專利名稱：從胎盤中分離間充質(zhì)干細胞的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從胎盤中分離干細胞的方法，特別涉及從胎盤中分離間充質(zhì)干細胞的方法。
背景技術：
間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)例如人類的間充質(zhì)干細胞最早是從骨髓中分離出來的，來源于中胚層的ー類具有多向分化潛能和自我更新能力的組織干細胞，在體內(nèi)和體外特定條件下具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞、肌細胞、肝細胞等多種成體細胞分化的能力(Caplan Al. Mesenchymal stem cells. JOrthop Res. 1991,9 :641-650. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999 ;284 :143-147)。最新的研究表明間充質(zhì)干細胞具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持作用，而且易于外源基因?qū)氡磉_。因此間充質(zhì)干細胞不但是組織工程化骨、軟骨和心肌構建中的種子細胞，基因治療中重要的載體細胞，而且由于間充質(zhì)干細胞促進造血重建和抑制移植物抗宿主反應功能，在造血干細胞移植和器官移植中具有廣泛的應用前景。間充質(zhì)干細胞具有體外貼壁生長的特性，利用這種特性，人們已經(jīng)成功從肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、軟骨、皮膚、外周血等多種組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞。目前所報道的間充質(zhì)干細胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖然分離方法簡便，但供者取髓需要經(jīng)歷ー個比較痛苦的手術，并在取材過程中及取材后會有很高的感染機會；由于人體骨髓中MSC的含量極其稀少，每IO5 IO6個單個核細胞中大約只有I個，而且隨著年齡的增加，骨髄中間充質(zhì)干細胞的數(shù)量、増殖和分化能力均顯著下降，使其在研究和應用尤其是臨床應用中受到限制。起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層的胎盤是由間質(zhì)、血管及滋養(yǎng)細胞組成，含有大量的間充質(zhì)成分。最新的研究表明胎盤中含有豐富的干細胞，從胎盤中分離培養(yǎng)出這些多能干細胞將為實驗研究和臨床應用開辟ー個嶄新而豐富的來源?，F(xiàn)有的從胎盤中分離干細胞從而建立胎盤干細胞庫的方法尚有諸多缺點，例如純度不足、和/或數(shù)量不高，進而顯示出這些方法尚不能滿足人們的期待。例如CN101270349A(中國專利申請?zhí)?00810061267. 6，
公開日2008年9月24日)公開的題為“胎盤間充質(zhì)干細胞分離和體外擴增培養(yǎng)方法”的發(fā)明；CN 101693884A(中國專利申請?zhí)?00910117522. 9，
公開日2010年4月14日)公開的題為“ー種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取干細胞的方法”的發(fā)明；CN 102146359A(中國專利申請?zhí)?01110005964. 1，
公開日2011年8月10日)公開的題為“從胎盤中提取原始間充質(zhì)干細胞及無血清擴增的方法”的發(fā)明。這些方法在提取物的純度和/或回收率方面是有待進ー步改善的。
本領域仍然需要有新的從胎盤中分離干細胞的方法，特別是從胎盤中分離間充質(zhì)干細胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有獲取胎盤間充質(zhì)干細胞方法的缺陷，提供ー種實用簡單的從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細胞并任選地建立胎盤干細胞庫的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用特別的操作方法，所獲得的細胞純度高和/或細胞回收率高。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。因此，本發(fā)明第一方面提供了從胎盤中分離間充質(zhì)干細胞的方法，該方法包括以下步驟(a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消 化酶的PBS緩沖液，再在37°C孵育消化；(C)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時研磨以促使過濾；(d)將收集的過濾液離心，分離單個核細胞，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細胞，然后在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(e)待散在細胞形成克隆后，挑取各克隆細胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細胞；以及任選的下列一個或多個步驟(f)針對步驟(e)所得胎盤間充質(zhì)干細胞，檢測以下項目的至少ー項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細胞于液氮中凍存；(h)建立包含以上信息的胎盤干細胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(g)的凍存細胞進行關聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(a)是在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(a)是在產(chǎn)后四小時之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10%體積胎牛血清(FBS)的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(b)中的組織消化酶是選自下列的一種或多種dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I (DNase I)、膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶。在ー個實施方案中，所述步驟(b)中的組織消化酶包括dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I (DNaseI)、膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶。在一個實施方案中，在步驟(b)中，所述PBS緩沖液中包含約O. lmg/mLdispase、約 O. 25mg/mL 膜酶、約 O. 25mg/mL DNase I、約 lmg/mL 膠原酶 IV、和約lmg/mL透明質(zhì)酸酶。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，在37°C孵育10 30分鐘，優(yōu)選10 20分鐘，例如10分鐘、15分鐘或20分鐘。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，將胎盤小葉剪成約Icm3大小的組織塊。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(C)中，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時用注射器研磨。在一個實施方案中，在步驟(c)中，將組織塊和細胞懸液一起用160 240目(優(yōu)選200目)銅網(wǎng)過濾同時用注射器活塞研磨組織塊。
根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(d)中，所述MSC培養(yǎng)基是含10% FBS的PBS緩沖液。在本發(fā)明的任一方面的一個實施方案中，所述MSC培養(yǎng)基是含10% FBS的PBS緩沖液。在一個實施方案中，在步驟(d)中，將收集的過濾液用密度梯度離心法分離單個核細胞，洗滌，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細胞，然后在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在ー個實施方案中，在步驟(d)中，將收集過濾后的細胞懸液加入到離心管中，IOOOrpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10% FBS的PBS緩沖液重懸細胞。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(e)中，待散在細胞形成克隆后，挑取各克隆細胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細胞60 90%融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細胞。在一個實施方案中，在步驟(e)中，當散在貼壁細胞形成克隆后，用O. 05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化，傳代培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述細胞活性檢測是利用臺盼藍染色法計數(shù)凍存前后活細胞的數(shù)目。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述細胞污染檢測利用少量細胞培養(yǎng)，檢測細胞是否受到真菌和細菌的污染。在一個實施方案中，所述細胞污染檢測是利用病原學方法，檢測細胞是否受到選自下列的ー項或多項的感染こ肝兩對半、丙肝、艾滋病毒、巨細胞病毒、EB 病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-l/2Ab、CMV-IgM和 EBV-IgA、TRUST。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述遺傳病檢測是利用分子遺傳學的方法，檢測凍存細胞是否存在遺傳病。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述HLA-ABC/DR配型是檢測細胞HLA-ABC/DR 表型。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細胞是經(jīng)程序降溫過程凍存于液氮中。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細胞存在于細胞凍存液中。在一個實施方案中，該細胞凍存液包含50%低糖DMEM培養(yǎng)液、40% FBS、10%ニ甲基亞諷。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(h)中，所述數(shù)據(jù)庫中包括與所保存的細胞所有相關的數(shù)據(jù)，包括但不限干細胞的生物學特性檢測結果、多向分化潛能鑒定結果、細胞分子遺傳學診斷結果、胎兒及其父母的詳細資料。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法包括以下步驟在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。再將胎盤小葉剪成Icm3大小的組織塊，加入含有多種組織消化酶的的PBS緩沖液在37°C孵育15分鐘，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時用注射器研磨。收集過濾后的液體用密度梯度離心法分離單個核細胞，洗滌后用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細胞放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待散在細胞形成克隆后，將各克隆細胞挑出用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，細胞80 90 %融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細胞。將傳代后的細胞于液氮中凍存并記錄相關胎兒信息，并進行細胞的生物學特性及多向分化潛能鑒定，以及對細胞進行分子遺傳學診斷，保存細胞的所有相關數(shù)據(jù)，建立胎盤干細胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細胞進行關聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法包括以下步驟產(chǎn)后四小時之內(nèi)在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10%體積FBS的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成Icm3大小的組織塊,加入到含有O. lmg/mL dispase、0. 25mg/mL胰酶、O. 25mg/mL DNase I、lmg/mL膠原酶IV、lmg/mL透明質(zhì)酸酶的PBS緩沖液中37°C消化15分鐘，加入適量FBS終止消化。再將組織塊和細胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細胞懸液加入到離心管中IOOOrpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10% FBS的PBS緩沖液重懸細胞。然后用密度梯度離心法分離收集單個核細胞，PBS緩沖液洗滌單個核細胞后用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細胞，接種單個核細胞的密度 為每75cm2 (細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)I X IO7單個核細胞共IOml MSC培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時后全量換液去除非貼壁細胞，培養(yǎng)瓶中會有散在的梭型貼壁細胞，加入新鮮MSC培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。10天左右，散在貼壁細胞形成克隆后，用O. 05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化，細胞計數(shù)后，按照3000細胞/cm2進行傳代培養(yǎng)；之后，當細胞達到70%左右融合時消化傳代培養(yǎng)，即得胎盤間充質(zhì)干細胞。此外，在本發(fā)明第一方面方法中，提供了一種胎盤間充質(zhì)干細胞。因此本發(fā)明第二方面提供了一種胎盤間充質(zhì)干細胞。根據(jù)本發(fā)明第二方面的胎盤間充質(zhì)干細胞，其是根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實施方案所述方法獲得的。根據(jù)本發(fā)明第二方面的胎盤間充質(zhì)干細胞，其細胞純度大于95%。在一個實施方案中，所述胎盤間充質(zhì)干細胞經(jīng)3代以上傳代后，細胞純度大于95%。下面對本發(fā)明作進ー步的說明。本發(fā)明所引用的文獻，以及該文獻中所引用的文獻，它們的全部內(nèi)容通過弓I用并入本文。在本發(fā)明中，本發(fā)明任一方面的任一技術方案中，其任一技術特征同樣適用于本發(fā)明的任一方面的任一實施方案，只要它們不會引起矛盾，并且這種相互適用在必要時可以作適當?shù)男薷?。在本發(fā)明中，術語“胎盤間充質(zhì)干細胞”是指來源于胎盤的間充質(zhì)干細胞。因此在本發(fā)明中，特別是涉及本發(fā)明的語境中，術語“胎盤間充質(zhì)干細胞”可以與“胎盤干細胞”、“干細胞”、“間充質(zhì)干細胞”互換使用，除非另有明確指明。在本發(fā)明中，術語“PBS緩沖液”或者“PBS”是指磷酸鹽緩沖液。本領域技術人員熟知在本發(fā)明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它們的一般性質(zhì)例如pH值或pH范圍。在本發(fā)明中，術語“胎盤”是指新生兒胎盤，特別是指產(chǎn)后4小時之內(nèi)的胎盤。在本發(fā)明中，術語“MSC培養(yǎng)基”是指間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基。本發(fā)明的發(fā)明人曾利用灌流法從胎盤中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，獲得了純度很高的間充質(zhì)干細胞。但是經(jīng)過灌流后仍然會有大量干細胞滯留在胎盤組織中，不能有效地被分離出來。因此可以認為，采用灌流法不能最大限度的得到間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明公開了ー種從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細胞的方法，并利用這種方法保存胎盤間充質(zhì)干細胞并建立胎盤干細胞庫。本發(fā)明的發(fā)明人在總結以往分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的基礎上，利用多種組織消化酶混合消化胎盤小葉組織塊，結合貼壁培養(yǎng)法，成功自胎盤中分離得到大量間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明方法得到的間充質(zhì)干細胞純度高、數(shù)量多，具有與 骨髄間充質(zhì)干細胞相同的生物學特性，能向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等分化。由于胎盤中干細胞較成體干細胞幼稚，含量豐富，在臨床上具有廣泛的應用前景，我們運用常規(guī)的細胞凍存方法將間充質(zhì)干細胞像臍血一樣凍存起來，建立胎盤干細胞庫，為以后干細胞的深入研究和臨床治療奠定基礎。由于臍血中含有豐富的造血干細胞，人們建立臍血庫把臍血造血干細胞這一重要的生物資源儲存起來，為多種血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病提供一種治療手段。同樣胎盤間充質(zhì)干細胞作為ー種更加重要的干細胞資源，我們運用常規(guī)的細胞凍存方法將其冷凍在-196攝氏度的深低溫液氮中長期保存，建立胎盤干細胞庫，為日后的干細胞治療保存種子。本發(fā)明的目的是提供一種實用簡單的從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細胞并建立胎盤干細胞庫的方法，包括如下步驟在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。再將胎盤小葉剪成Icm3 大小的組織塊，加入含有多種組織消化酶的的PBS緩沖液在37°C孵育15分鐘，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時用注射器研磨。收集過濾后的液體用密度梯度離心法分離單個核細胞，洗滌后用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細胞放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待散在細胞形成克隆后，將各克隆細胞挑出用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，細胞80 90%融合后，用胰酶消化傳代，將傳代后的細胞于液氮中凍存并記錄相關胎兒信息，并進行細胞的生物學特性及多向分化潛能鑒定，以及對細胞進行分子遺傳學診斷，保存細胞的所有相關數(shù)據(jù)，建立胎盤干細胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細胞進行關聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的方法，例如根據(jù)本發(fā)明實施例1、2的方法，ー個重量為750克的胎盤可以分得8 X IO9單個核細胞，經(jīng)過貼壁培養(yǎng)平均I X IO6單個核細胞中可以獲得12個克隆，鑒定后平均有3個克隆具有間充質(zhì)干細胞的特性，即750g胎盤中可分得24000個間充質(zhì)干細胞。這些干細胞經(jīng)過體外短期培養(yǎng)可以很快達到細胞生物學實驗以及臨床治療所需數(shù)量。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，按照CN1548529A中實施例一的方法，ー個重量為750克的胎盤大約可分離得到3000個間充質(zhì)干細胞，經(jīng)3代傳代后，細胞純度大于約為95%。在本發(fā)明ー個實施方案中，在步驟(b)中所述PBS緩沖液中包含約O. lmg/mL dispase、約O. 25mg/mL胰酶、約O. 25mg/mL DNase I、約lmg/mL膠原酶IV、和約lmg/mL透明質(zhì)酸酶；本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該PBS緩沖液中的5種酶，缺少任一種或多種時，間充質(zhì)干細胞收率和細胞純度均遠遠達不到上述750g胎盤中可分得24000個間充質(zhì)干細胞的結果；此外，5種酶的濃度作適當變化，特別是在低于上述各自濃度的50%或者高于上述各自濃度的200%吋，間充質(zhì)干細胞收率和細胞純度均明顯比上述750g胎盤中可分得24000個間充質(zhì)干細胞的結果差；例如當PBS緩沖液中的dispase濃度為O. 04mg/mL (低于本發(fā)明上述濃度的50% )或者為O. 25mg/mL (高于本發(fā)明上述濃度的200% )吋，750g胎盤中約可分得8000個間充質(zhì)干細胞且細胞低度低于90%。因此，本發(fā)明的一個實施方案是在步驟(b)中，所述PBS緩沖液中包含O. 05 O. 2mg/mL dispase、?！?125 O. 5mg/mL 膜酶、O. 125 O. 5mg/mL DNase I、O. 5 2mg/mL 膠原酶IV、和O. 5 2mg/mL透明質(zhì)酸酶。本發(fā)明操作簡單，方便實用，能得到大量的間充質(zhì)干細胞，分化性能好，具有向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞等細胞分化的能力。與現(xiàn)有方法的比較目前MSC主要采用手術法抽取供者骨髓或灌流法分離胎盤，貼壁培養(yǎng)獲得。該法分得細胞數(shù)量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本發(fā)明成功自胎盤中分離獲得大量純度較高的間充質(zhì)干細胞，并運用此法建立胎盤干細胞庫來儲備這種極具應用前景的干細胞。該法簡便易行，且由于胎盤與臍血一祥，細胞成份較幼稚，來源廣泛，方便易得，因此本發(fā)明的方法在干細胞的臨床應用上將具有廣泛的前景。


圖I為顯微鏡下對細胞生長的形態(tài)學觀察。其中A為培養(yǎng)3天后可見散在的貼壁細胞；B為7 10天形成克??；C為經(jīng)篩選克隆形成致密貼壁細胞；D、E、F為瑞氏姬姆薩染色。圖2為流式細胞術鑒定MSC表面標志結果。各圖中縱坐標“counts”表示計數(shù)量。圖3為胎盤MSC細胞周期的分析結果。其中，P3為培養(yǎng)第三代細胞的DNA含量，分析細胞周期，可見大部分細胞處于靜止期(GノG1期 ，96. 66%)，極少細胞處于増殖期(S期，3. 25% )0 P6為培養(yǎng)第六代的細胞的DNA含量，分析細胞周期，可見大部分細胞處于靜止期(GcZG1期，96. 35% )，極少細胞處于増殖期(S期，2. 54% )。各圖中縱坐標“counts”表示計數(shù)量，橫坐標標“DNA Content”表示DNA含量。圖4為胎盤MSC細胞生長曲線圖。圖5為胎盤MSC多向分化潛能鑒定的成骨誘導細胞圖。圖6為胎盤MSC多向分化潛能鑒定的成脂肪誘導細胞圖。圖7為胎盤MSC多向分化潛能鑒定的成軟骨誘導細胞圖。圖8為RT-PCR檢測胎盤MSC多向分化潛能的電泳照片。
具體實施例方式通過下面的實施例可以對本發(fā)明進行進ー步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例。本領域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細的描述。實施例I、胎盤MSC的分離在產(chǎn)后四小時之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10%體積FBS的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成Icm3大小的組織塊，加入到含有 O. lmg/mL dispase、0. 25mg/mL 膜酶、O. 25mg/mL DNase I、lmg/mL 膠原酶 IV、lmg/mL透明質(zhì)酸酶的PBS緩沖液中37°C消化15分鐘，加入適量FBS終止消化。再將組織塊和細胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細胞懸液加入到離心管中IOOOrpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10% FBS的PBS緩沖液重懸細胞。然后用密度梯度離心法分離收集單個核細胞，PBS緩沖液洗滌單個核細胞后用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細胞，接種單個核細胞的密度為每75cm2(細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)IX IO7單個核細胞共IOml MSC培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時后全量換液，去除非貼壁細胞，培養(yǎng)瓶中會有散在的梭型貼壁細胞，再加入新鮮MSC培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
_0] 實施例2、胎盤MSC的傳代培養(yǎng)及其凍存在約10天后，待散在貼壁細胞形成克隆后，用O. 05%胰蛋白酶/2mMEDTA消化，細胞計數(shù)后，按照3000細胞/cm2進行傳代培養(yǎng)。之后，當細胞達到70%左右融合時消化傳代培養(yǎng)。消化后取3 X IO6細胞加入到Iml細胞凍存液(含50%低糖DMEM培養(yǎng)液、40% FBS、10%ニ甲基亞砜)中，經(jīng)過程序降溫最后進入到液氮管中凍存。實施例3、胎盤MSC的生物學特性鑒定I、細胞生長及其形態(tài)學特點 通過實施例I和實施例2的分離培養(yǎng)，胎盤單個核細胞培養(yǎng)72小時后在顯微鏡下可明顯見到梭形貼壁細胞(圖1A)，10天左右會形成渦輪狀細胞克隆(圖1B、圖1D)，消化傳代后會形成80%左右融合的貼壁層(圖1C、圖1E、圖1F)。培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)這種細胞形態(tài)相對均一，増殖速度快，貼壁速度快，易被胰酶消化，傳代至15代以上，其形態(tài)及生長特點亦無明顯改變。2、流式細朐術鑒定MSC表面標志分別取第3、6、9、12、15代細胞，流式細胞術檢測細胞表面標志，動態(tài)觀察培養(yǎng)過程中細胞表面標志的變化。消化收集細胞，計數(shù)后取8X IO6個細胞，分裝16管；PBS洗一次，1500rpm離心IOmin ;棄上清，殘留100 200 μ 1，吹打混勻細胞；加入PE標記的⑶14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD54、CD73、CD80、CD86、CD166 抗體以及 FITC 標記的 CD45、CD105、HLA-ABC, HLA-DR、UEA-I抗體各10 μ 1，并設一管為空白對照；在4°C下，避光反應30min ；PBS洗一次，1500rpm離心IOmin ;直接標記的細胞棄上清，加入200 μ I PBS吹打混勻細胞，200 μ I的1%多聚甲醛固定，置4°C待測，3天內(nèi)上流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測細胞的表面標志，動態(tài)觀察第3、6、9、12、15代的細胞，無明顯改變。不表達造血細胞表面標志即⑶14、⑶31、⑶34 (HSPC及內(nèi)皮細胞陽性)、⑶45 (白細胞陽性)、CD54 (ICAM-I)、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、HLA-DR(MHC-II 類分子)持續(xù)陰性，CD29 和⑶44 (纖維蛋白和透明脂酸鹽的受體，基質(zhì)細胞表達)、⑶73 (即SH-3、4)、⑶105 (即SH-2)、CD166 (間充質(zhì)細胞表達)、HLA-ABC (MHC-I類分子)和UEA-I (內(nèi)皮細胞的表面標志)持續(xù)為陽性。經(jīng)3代以上傳代后，細胞成分均一，純度在95%以上。(圖2)3、流式細胞術檢測胎盤MSC的細胞周期細胞長至80%左右融合時，消化收集細胞約I X IO6個，PBS洗一次，加入70%的こ醇固定，4°C待測。檢測時，先離心去こ醇，再用PBS洗一次，加入RNase I 500u，37°C反應30min，PBS洗一次，加入碘化丙啶(PI，終濃度50 μ g/ml) 1ml，室溫避光反應20min，上機檢
測細胞DNA含量。經(jīng)測定第3代和第6代細胞的DNA含量，細胞周期分析，G0ZG1期、S期和G2M期所占比例分別為96. 35%,96. 66%, I. 11%>0. 09%，和2. 54%,3. 25%。結果表明體外培養(yǎng)的細胞具有典型的干細胞增殖特點，即只有少數(shù)細胞處于活躍的増殖期(I. 11%>0. 09% ),大部分的細胞處于靜息期(96. 35%>96. 66% ) ο (圖3)4、胎盤MSC牛長曲線的繪制及對數(shù)牛長期倍增時間的測定取對數(shù)生長期細胞，消化計數(shù)，以10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基制成細胞懸液(2 X 104/ml), 24孔板中每孔接種O. 5ml,37°C,5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。每天取3復孔，臺盼藍染色后計數(shù)活細胞數(shù)，計算平均值，連續(xù)觀察7天。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸，繪制細胞生長曲線。以Patterson公式計算細胞在對數(shù)生長期的倍增時間，即Td = Tlg2/ Lg(Nt/No)，Td :倍增時間(h)，T :細胞由No增至Nt所用的時間(h)，N :細胞數(shù)。
通過每天細胞計數(shù)的結果繪制細胞生長曲線，計算倍増時間。由細胞生長曲線可以看出，細胞在第2-4天處于指數(shù)生長期。根據(jù)公式計算出第5代細胞在指數(shù)生長期的倍增時間分別為22. 6h。(圖4)5、胎盤MSC多向分化潛能的鑒定(I)成骨誘導3代以上MSC，按1父105/孔接種六孔板，放于37で、5% CO2、飽和濕度下，MSC培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，換用含10%經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG并加入地塞米松O. I μ Μ、抗壞血酸磷酸鹽50 μ Μ、β-磷酸甘油10mM，放于37°C、5% CO2、在飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，共誘導2-4周。堿性磷酸酶染色鑒定成骨細胞形成，Von Kossa染色鑒定骨結節(jié)形成。
在含10%經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松O. I μ Μ、抗壞血酸磷酸鹽50 μ Μ、β -磷酸甘油IOmM培養(yǎng)I周，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，由紡錘形的成纖維細胞樣變?yōu)槎嘟切?，類似于神?jīng)元細胞樣，細胞周邊出現(xiàn)長絲狀突出，并可向周圍延伸。繼續(xù)培養(yǎng)2周以上后，細胞基質(zhì)中出現(xiàn)鈣化斑，礦化物逐漸出現(xiàn)，并且開始形成多層小結結構，至培養(yǎng)4周后，可見明顯鈣化結節(jié)。2周時堿性磷酸酶染色呈強陽性反應，達到95%以上，而未加以誘導的對照組則大部分為陰性，只有不到5%顯示為弱陽性，表明細胞已向成骨細胞轉化。vonKossa染色可將骨結節(jié)中沉積的鈣染成黑色，誘導組可見大量的黒色骨結節(jié)，有明顯的立體結構，而對照組在任何時間都沒有陽性反應。(圖5)(2)成脂肪i秀導3代以上MSC，按1父105/孔接種于六孔板，放于37で、5% CO2、飽和濕度下，在MSC培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，換用含10%經(jīng)篩選FBS的高糖DMEM，并加入地塞米松I μ Μ、消炎痛60 μ M、IBMX O. 5mM、胰島素5μ g/ml，放于37°C，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，共誘導2周，油紅染色鑒定脂滴形成。在含10 %經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松I μ Μ、消炎痛200 μ M、IBMXO. 5mM、胰島素10 μ g/ml培養(yǎng)3天，細胞即發(fā)生形態(tài)改變，由紡錘形的成纖維細胞樣逐漸收縮變短，90%以上細胞成為立方形或多角形；連續(xù)培養(yǎng)7天，鏡下可見細胞內(nèi)有微小脂滴出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，脂滴逐漸增大并融合，至培養(yǎng)2周時，可見融合成團的脂滴充滿整個細胞。油紅O染色可見細胞內(nèi)產(chǎn)生的脂肪被特異性染成紅色。(圖6)(3)成軟骨誘導3代以上細胞，按照每管2X IO5細胞分裝到15ml聚丙烯離心管，低速離心使細胞在試管中形成微團，在含2. 5% FBS的DMEM-HG中加入胰島素、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉各6. 25 μ g/ml, BSA I. 25 μ g/ml,丙麗酸納 ImM/L,抗壞血酸憐酸 37. 5 μ g/ml, TGF- β pOng/ml，放于37°C、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)2周。誘導2周后將細胞微團打散涂片，阿辛藍(Alcian blue)染色可見II型膠原形成細胞外基質(zhì)呈藍色，對照組無藍染。(圖7)6、RT-PCR檢測胎盤MSC多向分化潛能收集誘導后的細胞，應用Trizol試劑提取細胞總RNA，以之為模板進行RT-PCR，反轉錄以及PCR操作按照RT-PCR試劑盒說明書進行，引物序列如表I所示。表I. RT-PCR引物序列及其特異性名稱引物序列(5’-3，)PCR產(chǎn)物大小特異性
骨橋蛋白上游TGAGCTTTCTTACATTCCACC169bp成骨細胞特異
(Osteopontin)下游CTTACTTGGAAGGGTCTCT性胞外基質(zhì)
PPAR-Y2上游TGTCAGTACTGTCGGTTTC241bp脂肪細胞特異
下游AATGGTGATTTGTCTGTTG性轉錄因子
肢原II上游AGTGGAGACTACTGGATTGA394bp軟骨細胞特異
(Collagen II)下游AGTGTACGTGAACCTGCTAT性胞外基質(zhì)
ガ2-微球蛋白上游CTCGCGCTACTCrCrCrCTCnTCrGG335bpPCR內(nèi)部參考
{fl2-Microglobulin)下游GCTTACATGTCrCGATCCCACITAA圖8中，從左至右分別為胎盤MSC細胞、誘導成為脂肪細胞、誘導為成骨細胞、誘導為軟骨細胞的RT-PCR電泳照片，其中從左至右，Normal泳道為誘導前細胞基因表達情況，Adipogenic泳道、Osteogenic泳道、Chondrogenic泳道為誘導后細胞基因表達情況。結果表明，體外誘導后細胞能表達系列特異性mRNA :成脂肪誘導后細胞表達PPAR-Y，成骨誘導后細胞表達骨橋蛋白(Osteopontin)，成軟骨誘導后細胞表達膠原II (Collagen II)，說明所得到的MSC細胞具有成骨、成脂肪、成軟骨分化能力，符合公認的MSC標準。通過以上一系列數(shù)據(jù)指標的檢測，顯示出應用本發(fā)明方法分離得到的MSC，具有向成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞分化的能力，證實本發(fā)明方法獲得的MSC具有干細胞特性。實施例4、胎盤干細胞庫的津立I、細胞活件的檢測利用臺盼藍染色法計數(shù)凍存前后活細胞的數(shù)目。2、細胞污染的檢測利用少量細胞培養(yǎng)，檢測細胞是否受到真菌和細菌的污染。利用病原學方法，檢測細胞是否受到こ肝兩對半、丙肝、艾滋、巨細胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg, HbsAb, HBcAb,HbeAg, HbeAb, HCVAb, HIV_l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST 感染。3、遺傳病的檢測 利用分子遺傳學的方法，檢測凍存細胞是否存在遺傳病。4、HLA-ABC/DR 配型檢測細胞HLA-ABC/DR表型，并記錄在案。5、細胞來源的調(diào)杳記錄胎兒及其父母的詳細資料，并記錄在案。6、胎盤干細胞數(shù)據(jù)庫的津立在保存正常的胎盤干細胞后，建立胎盤干細胞的數(shù)據(jù)庫，其中包括前六項資料，并建立與凍存細胞的關聯(lián)。
權利要求
1.從胎盤中分離間充質(zhì)干細胞的方法，該方法包括以下步驟 (a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液； (b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的PBS緩沖液，再在37°C孵育消化； (c)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時研磨以促使過濾； (d)將收集的過濾液離心，分離單個核細胞，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細胞，然后在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (e)待散在細胞形成克隆后，挑取各克隆細胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細胞； 以及任選的下列一個或多個步驟 (f)針對步驟(e)所得胎盤間充質(zhì)干細胞，檢測以下項目的至少一項細胞活性、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型； (g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細胞于液氮中凍存； (h)建立包含以上信息的胎盤干細胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(g)的凍存細胞進行關聯(lián)。
2.根據(jù)權利要求I的方法，其中所述步驟(a)是在產(chǎn)后四小時之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10%體積胎牛血清(FBS)的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。
3.根據(jù)權利要求I的方法，其中所述步驟(b)中的組織消化酶是選自下列的一種或多種dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I (DNase I)、膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶。
4.根據(jù)權利要求I的方法，在步驟(b)中，在37°C孵育10 30分鐘，優(yōu)選10 20分鐘，例如10分鐘、15分鐘或20分鐘。
5.根據(jù)權利要求I的方法，在步驟(d)中，所述MSC培養(yǎng)基是含10%FBS的PBS緩沖液。
6.根據(jù)權利要求I的方法，在步驟(e)中，待散在細胞形成克隆后，挑取各克隆細胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細胞60 90%融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細胞。
7.根據(jù)權利要求I的方法，在步驟(f)中，所述細胞污染檢測是利用病原學方法，檢測細胞是否受到選自下列的一項或多項的感染乙肝兩對半、丙肝、艾滋病毒、巨細胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg, HbsAb, HBcAb, HbeAg, HbeAb, HCVAb, HIV_l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST。
8.根據(jù)權利要求I的方法，在步驟(h)中，所述數(shù)據(jù)庫中包括與所保存的細胞所有相關的數(shù)據(jù)，包括細胞的生物學特性檢測結果、多向分化潛能鑒定結果、細胞分子遺傳學診斷結果、胎兒及其父母的詳細資料。
9.根據(jù)權利要求I至9任一項的方法，其中所獲得的胎盤間充質(zhì)干細胞的細胞純度大于 95 %。
10.一種胎盤間充質(zhì)干細胞，其是根據(jù)權利要求1-9任一項的方法獲得的。
全文摘要
本發(fā)明涉及從胎盤中分離間充質(zhì)干細胞的方法。所述方法包括(a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的PBS緩沖液，再在37℃孵育消化；(c)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時研磨以促使過濾；(d)將收集的過濾液離心，分離單個核細胞，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細胞，然后在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(e)待散在細胞形成克隆后，挑取各克隆細胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細胞。通過本發(fā)明方法可以獲得高純度的胎盤間充質(zhì)干細胞。
文檔編號C12N5/0735GK102676451SQ201210044648
公開日2012年9月19日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權日2011年9月5日
發(fā)明者張毅, 李詣書, 許曉椿, 陳俊峯, 霍思維 申請人:博雅干細胞科技有限公司