專利名稱：利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域，更具體的涉及利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，它適用于山羊同一組織細(xì)胞在不同發(fā)育時(shí)期、不同生理?xiàng)l件下microRNA介導(dǎo)的靶基因的差異篩選，或者不同組織細(xì)胞在相同的發(fā)育時(shí)期microRNA介導(dǎo)的靶基因比較研究。
背景技術(shù)：
microRNA是大約18_24bp的小的非編碼RNA，它在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)。是1993年首次發(fā)現(xiàn)的一類在動(dòng)植物中發(fā)揮重要作用的基因表達(dá)調(diào)控因子。它們通過依賴于microRNA和靶基因互補(bǔ)性的降解或者抑制翻譯的兩種不同機(jī)制負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)水平。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物中，microRNA通過5’末端第2 8bp的序列互補(bǔ)配對(duì)祀基因mRNA,在翻譯水平負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)，5’末端的這2 Sbp的序列稱為種子序列，它在各個(gè)物種中都是高度保守的，并且通過與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)介導(dǎo)基因的表達(dá)調(diào)控。許多研究表明正是microRNA 2 8bp種子序列的突變或者與之完全互補(bǔ)配對(duì)靶mRNA —個(gè)或者幾個(gè)堿基的突變導(dǎo)致mi croRNA功能缺失，進(jìn)而弓I起生理狀態(tài)的改變。mi croRNA與靶基因組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，一個(gè)microRNA可以與多個(gè)祀基因相互作用，多個(gè)microRNA也可能作用于同一個(gè)革巴基因，另外microRNA及其靶基因不同時(shí)期、不同生理?xiàng)l件、不同組織其表達(dá)量均存在差異。因此，如何準(zhǔn)確定位、分析microRNA靶基因成為許多科學(xué)家關(guān)注的問題。靶基因挖掘方法主要有兩大類計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)和基于雜交的基因芯片。其中，計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)雖然快速、簡(jiǎn)單，但這種主要基于microRNA種子序列與其靶基因之間堿基互補(bǔ)配對(duì)的最小自由能的計(jì)算機(jī)方法，由于短小序列的存在，容易出現(xiàn)假陽性，需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，且以表達(dá)譜數(shù)據(jù)已知為背景；基因芯片是基于雜交策略的主流技術(shù)，自發(fā)明以來，它一直在基因表達(dá)譜技術(shù)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。該技術(shù)利用過表達(dá)microRNA的樣本及其對(duì)照的mRNA池與固定在芯片上的數(shù)以萬計(jì)根據(jù)已知基因序列設(shè)計(jì)的探針雜交，以高通量的方式確定mRNA的種類和豐度，從而推測(cè)microRNA的靶基因。雖然該技術(shù)獲得了廣泛的應(yīng)用，但是價(jià)格昂貴、需要大量的RNA，且存在數(shù)據(jù)處理過程噪音難以確定、探針與相似轉(zhuǎn)錄本間交叉雜交等問題。此外，由于要設(shè)計(jì)探針，它和計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)一樣需要參考基因組序列信息。因此，為了研究山羊組織或者器官的HiiCT0RNA靶基因的情況，也為其它物種提供一種研究與某個(gè)microRNA相關(guān)的靶基因的分子方法，我們?cè)趍iRBase已有數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，搜尋獲得microRNA種子序列互補(bǔ)配對(duì)的序列,利用真核生物mRNA帶有polyA尾巴的特點(diǎn)，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，加入帶有特殊接頭的反轉(zhuǎn)錄引物，合成第一鏈cDNA，然后，通過特異設(shè)計(jì)的兩步PCR反應(yīng)，富集與microRNA相互作用的所有靶基因，將其特異性擴(kuò)增獲得可以用常規(guī)凝膠檢測(cè)到的核苷酸序列，并輔以PAGE技術(shù)，定位、分析與某個(gè)特異microRNA序列相互作用的靶基因。、發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)驗(yàn)性的、簡(jiǎn)便快速的、高特異性的獲取哺乳動(dòng)物組織或器官miCToRNA靶基因的分子方法。包括以下步驟I)特異反轉(zhuǎn)錄引物的設(shè)計(jì)所述反轉(zhuǎn)錄引物包括錨定堿基VN (N代表A、T、C或者G ；V代表堿基A、G或C)、12個(gè)T、寡核苷酸CTGA(3’到5’端)以及特殊接頭SEQ ID NO. 2。錨定堿基VN、12個(gè)T的寡聚核苷酸保證了 cDNA的從頭合成，SEQ ID NO. 2的引入有利于特異兩步PCR的設(shè)計(jì)。通過反轉(zhuǎn)錄引物將樣本所有mRNA反轉(zhuǎn)錄成帶有特殊接頭SEQ ID NO. 2的cDNA。2)特異兩步PCR反應(yīng)所述特異兩步PCR反應(yīng)的引物由根據(jù)miRBasel6. 0數(shù)據(jù)庫提供的與某個(gè)microRNA種子序列相互配對(duì)的核苷酸序列與特殊接頭SEQ ID NO. I的上游引物，和待擴(kuò)增cDNA上帶有的特殊接頭SEQ ID NO. 2的下游引物組成。為保證特異性，這兩個(gè)特殊接頭序列SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 2在動(dòng)物基因組中或轉(zhuǎn)錄組中是不存在的。其中為了獲得與某個(gè)microRNA相互作用的所有靶基因部份序列。第一步PCR過程中，我們利用哺乳動(dòng)物microRNA 5’末端第2 8個(gè)堿基與其靶基因mRNA互補(bǔ)配對(duì)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了特殊的上游引物，利用PCR反應(yīng)過程中，低溫條件下，引物3’末端幾個(gè)堿基必然精確地與模板分子結(jié)合的原理，非特異性的富集了某個(gè)特異microRNA相互作用的靶基因，反應(yīng)程序94°C預(yù)變性5分鐘；94°C，40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5個(gè)循環(huán)；第二步PCR過程中，依據(jù)上下游退火溫度的一致性，通過提高退火溫度特異性的擴(kuò)增某個(gè)microRNA相互作用的靶基因片段，反應(yīng)程序94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32個(gè)循環(huán)；72°C，10分鐘。其中，山羊組織microRNA靶基因挖掘流程如附圖I所示(I)microRNA是長(zhǎng)度為18 24bp的非編碼的小RNA，它參與包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化等許多的生物學(xué)過程，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)。哺乳動(dòng)物中，其作用方式是5’端第2 8個(gè)堿基的種子序列通過與多個(gè)靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)以抑制靶基因的翻譯。(2)真核生物的mRNA具有5’端帽子和3’端polyA尾巴的特點(diǎn)。利用這種特點(diǎn)，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，加入特殊接頭SEQ ID NO. 2的反轉(zhuǎn)錄引物組合，就能合成帶有特殊接頭 SEQ ID NO. 2 的 cDNA。(3)沿著箭頭延伸的方向，以mRNA為模板、在反轉(zhuǎn)錄酶5’到3’聚合酶的活性作用下，從5’向3’合成mRNA與cDNA的雜合雙鏈。(4)合成的雜合雙鏈在反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH的作用下，降解雜合雙鏈的mRNA，合成比較穩(wěn)定的第一鏈cDNA。(5)加入包含特殊接頭SEQ ID NO. I以及某個(gè)microRNA種子序列互補(bǔ)序列的引物組合，利用DNA聚合酶，退火溫度為低溫條件下，非特異性的合成與某個(gè)microRNA種子序列互補(bǔ)配對(duì)的全部的cDNA。(6)合成得到包含特殊接頭SEQ ID NO. I以及某個(gè)microRNA種子序列互補(bǔ)序列、特殊接頭SEQ ID NO. 2、12個(gè)堿基T以及錨定堿基NV，目的靶基因片段的特異DNA序列。(7)加入特殊接頭SEQ ID NO. I以及某個(gè)microRNA種子序列互補(bǔ)序列的上游引物組合，以及特殊接頭SEQ ID NO. 2的下游引物，利用DNA聚合酶的作用，在退火溫度為高溫的條件，特異的擴(kuò)增目的靶基因片段。(8)通過多個(gè)PCR循環(huán)反應(yīng)，合成得到可以通過常規(guī)手段檢測(cè)到的多個(gè)目的靶基因片段，用于后面的分離、克隆、測(cè)序。(9) PCR產(chǎn)物通過PAGE檢測(cè)和銀染顯色。3) PAGE凝膠及半定量分析PCR產(chǎn)物經(jīng)過10% PAGE凝膠，120 140V電壓，7 8小時(shí)電泳后，銀(硝酸銀)染顯色，借助凝膠輔助分析工具(如genetool),半定量分析某個(gè)特異microRNA介導(dǎo)的革巴基因表達(dá)情況。每個(gè)泳道對(duì)應(yīng)的條帶可被切下并加以回收，利用原引物條件重?cái)U(kuò)增，克隆測(cè)序供進(jìn)一步分析，反應(yīng)程序94°C，5分鐘；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32個(gè)循環(huán)；72°C，10分鐘。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離擴(kuò)增的靶基因，并利用凝膠輔助分析工具檢測(cè)片段的大小和表達(dá)豐度，利用microRNA與靶基因相互作用的特點(diǎn)，輔以PAGE和凝膠分析工具，可視化不同時(shí)期、不同生理狀態(tài)下基因水平表達(dá)差異，檢測(cè)各個(gè)泳道片段的大小和表達(dá)豐度，作為區(qū)分不同樣本的標(biāo)志。山羊的基因組測(cè)序至今尚未完成，我們采用該方法對(duì)山羊組織樣本的microRNA靶基因進(jìn)行了檢測(cè)，獲得了與某個(gè)microRNA種子序列相互作用的靶基因核苷酸序列。本發(fā)明提供一種利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于包括以下步驟(I)合成反轉(zhuǎn)錄引物；(2)合成包含不同接頭序列的上、下游PCR引物；(3)消化去除基因組污染，對(duì)樣品總RNA的提?。?4)采用步驟(I)的反轉(zhuǎn)錄引物將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ；(5)采用步驟⑵上下游PCR引物，兩步PCR法獲得某一 microRNA的靶基因序列；(6) PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)其片段大小和表達(dá)豐度；(7)切取靶基因條帶，重?cái)U(kuò)增、回收、克隆、測(cè)序。其中，兩條接頭序列在山羊基因組中或轉(zhuǎn)錄組中不存在，在其中一個(gè)具體的實(shí)施方式中，接頭序列分別具有SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；在更加具體的實(shí)施方式中，接頭序列就是SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(I)所設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄引物為接頭SEQ ID NO. 2,4個(gè)動(dòng)態(tài)堿基、12個(gè)T以及錨定堿基N(N代表A、T、C或者G)V(V代表堿基A、G或C)的組合，具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(3)采用DNaseI消除基因組DNA污染。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(4)以純化的組織總RNA為模板，以SEQ ID NO. 3所示序列為反轉(zhuǎn)錄引物，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成帶有SEQ ID NO. 3的cDNA ;反轉(zhuǎn)錄體系如下總 RNA 4iil，反轉(zhuǎn)錄酶 0. 5iil，反應(yīng)緩沖液 2iil，SEQ ID NO. 30. 5 U I (50 u M),RNase-free ddH203 u I ;反應(yīng)條件37°C, 15 分鐘；85°C，5 秒。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(5)特異兩步PCR上游引物的結(jié)構(gòu)特征為接頭 SEQ ID NO. I與microRNA種子序列互補(bǔ)序列的組合,具有SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列；下游引物具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。在更加具體的實(shí)施方式中，步驟(5)PCR 擴(kuò)增分兩步進(jìn)行，第一步 PCR 反應(yīng)體系cDNA I iil，SEQ ID NO. 43 u I(IOuM), masterMix(TaKaRa) 12. 5 u 1，ddH20 7. 5 u I ;反應(yīng)條件94°C 預(yù)變性 5 分鐘；94°C,40 秒，37°C，30秒，72°C，1分30秒，5個(gè)循環(huán)；第二步PCR反應(yīng)體系在第一步PCR產(chǎn)物中加入SEQ IDNO. 21 u KlOu M);反應(yīng)條件94°C 預(yù)變性 5 分鐘；94°C，40 秒，60. 5°C，30 秒，72。。，I 分 30秒，32個(gè)循環(huán)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(6)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離擴(kuò)增的靶基因，并利用凝膠輔助分析工具檢測(cè)片段的大小和表達(dá)豐度，利用microRNA與靶基因相互作用的特點(diǎn)，輔以PAGE和凝膠分析工具，可視化不同時(shí)期、不同生理狀態(tài)下基因水平表達(dá)差異，檢測(cè)各個(gè)泳道片段的大小和表達(dá)豐度，作為區(qū)分不同樣本的標(biāo)志。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，步驟(7)切取的靶基因條帶重?cái)U(kuò)增的條件為94°C預(yù)變性5分鐘-MV, 40秒，60. 5 °C, 30秒，72。。，I分30秒，共計(jì)32個(gè)循環(huán)。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果I、適用范圍廣。本發(fā)明適用于基因組序列已知和未知的所有哺乳動(dòng)物，適用于microRNA介導(dǎo)的已知轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)和未知轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)；本方法發(fā)明適用于任何普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用。2、性價(jià)比高。本發(fā)明利用常規(guī)儀器和試劑去探索microRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)情況，成本低廉，實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想。3、覆蓋率高，冗余少。本發(fā)明利用poly(T/A)置換法將其置換成人工接頭序列，確保了帶polyA尾mRNA 100%的覆蓋率。另一端(上游引物)種子序列互補(bǔ)序列加特殊接頭的組合，既保證了 microRNA作用的所有靶基因的獲取，又增加了特異性。以上概括的描述了本發(fā)明，可通過參照本文提供的某些具體實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明，需要指出的是，這些實(shí)施例僅是為了說明而不是限制本發(fā)明。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步的說明。圖I :山羊組織microRNA靶基因挖掘流程圖。圖2 :某生理狀態(tài)山羊皮膚樣品總RNA1. 0%瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果圖。3代表第3種生理狀態(tài)，M 為 Marker DL2000。圖3 :某生理狀態(tài)山羊皮膚樣品mir-203靶基因擴(kuò)增結(jié)果(a) I. 0%瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果，3代表第3種生理狀態(tài)，M為marker DL2000 ； (b) 10% PAGE檢測(cè)結(jié)果，3代表第3種生理狀態(tài)，M 為 Marker DL1000。圖4 :第3種生理狀態(tài)山羊皮膚樣品mir-203靶基因重?cái)U(kuò)增結(jié)果。1、2、3、4、5表示從圖3(b)中切取大小為382bp、276bp、221bp、189bp、130bp片段重?cái)U(kuò)增結(jié)果，M為MarkerDLlOOO0圖5 :10種不同生理狀態(tài)總RNA1. 0%瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果圖，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分別代表不同生理狀態(tài)的總RNA，M為DL6000。.圖6 :10種不同生理狀態(tài)山羊皮膚樣品mir-203靶基因的表達(dá)圖譜(a)，I. 0%瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果；(b)，10% PAGE檢測(cè)結(jié)果。Ml為DL2000 ；M2為DL1000。圖7 :切取的不同生理狀態(tài)10% PAGE膠mir-203靶基因條帶重?cái)U(kuò)增I. 0%瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果。(a)，標(biāo)注的A-B代表不同生理狀態(tài)的第幾條帶，例如1-1代表第I種生理狀態(tài)切取的第一條帶重?cái)U(kuò)增結(jié)果，M代表Marker ; (b), 345bp特異條帶重?cái)U(kuò)增1.0%瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果。6、7、8、9、10分別代表不同生理狀態(tài)，N表示陰性對(duì)照，M為Marker DLlOOO0
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I.山羊皮膚組織mir-203靶基因挖掘模式的建立I.試驗(yàn)樣品試驗(yàn)樣品來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，采集了山羊肩胛部位第3種生理狀態(tài)的皮膚樣品。2.總RNA的提取、處理和檢測(cè)按Trizol法提取總RNA的方法提取總RNA。用無RNase的DNase-I處理總RNA，以去除其中痕量基因組DNA污染，通過普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性(圖2)，用核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度。我們研究針對(duì)mir-203這一具體microRNA所針對(duì)的祀基因的情況,設(shè)計(jì)并合成了包括錨定堿基VN (N代表A、T、C或者G ；V代表堿基A、G或C)、12個(gè)T、寡核苷酸CTGA (3’到5’端)以及特殊接頭(SEQ ID NO. 2)的反轉(zhuǎn)錄引物(SEQ ID NO. 3)，并按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》提供的反轉(zhuǎn)錄方案，在特異反轉(zhuǎn)錄引物(SEQ ID NO. 3)存在的條件下制備cDNA，-80°C保存?zhèn)溆谩?. PCR 擴(kuò)增3. I 第一步 PCR以步驟2第3種生理狀態(tài)制備的cDNA為模板，加入由特殊接頭SEQ ID NO. I以及與mir-203種子序列互補(bǔ)序列組成的上游引物SEQ ID NO. 4，富集所有與mir-203相互作用的靶基因。PCR 反應(yīng)體系為 25 ill，包括 master Mix (TaKaRa) 12. 5 ，上游引物 SEQ IDNO. 43 u KlOu M)，模板 I u 1，ddH20 7. 5 u I0反應(yīng)程序94V預(yù)變性5分鐘-MV, 40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5個(gè)循環(huán)；3. 2 第二步 PCR在第一步PCR產(chǎn)物中加入包含特殊接頭的下游引物SEQ ID NO. 21 U l(10u M)，特異性的擴(kuò)增mir-203的靶基因。反應(yīng)條件94V預(yù)變性5分鐘-MV, 40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32個(gè)循環(huán)。72°C，10分鐘。I %瓊脂糖凝膠、10 % PAGE檢測(cè)表明，mRNA為模板獲得了完全不同于DNA模板的結(jié)果，DNA模板幾乎得不到擴(kuò)增結(jié)果，mRNA模板得到了清晰的多條結(jié)果(圖3)，這在驗(yàn)證了 microRNA與其靶基因存在一對(duì)多的作用方式的同時(shí)，也說明了特殊的兩步PCR設(shè)計(jì)的合理性。4. PAGE膠回收、重?cái)U(kuò)增、克隆測(cè)序切取步驟3PAGE膠中各清晰的條帶，100°C煮沸10分鐘，取5iU上清按如下PCR
反應(yīng)重?cái)U(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為 25 iil，包括 master Mix(TaKaRa) 12. 5 yl，上下游引物各 I yl，PAGE膠回收產(chǎn)物上清液5 iil，ddH205. 5 ill。反應(yīng)程序94V預(yù)變性5分鐘-MV, 40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分鐘30秒，32個(gè)循環(huán)。72 °C，10分鐘。1%瓊脂糖檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，獲得了 120 750bp大小不同的6條帶，膠回收、克隆測(cè)序，所測(cè)序列見序列表SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 12，分別對(duì)應(yīng)圖3 (a)中大小為75化？、382& 、276& 、22化？、18% 、13(^ 的條帶。每條序列都包含我們?cè)O(shè)計(jì)的上下游引物，進(jìn)一步說明了我們方法設(shè)計(jì)的合理性。 實(shí)施例2.山羊皮膚樣品中不同時(shí)期mir-203靶基因的檢測(cè)分析利用實(shí)施例I建立的方法，借助genetool PAGE膠條帶判型工具，我們比較分析了山羊10種不同生理狀態(tài)山羊皮膚樣品(圖5)mir-203靶基因的表達(dá)圖譜(圖6)。結(jié)果表明，對(duì)于PAGE凝膠，在700bp-50bp范圍內(nèi)，不同生理狀態(tài)mir-203靶基因表達(dá)數(shù)目存在差異，10種不同生理狀態(tài)條帶數(shù)目分別為12、14、11、12、11、12、12、13、13、14。不同生理狀態(tài)之間既有共同表達(dá)的條帶，也有差異表達(dá)的條帶；以每種生理狀態(tài)下共表達(dá)的200bp左右的量為參考標(biāo)準(zhǔn)，利用genetool半定量了各個(gè)條帶相對(duì)于參考標(biāo)準(zhǔn)的相對(duì)表達(dá)量(表I)，不同生理狀態(tài)同一條帶表達(dá)量也存在差異。表110種不同生理狀態(tài)皮膚樣品mir-203靶基因的相對(duì)表達(dá)量
不同生理狀態(tài)相對(duì)表達(dá)量 條帶范圍____
(bp)1 2 3 4 5 6 7 8910
698o. 250.21 0.24 0.20 0. 190.05
6870.29
6300.08 0. 130.10
6060.28
5800.08 0.110.08 0.050.130.14
4950.07 0.060.05
453o. 20 0.220.36 0.46 0.39 0.37 0.270.050. 16
4230.03 0.070.14 0.120. 100.063850.26 0.350.24 0.23 0.24 0. 17 0.26 0.320.280.41 3490.060.090. 130. 12 293o. 190.22
2840. 14 0. 180.23 0.35 0.19 0.34 0.28 0.230.240.41
2630. 14 0.110. 14 0.22 0.31 0.13 0. 11 0.160.190.14
2250.21 0.140.26 0.27 0.27 0.30 0.21 0.250.240.25
20000 1.00I. 00 1.00 L 00 I. 00 1.00 I. 00I. 00L 00
1650.04 0. 13
1240. 15 0.360.19 0.23 0. 19 0.36 0.31 0.390.400.38
1160. 11 0.170. 16 0.17 0.22 0.27 0.10 0.230.330.24
1000.06 0. 110.08 0.04 0.14 0. 16 0.05 0. 170.160.19切取不同生理狀態(tài)下mir-203靶基因條帶，按實(shí)施實(shí)例I步驟4所述重?cái)U(kuò)增、克隆測(cè)序。重?cái)U(kuò)增部份結(jié)果I %瓊脂糖檢測(cè)如圖7所示，其片段大小主要集中在120 400bp左右；測(cè)序結(jié)果顯示序列與序列表中SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 12—致。大小分別為382bp (表I 為 385bp)、345bp (表 I 為 349bp)、276bp (表 I 為 284bp)、269bp (表 I 為 263bp)、221bp (表I 為 225bp)、189bp (表 I 為 200bp)、130bp (表 I 為 124bp)。其中 382bp、276bp、269bp、221bp、189bp、130bp為各種生理狀態(tài)共有的條帶，分別對(duì)應(yīng)圖7 (a)的A-1、A-2、A-3、A-4、A-5、A_6，八表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種生理狀態(tài)；345bp為6、8、9、10種生理狀態(tài)皮膚樣品特有的條帶(圖7(b))，這與表I結(jié)果一致。說明了本方法的穩(wěn)定性和特異性
權(quán)利要求
1.利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中micix)RNA靶基因的分子方法，其特征在于包括以下步驟 (1)合成反轉(zhuǎn)錄引物； (2)合成包含不同接頭序列的上、下游PCR引物； (3)消化去除基因組污染，對(duì)樣品總RNA的提取； (4)采用步驟(I)的反轉(zhuǎn)錄引物將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA； (5)采用步驟(2)上下游PCR引物，兩步PCR法獲得某一microRNA的靶基因序列； (6)PCR產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)其片段大小和表達(dá)豐度； (7)切取靶基因條帶，重?cái)U(kuò)增、回收、克隆、測(cè)序。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于涉及到的兩條接頭序列在山羊基因組中或轉(zhuǎn)錄組中不存在，分別具有SEQIDN0. I和SEQID NO. 2所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(I)所設(shè)計(jì)的反轉(zhuǎn)錄引物具有SEQID NO. 3所示的核苷酸序列，為接頭SEQ ID NO. 2下游緊接4個(gè)動(dòng)態(tài)堿基下游緊鏈接12個(gè)T以及錨定堿基NV的組合，其中，N代表A、T、C或者G ；V代表堿基A、G或C。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(3)中采用DNaseI消除基因組DNA污染。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(4)以純化的組織總RNA為模板，以SEQID NO. 3所示序列為反轉(zhuǎn)錄引物，在反轉(zhuǎn)錄酶作用合成帶有SEQ ID NO. 3的cDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),其特征在于反轉(zhuǎn)錄體系如下總RNA4 u I,反轉(zhuǎn)錄SI 0. 5 u 1，反應(yīng)緩沖液 2u I, SEQID NO. 30. 5 U I (50 u M)，RNase-free ddH20 3 u I ;反應(yīng)條件37°C，15 分鐘，85°C，5 秒。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(5)特異兩步PCR上游引物具有SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，結(jié)構(gòu)特征為接頭SEQID NO. I與microRNA種子序列互補(bǔ)序列的組合；下游引物具有SEQ IDNO. 2所示的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于特殊兩步PCR法上游引物為SEQ ID NO. 4 ;下游引物為SEQID NO. 2。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(5) PCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行，第一步PCR反應(yīng)體系cDNA lul, SEQ IDNO. 43 u I (IOuM), master Mix(TaKaRa) 12. 5u I, ddH20 7. 5 u I ;反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性 5分鐘；94°C，40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5個(gè)循環(huán)；第二步PCR反應(yīng)體系在第一步PCR產(chǎn)物中加入SEQ ID NO. 21 u I(IOuM);反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72。。，I分30秒S，32個(gè)循環(huán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(6)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離擴(kuò)增的靶基因，并利用凝膠輔助分析工具檢測(cè)片段的大小和表達(dá)豐度，利用microRNA與靶基因相互作用的特點(diǎn)，輔以PAGE和凝膠分析工具，可視化不同時(shí)期、不同生理狀態(tài)下基因水平表達(dá)差異，檢測(cè)各個(gè)泳道片段的大小和表達(dá)豐度，作為區(qū)分不同樣本的標(biāo)志。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步驟(7)切取的靶基因條帶重?cái)U(kuò)增的條件為94°C預(yù)變性5分鐘；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，共計(jì)32個(gè)循環(huán)。然后通過克隆、測(cè)序獲得靶基因核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用種子序列檢測(cè)山羊組織或器官中microRNA靶基因的分子方法。具體而言，提供了種子序列介導(dǎo)的可控遺傳操作，用于在基因表達(dá)檢測(cè)中篩選與特定microRNA相關(guān)的靶基因。在設(shè)定上游種子序列的互補(bǔ)序列和下游錨定序列的基礎(chǔ)上添加特殊接頭，通過反轉(zhuǎn)錄和特殊二步PCR將microRNA的靶基因擴(kuò)增；擴(kuò)增后的microRNA靶基因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中檢測(cè)其片段大小和表達(dá)豐度，用于篩選在不同生理狀態(tài)或?qū)嶒?yàn)條件下特異表達(dá)的基因；特定的靶基因序列通過DNA回收和測(cè)序方法得到。此法可用于評(píng)估m(xù)icroRNA調(diào)節(jié)的基因或遺傳途徑，也可用表達(dá)譜來評(píng)估基因表達(dá)特征，在系統(tǒng)生物學(xué)研究中具有重要價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102643898SQ20121003835
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月13日
發(fā)明者付紹印, 張文廣, 李金泉, 趙德超 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)