗體，其具有對(duì)I血清型的銅綠假單胞菌菌株的凝集活性。[5]根據(jù)第4條所述的抗體，其中對(duì)由ATCC 27586標(biāo)識(shí)的銅綠假單胞菌菌株的單位量(U g) IgG的凝集效價(jià)為20或更大。[6]根據(jù)第I至5條的任一項(xiàng)所述的抗體，其對(duì)I血清型的銅綠假單胞菌菌株的全身性感染具有抗細(xì)菌作用。[7]根據(jù)第6條所述的抗體，其中對(duì)全身性感染由ATCC 27586標(biāo)識(shí)的銅綠假單胞菌菌株的中性粒細(xì)胞減少癥小鼠模型的抗細(xì)菌作用的ED50不大于青霉酮(Venilon)的抗細(xì)菌作用的ED50的1/100。[8]具有以下特征(a)至(f)的任ー項(xiàng)的抗體(a)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: I至3所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ IDNO: I至3所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:4至6所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、刪除、加入和/或插入的SEQ IDN0:4至6所示的氨基酸序列；(b)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:9至11所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ IDN0:9至11所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: 12至14所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO: 12至14所示的氨基酸序列；(C)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: 17至19所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO: 17至19所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:20至22所示的氨基酸序列；(d)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:25至27所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:28至30所示的氨基酸序列；(e)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:33至35所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:36至38所示的氨基酸序列；以及(f)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:41至43所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:41至43所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:44至46所示的氨基酸序列。[9]具有以下特征(a)至(f)的任ー項(xiàng)的抗體
(a)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；(b)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列；
(C)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:23所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列；(d)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:31所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:32所示的氨基酸序列；(e)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:40所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:40所示的氨基酸序列；以及(f)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:47所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:47所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:48所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。[10]包含所述抗體的輕鏈或輕鏈可變區(qū)的肽，所述肽具有以下特征(a)至⑴的任ー項(xiàng)(a)包括SEQ ID NO: I至3所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中ー個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: I至3所示的氨基酸序列；(b)包括SEQ ID N0:9至11所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中ー個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:9至11所示的氨基酸序列；(c)包括SEQ ID NO: 17至19所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 17至19所示的氨基酸序列；(d)包括SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列；(e)包括SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列；以及(f)包括SEQ ID N0:41至43所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:41至43所示的氨基酸序列。[11]包含所述抗體的輕鏈或輕鏈可變區(qū)的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任ー項(xiàng)(a)包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
(b)包括SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列；(c)包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列；(d)包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；(e)包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；以及(f)包括SEQ ID N0:47所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。[12]包含所述抗體的重鏈或重鏈的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一項(xiàng)(a)包括SEQ ID N0:4至6所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中ー個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:4至6所示的氨基酸序列；(b)包括SEQ ID NO: 12至14所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 12至14所示的氨基酸序列；(c)包括SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列；(d)包括SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列；(e)包括SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列；以及(f)包括SEQ ID N0:44至46所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列。[13]包含所述抗體的重鏈或重鏈可變區(qū)的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任ー項(xiàng)(a)包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；(b)包括SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列；
(c)包括SEQ ID NO: 24所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；(d)包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；(e)包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及(f)包括SEQ ID N0:48所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。[14]在下述(a)至(f)任一項(xiàng)所述的抗體中，可結(jié)合I血清型的銅綠假單胞菌菌株的脂多糖的B帶LPS中的表位的抗體

(a)包含包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；(b)包含包括SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；(C)包含包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；(d)包含包括SEQ ID N0:31所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；(e)包含包括SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；以及(f)包含包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體。[15]編碼根據(jù)第I至14條的任一條所述的抗體或肽的DNA。[16]產(chǎn)生根據(jù)第I至9條和14條的任一條所述的抗體的雜交瘤。[17]用干與銅綠假單胞菌相關(guān)的疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)第I至9條和14條的任一條所述的抗體；和任選至少ー種可藥用載體和/或稀釋劑。[18]根據(jù)第17條所述的藥物組合物，其中與銅綠假單胞菌相關(guān)的疾病是由銅綠假單胞菌感染導(dǎo)致的全身性感染性疾病。[19]根據(jù)第17條所述的藥物組合物，其中與銅綠假單胞菌相關(guān)的疾病是由銅綠假單胞菌感染導(dǎo)致的肺部感染性疾病。[20]用于檢測(cè)銅綠假單胞菌的診斷劑，所述診斷劑包含根據(jù)第1、8、9和14條中任一條所述的抗體。[21]用于銅綠假單胞菌的檢測(cè)的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)第1、8、9和14條中任一條所述的抗體。有益效果本發(fā)明提供了可結(jié)合銅綠假單胞菌的I血清型LPS的抗體，其展現(xiàn)出優(yōu)良的抗細(xì)菌活性。本發(fā)明的抗體可展現(xiàn)出對(duì)于銅綠假單胞菌的全身性感染的優(yōu)良調(diào)理素作用和優(yōu)良抗細(xì)菌作用。此外，由于本發(fā)明的抗體來(lái)源于患有慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊腫性纖維化患者，可以預(yù)計(jì)抗臨床銅綠假單胞菌菌株的優(yōu)良作用。本發(fā)明的抗體可制備為人抗體，因此是高度安全的。使用本發(fā)明的抗體使得有可能有效治療或預(yù)防由銅綠假單胞菌(包括耐多藥銅綠假單胞菌)導(dǎo)致的感染，如HAP / VAP、菌血癥、敗血癥和燒傷創(chuàng)面感染。


[圖I]圖I是顯示用于得到編碼本發(fā)明的抗體的DNA的兩步PCR的圖。[圖2]圖2是顯示用于使來(lái)自于相同B細(xì)胞的編碼重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的序列進(jìn)行配對(duì)的00-VP-002載體的圖。
具體實(shí)施方案本發(fā)明提供了可結(jié)合銅綠假單胞菌的I血清型LPS的新抗體。在本發(fā)明中“抗體”包括所有種類和所有亞類的免疫球蛋白。所述“抗體”包括多克隆抗體和單克隆抗體，還包括抗體的功能性片段的形式?！岸嗫寺】贵w”是指包含針對(duì)不同表位的不同種類抗體的抗體制劑。同吋，“單克隆抗體”是指從基本同源的抗體群得到的抗體(包括抗體片段)。與多克隆抗體相比，單克隆抗體可識(shí)別抗原上的單個(gè)決定簇。本發(fā)明中的多克隆抗體還包括能夠識(shí)別抗原上多個(gè)表位的多個(gè)單克隆抗體的結(jié)合物。本發(fā)明的抗體是分離的抗體，即，從自然環(huán)境的組分中分離和/或回收的抗體。本發(fā)明的抗體所結(jié)合的“脂多糖(LPS) ”是革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁外膜的組分，是由脂類和多糖形成的物質(zhì)(糖脂)。其糖鏈由稱作核心多糖(或核心寡糖)的部分和稱作0抗原(0側(cè)鏈多糖)的部分形成?！癆-帶LPS”是ー種LPS，其形成0抗原的多糖具有以下結(jié)構(gòu)。具體地，在該結(jié)構(gòu)中，重復(fù)出現(xiàn)均由“3)-a -D-鼠李糖-(1 — 2) - a -D-鼠李糖-(I — 3) - a -D-鼠李糖-(I ”組成的單元。在這些單元中，D-鼠李糖通過(guò)a -I, 2和a -I, 3鍵連接。其結(jié)構(gòu)式顯示于下文；但是，由a-1,2-鍵連接的D-鼠李糖和由a-1,3-鍵連接的D-鼠李糖的支化模式不限于下文顯示的那些。[化學(xué)式I]
權(quán)利要求
1.一種抗體，所述抗體可識(shí)別銅綠假單胞菌的脂多糖的B帶LPS，并且實(shí)質(zhì)上可與I血清型銅綠假單胞菌菌株的表面結(jié)合，但實(shí)質(zhì)上不與A、B、E、G和M血清型銅綠假單胞菌菌株的任一表面結(jié)合。
2.權(quán)利要求I的抗體，其具有對(duì)I血清型銅綠假單胞菌菌株的調(diào)理素活性。
3.權(quán)利要求2的抗體，其中對(duì)由ATCC27586標(biāo)識(shí)的銅綠假單胞菌菌株的調(diào)理素活性的EC50 為 O. 5 μ g/ml 或更小。
4.權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)的抗體，其具有對(duì)I血清型銅綠假單胞菌菌株的凝集活性。
5.權(quán)利要求4的抗體，其中對(duì)由ATCC27586標(biāo)識(shí)的銅綠假單胞菌菌株的單位量(μ g)IgG的凝集效價(jià)為20或更大。
6.權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)的抗體，其具有對(duì)I血清型銅綠假單胞菌菌株的全身性感染的抗細(xì)菌作用。
7.權(quán)利要求6的抗體，其中對(duì)全身性感染由ATCC27586標(biāo)識(shí)的I血清型銅綠假單胞菌菌株的中性粒細(xì)胞減少癥小鼠模型的抗細(xì)菌作用的EC50不大于青霉酮的EC50的1/100。
8.具有以下特征(a)至(f)的任一項(xiàng)的抗體 (a)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: I至3所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ IDNO: I至3所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:4至6所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ IDN0:4至6所示的氨基酸序列； (b)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:9至11所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ IDN0:9至11所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: 12至14所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO: 12至14所示的氨基酸序列； (c)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: 17至19所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO: 17至19所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:20至22所示的氨基酸序列； (d)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO: 25至27所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:28至30所示的氨基酸序列； (e)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:33至35所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO: 33至35所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:36至38所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO: 36至38所示的氨基酸序列；以及 (f)包含輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:41至43所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:41至43所示的氨基酸序列，和重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:44至46所不的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQID NO:44至46所示的氨基酸序列。
9.具有以下特征(a)至(f)的任ー項(xiàng)的抗體(a)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置 換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列； (b)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列； (c)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:24所示的氨基酸序列； (d)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 32所示的氨基酸序列； (e)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:39所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及 (f)包含 輕鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列，和 重鏈可變區(qū)，其包括SEQ ID N0:48所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
10.包含抗體的輕鏈或輕鏈可變區(qū)的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任ー項(xiàng)(a)包括SEQ ID NO:l至3所示的氨基酸序列或在其至少ー個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: I至3所示的氨基酸序列；(b)包括SEQID N0:9至11所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:9至11所示的氨基酸序列； (c)包括SEQID NO: 17至19所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 17至19所示的氨基酸序列； (d)包括SEQID NO:25至27所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:25至27所示的氨基酸序列； (e)包括SEQID NO:33至35所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 33至35所示的氨基酸序列；以及 (f)包括SEQID N0:41至43所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨 基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:41至43所示的氨基酸序列。
11.包含抗體的輕鏈或輕鏈可變區(qū)的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一項(xiàng) (a)包括SEQID NO:7所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、力口入和/或插入的SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列； (b)包括SEQID NO: 15所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、力口入和/或插入的SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列； (c)包括SEQID N0:23所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、力口入和/或插入的SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列； (d)包括SEQID NO:31所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、力口入和/或插入的SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列； (e)包括SEQID N0:39所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、力口入和/或插入的SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；以及 (f)包括SEQID NO:47所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、力口入和/或插入的SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
12.包含抗體的重鏈或重鏈可變區(qū)的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一項(xiàng) (a)包括SEQID N0:4至6所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID N0:4至6所示的氨基酸序列； (b)包括SEQID NO: 12至14所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 12至14所示的氨基酸序列； (c)包括SEQID NO:20至22所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:20至22所示的氨基酸序列； (d)包括SEQID NO:28至30所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:28至30所示的氨基酸序列； (e)包括SEQID NO:36至38所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO: 36至38所示的氨基酸序列；以及 (f)包括SEQID N0:44至46所示的氨基酸序列或在其至少一個(gè)序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、加入和/或插入的SEQ ID NO:44至46所示的氨基酸序列。
13.包含抗體的重鏈或重鏈可變區(qū)的肽，所述肽具有以下特征(a)至(f)的任一項(xiàng)(a)包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、力口入和/或插入的SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；(b)包括SEQID NO: 16所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、カロ入和/或插入的SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列； (c)包括SEQID N0:24所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、カロ入和/或插入的SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列； (d)包括SEQID NO:32所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、カロ入和/或插入的SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列； (e)包括SEQID N0:40所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、カロ入和/或插入的SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；以及 (f)包括SEQID N0:48所示的氨基酸序列或在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、カロ入和/或插入的SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
14.在以下(a)至(f)中的任一項(xiàng)所述的抗體中，可結(jié)合I血清型銅綠假單胞菌菌株的 脂多糖的B帶LPS中的表位的抗體 (a)包含包括SEQID NO:7所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體； (b)包含包括SEQID NO: 15所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體； (c)包含包括SEQID NO:23所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體； (d)包含包括SEQID NO:31所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體； (e)包含包括SEQID NO:39所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID N0:40所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體；以及 (f)包含包括SEQID NO:47所示的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)和包括SEQ ID N0:48所示的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的抗體。
15.編碼權(quán)利要求I至14中任ー項(xiàng)的抗體或肽的DNA。
16.產(chǎn)生權(quán)利要求I至9和14中任ー項(xiàng)的抗體的雜交瘤。
17.用干與銅綠假單胞菌相關(guān)的疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含 權(quán)利要求I至9和14中任ー項(xiàng)的抗體；和任選 至少ー種可藥用載體和/或稀釋劑。
18.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中與銅綠假單胞菌相關(guān)的疾病是由銅綠假單胞菌感染導(dǎo)致的全身性感染疾病。
19.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中與銅綠假單胞菌相關(guān)的疾病是由銅綠假單胞菌感染導(dǎo)致的肺部感染疾病。
20.用于檢測(cè)銅綠假單胞菌的診斷劑，所述診斷劑包含權(quán)利要求1、8、9和14中任一項(xiàng)的抗體。
21.用于檢測(cè)銅綠假單胞菌的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1、8、9和14中任一項(xiàng)的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有對(duì)銅綠假單胞菌的優(yōu)良抗細(xì)菌活性的新抗體。通過(guò)使用從患有慢性銅綠假單胞菌肺部感染的囊腫性纖維化患者中得到的成漿細(xì)胞作為起始材料，成功地得到了可與I血清型銅綠假單胞菌菌株的LPS結(jié)合并在體外和體內(nèi)均具有優(yōu)良抗細(xì)菌活性的抗體。
文檔編號(hào)C12P21/08GK102858799SQ20118001024
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
發(fā)明者田中二朗, P·S·安德森, 奧富隆文, 稻葉常良, 大冢圭子, 赤羽宏友, 星名由佳利, 長(zhǎng)曽宏, 熊谷正志 申請(qǐng)人:明治制果藥業(yè)株式會(huì)社, 西福根有限公司