專利名稱：一種將液態(tài)漆酶制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種將微生物發(fā)酵生產(chǎn)的液態(tài)漆酶制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶的方法，該發(fā)明的特點(diǎn)是以2010年9月15日保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. SYBC-L3高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株為生產(chǎn)出發(fā)菌株，將各種不同成分的培養(yǎng)基和各種不同方法發(fā)酵生產(chǎn)的液態(tài)漆酶粗酶液制備成高濃度高純度的固態(tài)漆酶，所制備的產(chǎn)品既便于運(yùn)輸、保藏，又便于出口創(chuàng)匯競(jìng)爭(zhēng)國(guó)際市場(chǎng)，還可廣泛應(yīng)用于紡織印染、造紙、草坪修復(fù)、能源再生、飼料、食品、廢水處理等領(lǐng)域，該發(fā)明的方法和原則也將為生物技術(shù)類產(chǎn)品的純化、濃縮、制備所借鑒使用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
漆酶具有廣泛的底物，不僅能催化氧化多種芳香族化合物，還能降解木質(zhì)素、去除許多有毒酚類物質(zhì)的毒性，還可以使多種染料脫色及去除石油工業(yè)廢水的毒性等，因此在紡織印染、造紙、草坪修復(fù)、能源再生、飼料、食品、廢水處理等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價(jià)值而受到廣泛的關(guān)注?，F(xiàn)有漆酶的研究表明，漆酶的制備多數(shù)局限在實(shí)驗(yàn)室制備，所制備的漆酶活力偏低且制備成本偏高，我國(guó)市場(chǎng)上雖有固態(tài)漆酶，但酶活力很低且純度也很低，高活力高純度的固態(tài)漆酶完全依賴進(jìn)口且價(jià)格昂貴，每克10萬(wàn)單位的進(jìn)口固態(tài)漆酶，售價(jià)竟高達(dá)1600 元-4000元人民幣，甚至這樣的高價(jià)有時(shí)進(jìn)口貨還缺貨，從而極大地影響了漆酶在各領(lǐng)域中具有較大的應(yīng)用價(jià)值的推廣實(shí)施，其原因可能是國(guó)外在進(jìn)行液態(tài)漆酶純化和濃縮時(shí)，采用了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的方法，即將液態(tài)漆酶采用硫酸銨分級(jí)沉淀——DEAE-纖維素離子交換柱層析——冷凍干燥等方法，從而使液態(tài)漆酶的純化和濃縮成本費(fèi)用較高且效率較低，難以大批量制備，這促使我們?nèi)ヌ剿餮芯繉で笤鯓訉⒁簯B(tài)漆酶既要能低成本的純化和濃縮，又要能高效率且大批量的制備成高活性高純度的固態(tài)漆酶的方法，“一種將液態(tài)漆酶制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶的方法”就是在這樣的探索研究中發(fā)明的。

發(fā)明內(nèi)容
1、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和提供了一種既可將液態(tài)漆酶低成本的純化和濃縮，又可將液態(tài)漆酶高效率且大批量制備成高活性高純度固態(tài)漆酶的方法，率先將工廠常見的超濾設(shè)備和噴霧干燥設(shè)備應(yīng)用于高活性高純度固態(tài)漆酶的制備。2、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和提供了在使用超濾設(shè)備進(jìn)行漆酶粗酶液純化和濃縮時(shí)需根據(jù)液態(tài)漆酶的分子量大小和對(duì)純度的要求來(lái)選擇超濾膜的規(guī)格、分子量的原則、思路和方法。3、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和提供了在使用噴霧干燥機(jī)設(shè)備具體選用進(jìn)風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度時(shí)， 需根據(jù)液態(tài)酶液所含物質(zhì)的濃度和酶對(duì)溫度的耐熱性來(lái)決定，一般來(lái)說(shuō)酶耐熱性好，進(jìn)風(fēng)溫度可高些；進(jìn)風(fēng)溫度與出風(fēng)溫度溫差越大、液態(tài)酶液所含物質(zhì)的濃度越大，則干燥成固態(tài)酶的速度越快的特點(diǎn)和方法。4、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和提供了使用噴霧干燥設(shè)備——進(jìn)風(fēng)溫度150°C至200°C、出風(fēng)溫度70°C至90°C將液態(tài)漆酶噴霧干燥制備成固態(tài)漆酶的使用條件。5、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和提供了使用超濾設(shè)備——分子量為1萬(wàn)-10萬(wàn)規(guī)格的超濾膜可將液態(tài)漆酶純化濃縮5-20倍的條件和規(guī)律。6、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和提供了將發(fā)酵液——漆酶粗酶液直接用噴霧干燥設(shè)備按進(jìn)風(fēng)溫度150°C至200°C、出風(fēng)溫度70°C至90°C的條件可噴霧干燥成固態(tài)漆酶，固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的50倍以上，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶體積和重量的100倍以上的規(guī)律。7、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和提供了將發(fā)酵液——漆酶粗酶液先用超濾設(shè)備一選用分子量為1萬(wàn)-10萬(wàn)規(guī)格的超濾膜將液態(tài)漆酶粗酶液超濾純化濃縮5-20倍，再用噴霧干燥設(shè)備按進(jìn)風(fēng)溫度150°C至200°C、出風(fēng)溫度70°C至90°C的條件噴霧干燥制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶，固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的250倍以上，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶的體積和重量的800倍以上的規(guī)律。本發(fā)明的技術(shù)方案本發(fā)明是以2010年9月15日保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為 CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. STOC-L3高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株為生產(chǎn)出發(fā)菌株，將各種不同成分的培養(yǎng)基和各種方法生產(chǎn)的液態(tài)漆酶粗酶液為起始酶液分成3個(gè)步驟并運(yùn)用超濾設(shè)備和噴霧干燥設(shè)備來(lái)實(shí)現(xiàn)制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶的，并運(yùn)用相同的DMP酶活力測(cè)定方法測(cè)定固態(tài)漆酶和液態(tài)漆酶的活力并進(jìn)行比較，同時(shí)對(duì)固態(tài)漆酶和液態(tài)漆酶的重量和體積液進(jìn)行比較，具體如下1、起始液態(tài)漆酶液的來(lái)源包括(1)以豆粕或硝酸鈉為氮源，以麥芽糖或葡萄糖或果糖或纖維二糖或蔗糖等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)制備的液態(tài)漆酶。(2)以馬鈴薯為主要原料發(fā)酵制備的液態(tài)漆酶。(3)以水稻秸稈為原料固態(tài)發(fā)酵制備的液態(tài)漆酶。2、純化濃縮干燥的3個(gè)步驟包括(1)先將發(fā)酵生產(chǎn)制備出的漆酶粗酶液，用抽濾或壓濾或離心的方法，除去菌體、 較大的懸浮物和顆粒。(2)再將上述除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液，用超濾設(shè)備，先選用1萬(wàn)分子量的超濾膜，超濾除去分子量在1萬(wàn)以下的小分子物質(zhì)，然后用10萬(wàn)分子量的超濾膜， 收集分子量在1-10萬(wàn)的液體，得到純化且濃縮了 5-20倍的酶液，因?yàn)槲覀冎苽涞钠崦傅姆肿恿考s為5. 8萬(wàn)左右。(3)最后將經(jīng)超濾濃縮純化后的漆酶液，用噴霧干燥機(jī)設(shè)備，選用進(jìn)風(fēng)口溫度 150-200°C、出風(fēng)溫度70-90°C的條件，進(jìn)行噴霧干燥，得到高濃度高純度的固態(tài)漆酶。將高濃度高純度固態(tài)漆酶和液態(tài)漆酶粗酶液的活力進(jìn)行比較，將高濃度高純度固態(tài)漆酶和液態(tài)漆酶酶粗酶液的體積或重量進(jìn)行比較。(4)直接將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液用噴霧干燥設(shè)備按進(jìn)風(fēng)溫度 150°C至200°C、出風(fēng)溫度70°C至90°C的條件噴霧干燥成固態(tài)漆酶，將固態(tài)漆酶和液態(tài)漆酶粗酶液的活力進(jìn)行比較，將固態(tài)漆酶和液態(tài)漆酶酶粗酶液的體積或重量進(jìn)行比較。3、酶活的測(cè)定方法
3mL 反應(yīng)體系中包括0. 5ml 10mmol/L 的 2，6_ 二甲氧基酚；2. 4ml pH = 3. 0 的 0. lmol/L磷酸氫二鈉-檸檬素緩沖液；0. Iml粗酶液——發(fā)酵液經(jīng)冷凍高速離心機(jī)IOOOOg 離心10分鐘得到上清液并視酶活力稀釋，以去離子水替代粗酶液溶液作為空白對(duì)照，在 469nm處測(cè)吸光值每隔k讀取一次吸光度值，一般持續(xù)進(jìn)行Imin后停止測(cè)定，以反應(yīng)的線性范圍計(jì)算酶活。酶活力定義1分鐘催化一微摩爾底物所需酶量，酶活性以U · L—1表示。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明打破了將液態(tài)漆酶用實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)方法純化和濃縮制備成高活性高純度固態(tài)漆酶的做法，使得既可將液態(tài)漆酶低成本的純化和濃縮，又可將液態(tài)漆酶高效率且大批量的制備成高活性高純度固態(tài)漆酶的想法變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)，且方便易行。由于大大降低了純化和濃縮的成本，所制備的產(chǎn)品既便于運(yùn)輸、保藏，又便于出口創(chuàng)匯競(jìng)爭(zhēng)國(guó)際市場(chǎng)，從而將極大的促進(jìn)漆酶在各個(gè)領(lǐng)域中的運(yùn)用。同時(shí)，這一發(fā)明的方法和思路，也將為生物技術(shù)類產(chǎn)品的純化和濃縮方法的研究和生產(chǎn)提供借鑒和幫助。由于漆酶可廣泛應(yīng)用于紡織印染、造紙、草坪修復(fù)、能源再生、飼料、食品、廢水處理等方面，因此本發(fā)明將有力的促進(jìn)漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用，結(jié)合我們的等待審批的專利——高產(chǎn)漆酶的菌株和產(chǎn)漆酶的方法將實(shí)施于企業(yè)生產(chǎn)，必將生產(chǎn)制備出價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的漆酶產(chǎn)品來(lái)替代價(jià)格昂貴的進(jìn)口漆酶并出口競(jìng)爭(zhēng)國(guó)際市場(chǎng)。因此本發(fā)明具有廣泛的工業(yè)使用價(jià)值和顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效應(yīng)前景。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1取以豆粕或硝酸鈉為氮源，以麥芽糖或葡萄糖或果糖或纖維二糖等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)制備的液態(tài)漆酶粗酶液體積為40升，重量約40000克，粗酶液的活力為120U/ml。1、用先將發(fā)酵生產(chǎn)制備出的粗酶液，用大容量離心機(jī)離心或用定性濾紙抽濾或8 層紗布抽濾等方法，除去菌體、較大的懸浮物和顆粒。2、將上述除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液，用超濾設(shè)備，先選用1萬(wàn)分子量的超濾膜，超濾除去分子量在1萬(wàn)以下的小分子物質(zhì)，然后用10萬(wàn)分子量的超濾膜，超濾收集分子量在1-10萬(wàn)的液體，得到純化且濃縮了 10倍的液態(tài)漆酶。3、將經(jīng)超濾濃縮純化后的漆酶液，用噴霧干燥機(jī)設(shè)備，選用進(jìn)風(fēng)口溫度200°C，出風(fēng)溫度70°C的條件，進(jìn)行噴霧干燥，得到高純度高活力固態(tài)漆酶25. 4克，用DMP法測(cè)固態(tài)漆酶活力為8. 5萬(wàn)U/g(相當(dāng)于ABTS法測(cè)漆酶活力的二倍即17萬(wàn)U/g)。固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的708倍，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶的體積和重量的1575倍。4、如果將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液直接用噴霧干燥機(jī)設(shè)備——選用進(jìn)風(fēng)口溫度200°C，出風(fēng)溫度90°C的條件進(jìn)行噴霧干燥，得到固態(tài)漆酶250克，用DMP法測(cè)固態(tài)漆酶活力為13640U/g(相當(dāng)于ABTS法測(cè)漆酶活力的二倍即27^0U/g)。固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的114倍，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶的體積和重量的160倍。實(shí)施例2取以馬鈴薯為主要原料發(fā)酵高產(chǎn)制備的液態(tài)漆酶粗酶液體積為40升，重量40000克，粗酶液的活力為80U/ml。1、與實(shí)施例1中的(1)相同。2、與實(shí)施例1中的⑵相同，得到超濾后純化和濃縮了 5倍的酶液。3、用噴霧干燥機(jī)設(shè)備-選用進(jìn)風(fēng)口溫度150°C，出風(fēng)溫度70°C的條件，進(jìn)行噴霧干燥，得到高純度高活力固態(tài)漆酶27. 29克，用DMP法測(cè)固態(tài)漆酶活力為5. 1萬(wàn)U/g(相當(dāng)于 ABTS法測(cè)漆酶活力的二倍即10. 4萬(wàn)U/g)。固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的638倍，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶的體積和重量的1466倍。4、將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液直接用噴霧干燥機(jī)設(shè)備——選用進(jìn)風(fēng)口溫度150°C，出風(fēng)溫度70°C的條件進(jìn)行噴霧干燥，得到固態(tài)漆酶249克，用DMP法測(cè)固態(tài)漆酶活力為9120U/g(相當(dāng)于ABTS法測(cè)漆酶活力的二倍即1.8 萬(wàn)U/g)。固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的114倍，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶的體積和重量的161倍。實(shí)施例3取以水稻秸稈為原料固態(tài)發(fā)酵制備的液態(tài)漆酶酶粗酶液體積為30升，重量30000 克，液態(tài)粗酶液的活力為9. 2U/ml。1、與實(shí)施例1中的(1)相同。2、與實(shí)施例1中的⑵相同，得到超濾后純化和濃縮了 20倍的酶液。3、用噴霧干燥機(jī)設(shè)備-選用進(jìn)風(fēng)口溫度180°C，出風(fēng)溫度80°C的條件，進(jìn)行噴霧干燥，得到高純度高活力固態(tài)漆酶13. 25克，用DMP法測(cè)固態(tài)漆酶活力為8280U/g(相當(dāng)于 ABTS法測(cè)漆酶活力的二倍即1. 656萬(wàn)U/g)。固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的900倍，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶的體積和重量的2264倍。4、將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液直接用噴霧干燥機(jī)設(shè)備——選用進(jìn)風(fēng)口溫度180°C，出風(fēng)溫度80°C的條件進(jìn)行噴霧干燥，得到固態(tài)漆酶151克，用DMP法測(cè)固態(tài)漆酶活力為1145U/g(相當(dāng)于ABTS法測(cè)漆酶活力的二倍即2290U/g)。固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的125倍，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶的體積和重量的199倍。
權(quán)利要求
1.一種將液態(tài)漆酶制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶的方法，其特點(diǎn)是以2010年9月 15日保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp. SYBC-L3高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株為生產(chǎn)出發(fā)菌株，將各種不同成分的培養(yǎng)基和各種方法生產(chǎn)的液態(tài)漆酶粗酶液制備成高濃度固態(tài)漆酶，其中包括(1)以豆粕或硝酸鈉為氮源，以麥芽糖或葡萄糖或果糖或纖維二糖等為碳源發(fā)酵生產(chǎn)制備的液態(tài)漆酶。(2)以馬鈴薯為主要原料發(fā)酵高產(chǎn)制備的液態(tài)漆酶。(3)以水稻秸稈為原料固態(tài)發(fā)酵制備的液態(tài)漆酶。
2.一種將液態(tài)漆酶制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶的方法，使用的主要設(shè)備是超濾機(jī)——選用分子量為1萬(wàn)-10萬(wàn)規(guī)格的超濾膜和噴霧干燥機(jī)——進(jìn)風(fēng)溫度150°C至200°C、 出風(fēng)溫度70°C至90°C，將液態(tài)漆酶制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶，其工藝、條件和作用為(1)先將發(fā)酵生產(chǎn)制備出的漆酶發(fā)酵液，用抽濾或壓濾或離心的方法，除去菌體、較大的懸浮物和顆粒，得到漆酶粗酶液，由于菌體是藥用真菌，蛋白質(zhì)含量高且產(chǎn)漆酶，故收集的菌體起碼可作飼料或生物肥料。(2)將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液，直接用噴霧干燥設(shè)備按進(jìn)風(fēng)溫度 150°C至200°C、出風(fēng)溫度70°C至90°C的條件噴霧干燥成固態(tài)漆酶，固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的50倍以上，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶體積和重量的100倍以上。(3)用超濾設(shè)備——選用分子量為1萬(wàn)-10萬(wàn)規(guī)格的超濾膜將除去菌體、較大的懸浮物和顆粒的粗酶液超濾純化并濃縮5-20倍，具體為先選用1萬(wàn)分子量的超濾膜，超濾除去分子量在1萬(wàn)以下的小分子物質(zhì)，然后用10萬(wàn)分子量的超濾膜，超濾收集分子量在1-10萬(wàn)的液體，因?yàn)槲覀冎苽涞钠崦傅姆肿恿考s為5. 8萬(wàn)，得到純化并濃縮了 5-20酶液。(4)用噴霧干燥機(jī)設(shè)備，選用進(jìn)風(fēng)溫度150°C-200°C、出風(fēng)溫度70°C _90°C的條件將經(jīng)超濾純化濃縮了 5-20倍的漆酶液噴霧干燥制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶，固態(tài)漆酶的每克酶活是發(fā)酵粗酶液每毫升酶活的250倍以上，液態(tài)發(fā)酵粗酶液體積和重量是固態(tài)漆酶的體積和重量的800倍以上。
3.在選擇超濾設(shè)備和噴霧干燥機(jī)設(shè)備的使用條件時(shí)，要按下列原則(1)超濾設(shè)備具體選用何種規(guī)格和分子量的超濾膜對(duì)粗酶液進(jìn)行濃縮和純化，需根據(jù)發(fā)酵制備的漆酶的分子量大小和對(duì)純度的要求來(lái)決定，因?yàn)槠崦傅姆肿恿繌膸兹f(wàn)到幾十萬(wàn)不等。(2)噴霧干燥機(jī)設(shè)備具體選用進(jìn)風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度時(shí)，需根據(jù)液態(tài)酶液所含物質(zhì)的濃度和酶對(duì)溫度的耐熱性來(lái)決定，一般來(lái)說(shuō)酶耐熱性好，進(jìn)風(fēng)溫度可高些；進(jìn)風(fēng)溫度與出風(fēng)溫度溫差越大、液態(tài)酶液所含物質(zhì)的濃度越大，則干燥成固態(tài)酶的速度越快。
全文摘要
一種將液態(tài)漆酶制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶的方法，提供了一種將微生物發(fā)酵生產(chǎn)的液態(tài)漆酶粗酶液制備成高濃度高純度固態(tài)漆酶的方法，該發(fā)明的特點(diǎn)是以2010年9月15日保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC M 2010235的Pycnoporus sp.SYBC-L3高產(chǎn)漆酶的密孔菌屬菌株為生產(chǎn)出發(fā)菌株，將各種不同成分培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)的粗酶液用超濾設(shè)備——分子量為1萬(wàn)-10萬(wàn)規(guī)格的超濾膜純化濃縮和用噴霧干燥設(shè)備——進(jìn)風(fēng)溫度150℃至200℃、出風(fēng)溫度70℃至90℃將液態(tài)酶噴霧干燥制備成高濃度高純度的固態(tài)漆酶，用DMP法測(cè)酶活并比較固態(tài)漆酶與液態(tài)粗酶液的酶活和體積，該發(fā)明將為生物技術(shù)類產(chǎn)品的純化濃縮制備所借鑒使用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102559621SQ20121000791
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月12日
發(fā)明者廖祥儒, 張峰, 張明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)