專利名稱：一種新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)液及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，也是研究神經(jīng)系統(tǒng)生理、病理機制及各種神經(jīng)遞質(zhì)功能的良好材料。海馬組織中神經(jīng)元數(shù)量和分布較為集中，海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)是研究神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能以及病理、生理變化的重要手段之一。現(xiàn)有的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液中基本都是在DMEM、F12培養(yǎng)基添加血清，培養(yǎng)海馬神經(jīng)元。血清增加了膠質(zhì)細胞等非神經(jīng)元增殖速度，影響了海馬神經(jīng)元的純度，對神經(jīng)細胞有不同程度的毒性，且由于血清中成分復雜，對實驗產(chǎn)生一定的影響或干擾。神經(jīng)元培養(yǎng)的一個重要問題是保證神經(jīng)元的純度與活性。中國專利CN1966674A公開了一種蜘蛛中樞神經(jīng)細胞培養(yǎng)液，該發(fā)明所采用的培養(yǎng)液添加了 200ml小牛血清；中國專利CN1171991C公開了 “人神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)方法”，該發(fā)明培養(yǎng)液由DMEM和F12以1 1混合而成的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加胰島素、L-谷氨酰胺、鹽酸丁二胺、硒化鈉、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、氫化可的松、黃體酮，另外添加5-20%新鮮血清；因此，以上神經(jīng)培養(yǎng)液的配方和方法同樣存在不能有效減少了膠質(zhì)細胞的生長，保證神經(jīng)元純度的問題。培養(yǎng)液中即使添加了阿糖胞苷等抑制膠質(zhì)細胞分裂的藥物能提高神經(jīng)細胞的純度，但是，阿糖胞苷的加入對神經(jīng)細胞生長也有一定的抑制作用，嚴重影響所培養(yǎng)的神經(jīng)元活性。盡管無血清培養(yǎng)出現(xiàn)，提高了神經(jīng)元培養(yǎng)的純度，減少了膠質(zhì)細胞的生長，但是所培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元仍然具有存活率低、細胞生長緩慢和突觸形成少等缺點，不能滿足對細胞進一步實驗的要求。目前無血清培養(yǎng)液的添加物都含有Mvitrogen(GIBCO)公司研發(fā)的神經(jīng)元培養(yǎng)液B27或(和)N2，其主要成分為多種維生素和微量元素。盡管提高了神經(jīng)細胞培養(yǎng)的純度，有效減少了膠質(zhì)細胞的生長，但是仍然存在不能為海馬神經(jīng)元培養(yǎng)提供足夠的能量，在缺氧環(huán)境下尤為明顯，更容易導致致死性損害，影響了海馬神經(jīng)元的生長狀態(tài)，從而造成細胞存活率低、細胞生長緩慢和突觸形成少等問題。通過增加葡萄糖劑量的方法，結(jié)果會更糟糕，葡萄糖作為能源物質(zhì)在無氧酵解產(chǎn)生大量乳酸堆積，也會降低培養(yǎng)液的 PH值，增加滲透壓，損害神經(jīng)細胞，造成培養(yǎng)基中神經(jīng)細胞生長抑制，同時也增加了神經(jīng)細胞污染的機會。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有純度高、生長狀態(tài)好的海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)液及其制備方法，并提供了利用這種培養(yǎng)液培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是，一種海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液為在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入1、6 二磷酸果糖、果糖和營養(yǎng)添加劑；每升基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入I-IOmmol的1、6 二磷酸果糖和2-20mmol的果糖，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為Neurobasal Medium。所述1、6 二磷酸果糖與果糖質(zhì)量濃度比為1 2。每升基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入如下組分的營養(yǎng)添加劑10-20 μ g堿性成纖維細胞生長因子，6-15mg ATP，30-50U輔酶A，0. I-Ig 兩性霉素B，5-50mg胰島素，0. 42-0. 83mg硫酸亞鐵，5_50mg人轉(zhuǎn)鐵蛋白和20_60mg維生素混合液。維生素混合液為生物素、氯化膽堿、泛酸鈣、葉酸、肌醇、維生素Bi、維生素B2、維生素B6、維生素B12和煙酰胺的混合物。其中，本發(fā)明所述的商品化基礎(chǔ)培養(yǎng)液Neurobasal Medium(GIBC0公司)。之后采用0. 22 μ m的濾膜過濾除菌。配置好的培養(yǎng)液置于4°C儲存。本發(fā)明的培養(yǎng)液中1，6_ 二磷酸果糖是能在分子水平上調(diào)節(jié)細胞代謝中若干酶活性，恢復和改善細胞代謝，減輕細胞損傷，能促進血液循環(huán)，增加ATP合成。果糖作為體外培養(yǎng)的能量成分明顯優(yōu)于葡萄糖，果糖酵解與葡萄糖酵解的主要區(qū)別在于在果糖酵解過程中，果糖氧化磷酸化為F-I-Pd-磷酸果糖)——糖酵解前體物質(zhì)，能在缺氧狀態(tài)下提供 ATP，維持細胞膜的離子泵，所以能有效的保護細胞膜的完整性和維持細胞活性的功能。而葡萄糖代謝過程中卻不能產(chǎn)生F-1-P。本發(fā)明添加1，6_二磷酸果糖和果糖的混合物有較好的效果，1，6-二磷酸果糖和果糖有顯著的協(xié)同作用，可以顯著增加增加海馬神經(jīng)元的活力， 尤其在缺氧狀態(tài)下照常提供ATP細胞，保證神經(jīng)元的純度與活性。所述本發(fā)明的培養(yǎng)液中營養(yǎng)添加劑包括堿性成纖維細胞生長因子，胰島素、硫酸亞鐵、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、ATP、輔酶A、兩性霉素B和維生素混合液。本發(fā)明中提供的動物細胞無血清低密度培養(yǎng)基中胰島素是重要的血清替代成分。 胰島素可促進糖元與脂肪酸的合成，同時促進RNA、蛋白質(zhì)和脂類的合成。胰島素可以為重組胰島素、牛源胰島素或人源胰島素，胰島素類因子也可以使用。本發(fā)明中使用的硫酸亞鐵為培養(yǎng)基提供細胞生長所需的亞鐵離子，同時可以作為轉(zhuǎn)鐵蛋白的替代成分。本發(fā)明中使用的轉(zhuǎn)鐵蛋白主要是細胞獲取微量元素的主要渠道，同時具有促進胰島素發(fā)揮作用的功能。在該發(fā)明使用的轉(zhuǎn)鐵蛋白可以是重組的、人源的或牛源的等，另外檸檬酸鐵也可以起到同樣的作用。本發(fā)明中使用的維生素為細胞的生長代謝提供必要的維生素，促進細胞生長和延長細胞活性，提供營養(yǎng)物質(zhì)的同時降低代謝產(chǎn)物的堆積。本發(fā)明所使用的維生素是無菌包裝的維生素混合液。使用濃度參考說市售的產(chǎn)品明書推薦濃度，采用相應培養(yǎng)基稀釋即可。ATP作為能量物質(zhì)，在分解時放出大量的能量，可以為細胞培養(yǎng)的各個過程都提供充足的能量，改善和提高細胞酶的代謝功能，促進細胞的擴增和傳代。輔酶A能夠促進三羧酸的循環(huán)，為細胞的擴增與傳代提供能量。兩性霉素B的使用濃度在0. 1-lg/L。本發(fā)明還提供了一種原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的方法，具有以下步驟①制備如權(quán)利要求1-5之一所述的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液；②取材、消化新生大鼠斷頭取腦，在冰上鈍性撥離出腦組織，去除血管膜，完整取出海馬組織；剪碎成約lmm3的小塊，加入約與組織等體積的濃度為2-%ig/mL的木瓜酶，混勻，37°C消化5-15min。用含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，并加入10 μ IDNase I打開絮狀黏連，吸管輕輕吹打組織塊分散細胞。③制備單細胞懸液將步驟②細胞懸液經(jīng)400目尼龍網(wǎng)過濾，lOOOr/min離心 IOmin去上清，加10%胎牛血清的DMEM/F12重懸，調(diào)細胞密度為1 5 X 105個細胞/mL濃度的單細胞懸液；
④接種、培養(yǎng)將步驟③制備的單細胞懸液加入多聚L-賴氨酸的培養(yǎng)板中，置于 37°C,5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24h后將原來含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基更改為步驟①制 備的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，每隔2d換液1次，每次更換一半培養(yǎng)液。本發(fā)明所能達到的有益效果如下(1)利用本發(fā)明的培養(yǎng)液進行海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)，獲得了相對單一、純度高(純 度彡90%以上)的海馬神經(jīng)元。這就是由于1，6-二磷酸果糖和果糖為海馬神經(jīng)元培養(yǎng)提 供的足夠的能量，促進了海馬神經(jīng)元的活性；(2)利用本發(fā)明的培養(yǎng)液進行海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)，有效地提高了神經(jīng)元的存活 率，且神經(jīng)元的生長狀態(tài)良好、生理特性穩(wěn)定，表明本培養(yǎng)方法可以滿足體外實驗的要求；(3)利用本發(fā)明的培養(yǎng)液進行海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，體外培 養(yǎng)的海馬神經(jīng)元存活的時間大大得到延長(高純度、高活性的海馬神經(jīng)元細胞可以維持16 天以上)；(4)本發(fā)明的培養(yǎng)液海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液配制方法簡單，可重復性強，操作簡便易 行。
具體實施例方式實施例1海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液的配方及制備方法按照下表中的配方配置培養(yǎng)液1-9
培養(yǎng)液1、6 二果糖ATP堿性成輔酶兩性胰島硫酸人轉(zhuǎn)鐵維生素 類型 磷酸果(mmol) (m ) ^^ A(U) J素素 亞鐵蛋白混合液 糖因子(g) (mg) (mg) (mg) ( mg
(mmol)(Wg))
j咅養(yǎng)液 1 35 7 10 35 0 15 0 5 16 8
培養(yǎng)液 2 13 6 16 30 Ol 5 045 56
培養(yǎng)液 3 10 20 15 17 50 ì 50 083 50 15~ 培養(yǎng)液 4 510 8 19 40 0 30 061 27 10~
培養(yǎng)液 5 12 7 12 32 02 6 042 57
培養(yǎng)液 6 813 10 15 38 08 40 0 7 36 9
培養(yǎng)液 7 28 9 20 44 0 10 051 12 10~上述培養(yǎng)液1-7的制備方法如下a.按所述配比取1、6二磷酸果糖、果糖加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液Neurobasal Medium中，充 分攪拌均勻；b.加入上述量的堿性成纖維細胞生長因子、胰島素、硫酸亞鐵、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、兩性 霉素B、維生素混合液；c.以1-10當量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH 7. 4-8. O ；d.層流細胞培養(yǎng)室抽濾消毒，4°C儲存?zhèn)溆?，使用前再加入所述量的ATP以及輔酶A。實施例2原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的方法具有以下步驟①制備如實施例1所述的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液；②取材、消化新生大鼠斷頭取腦，在冰上鈍性撥離出腦組織，去除血管膜，完整取出海馬組織；剪碎成約lmm3的小塊，加入約與組織等體積的濃度為2-%ig/mL的木瓜酶，混勻，37°C消化5-15min。用含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，并加入10 μ IDNase I打開絮狀黏連，吸管輕輕吹打組織塊分散細胞。③制備單細胞懸液將步驟②細胞懸液經(jīng)400目尼龍網(wǎng)過濾，lOOOr/min離心 IOmin去上清，加10%胎牛血清的DMEM/F12重懸，調(diào)細胞密度為1 5 X 105個細胞/mL濃度的單細胞懸液；④接種、培養(yǎng)將步驟③制備的單細胞懸液加入多聚L-賴氨酸的培養(yǎng)板中，置于 37°C,5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24h后將原來含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基更改為步驟①制備的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，每隔2d換液1次，每次更換一半培養(yǎng)液。實施例3原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)學觀察和功能試驗在倒置顯微鏡下觀察，大鼠海馬神經(jīng)細胞接種6 他開始貼壁，單個分散，呈圓形。24h后基本完全貼壁，細胞開始變扁平，并開始長出1 2個突起。3d后，神經(jīng)元數(shù)量進一步增多，突起進一步增長，而神經(jīng)膠質(zhì)細胞也開始迅速分裂增殖，神經(jīng)元下形成一片支持層。IOd神經(jīng)元狀態(tài)良好，神經(jīng)元突觸發(fā)育成熟，形成明顯的神經(jīng)網(wǎng)絡。培養(yǎng)至14d，雖然細胞數(shù)目有所減少，細胞卻達到最佳的狀態(tài)，胞體周圍有明顯的光暈，且細胞最飽滿。培養(yǎng) 17d,隨著培養(yǎng)時間的進一步延長，細胞開始出現(xiàn)退化、脫落。DMEM/F12+20%小牛血清組和 Neurobasal medium+2% B27組出現(xiàn)神經(jīng)細胞的死亡，可見凋亡小體。DMEM/F12+20%小牛血清實驗組培養(yǎng)至Md，神經(jīng)細胞全部死亡、退化，可見變性的神經(jīng)細胞殘跡。本發(fā)明實驗組神經(jīng)元胞體飽滿，核大，突起明顯增長，連接密集，形成復雜的神經(jīng)纖維網(wǎng)絡，陽性細胞(純度)彡90%。顯著高于DMEM/F12+20%小牛血清組和Neurobasal Medium+2% B27 組；DMEM/F12+20%小牛血清組和 Neurobasal Medium+2% B27 組細胞數(shù)量相對較少，極少數(shù)細胞長出突起。用圖像分析儀分析，結(jié)果見表1-4。本發(fā)明組神經(jīng)細胞胞體面積、長徑、短徑均顯著高于DMEM/F12+20%小牛血清組和Neurobasal Medium+2% B27 組(ρ < 0. 01)，表明本發(fā)明組對神經(jīng)細胞生長發(fā)育有促進作用。表1培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的細胞活力
權(quán)利要求
1.一種新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，其特征在于該培養(yǎng)液為在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入1、6 二磷酸果糖、果糖和營養(yǎng)添加劑；其中，每升基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入I-IOmmol的 1、6 二磷酸果糖、2-20mmol的果糖，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為Neurobasal Medium。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，其特征在于，所述 1、6 二磷酸果糖與果糖質(zhì)量濃度比為1:2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，其特征在于每升基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入如下組分的營養(yǎng)添加劑10-20 μ g堿性成纖維細胞生長因子，6-15mg ATP, 30-50U輔酶A，0. I-Ig兩性霉素B，5_50mg胰島素，0. 42-0. 83mg硫酸亞鐵，5_50mg人轉(zhuǎn)鐵蛋白和20-60mg維生素混合液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，其特征在于，維生素混合液為生物素、氯化膽堿、泛酸鈣、葉酸、肌醇、維生素Bi、維生素B2、維生素B6、維生素B12和煙酰胺的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，其特征在于，所述每升基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，維生素混合液由如下含量的各組分構(gòu)成，生物素 0. 001-0. 01mg/L 氯化膽堿 5-20mg/L 泛酸鈣 2-10mg/L 葉酸0-5 mg/L肌醇5-20 mg/L維生素 Bl 2-10 mg/L 維生素 B2 0. 1-0. 5mg/L 維生素 B6 2-10mg/L 維生素 B12 0. 2-1. O mg/L 煙酰胺 2-5 mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟，A 按所述配比取1、6 二磷酸果糖、果糖加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液Neurobasal Medium中，充分攪拌均勻；B 在上述溶液中加入營養(yǎng)添加劑； C 以1-10當量濃度的氫氧化鈉調(diào)pH 7. 4-8. O ； D 層流細胞培養(yǎng)室抽濾消毒，4°C儲存?zhèn)溆茫?E 最后加入所述量的ATP和輔酶A。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，每升基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入如下組分的營養(yǎng)添加劑10-20 μ g堿性成纖維細胞生長因子，6-15mg ATP，30-50U 輔酶 A，0. I-Ig 兩性霉素 B, 5_50mg 胰島素，0. 42-0. 83mg 硫酸亞鐵， 5-50mg人轉(zhuǎn)鐵蛋白和20-60mg維生素混合液。
8.新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的方法，其特征在于具有以下步驟①制備如權(quán)利要求1-5之一所述的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液；②取材、消化新生大鼠斷頭取腦，在冰上鈍性撥離出腦組織，去除血管膜，完整取出海馬組織；剪碎成約lmm3的小塊，加入約與組織等體積的濃度為2-4 mg/mL的木瓜酶，混勻， 37°〇消化5-1511^11，用含10%胎牛血清01^11/^12培養(yǎng)基終止消化，并加入1(^1 DNase I打開絮狀黏連，吸管輕輕吹打組織塊分散細胞；③制備單細胞懸液將步驟②細胞懸液經(jīng)400目尼龍網(wǎng)過濾，1000r/min離心IOmin去上清，加10%胎牛血清的DMEM/F12重懸，調(diào)細胞密度為1 5 X 105個細胞/mL濃度的單細胞懸液；④接種、培養(yǎng)將步驟③制備的單細胞懸液加入多聚L-賴氨酸的培養(yǎng)板中，置于37°C、 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)；24h后將原來含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基更改為步驟①制備的海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液，每隔2d換液1次，每次更換一半培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)的培養(yǎng)液及原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元的方法，該培養(yǎng)液是在基礎(chǔ)培養(yǎng)液Neurobasalmedium中加入1、6二磷酸果糖、果糖和營養(yǎng)添加劑。原代培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元具有以下步驟①制備海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液；②取材、消化；③制備單細胞懸液；④接種、培養(yǎng)。本發(fā)明原代培養(yǎng)大鼠培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的方法簡便，采用本發(fā)明培養(yǎng)液能夠獲得生長狀態(tài)良好、純度較高的海馬神經(jīng)元，具有重要的應用價值和經(jīng)濟價值。
文檔編號C12N5/0793GK102533654SQ201210023408
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月2日
發(fā)明者孫晶 申請人:溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院